脑缺血模型制作
脑缺血动物模型的制作目 录一、简介二、前言三、脑缺血动物模型的分类四、脑缺血动物模型的制作1. 仪器和设备2. 四血管结扎全脑缺血模型3. 大脑中动脉结扎模型4. 光化学脑梗塞动物模型5. 自发性高血压鼠的脑卒中模型6. 血管内栓线技术的局灶脑缺血模型五、脑缺血模型的测量指标六、影响脑缺血损害的相关因素1. 脑缺血的程度2. 体温和脑温3. 麻醉4. 血液因素和其它七、参考文献一、简介一个生理上可控的和可复制的脑缺血动物模型是研究其病理机制和试验新的疗法所必需的。本节介绍脑缺血动物模型的制作方法。首先介绍脑缺血动物模型的分类,然后分别介绍几种常用脑缺血模型的制作,包括四血管结扎全脑缺血模型、大脑中动脉结扎和光化学梗塞局部脑缺血模型等。同时,结合模型的应用,介绍缺血模型的测量指标和相关影响因素。二、前言脑血管疾病是导致我国中老年人死亡的第一号疾病,也是世界性卫生战略研究重点之一。在脑血管疾病中以缺血性疾病的发病率占据首位。通常在轻度缺血/缺氧的情况,脑的补偿机制保护着中枢神经系统免受损伤,但当缺血程度加重时,便会发生不可逆的神经损害,导致系列的临床症状,甚至死亡。临床上,脑血管意外、心肌梗塞、休克、新生儿窒息和脑外伤都可引起神经元的缺血性损害。因此积极探讨脑缺血的损害机制及防治措施,具有重要的科学意义[1]。一个生理上可控的和可复制的动物模型对于系统地、全面地研究脑缺血的病理生理过程和试验新的治疗方法是非常必要的。首先,尽管临床上脑缺血的发病率很高,可以提供较多的病例。但是,人类脑缺血是非常多样性的,其表现形势、病因和缺血区的解剖学定位,有着很大的不同。这种多样性防碍了进行统计学分析和设置对照的可能性。其次,精确的组织病理学分析、生物化学和生理学研究、常常需要侵入性的外科程序和直接的脑组织取样分析。第三,发生在缺血性脑损伤早期事件的观察(几分钟甚至几秒钟),只能在实验动物身上才能做到。最后,由于缺血是一种供血异常,血管因素在其中发挥了重要作用,而血管因素的改变无法用组织细胞培养或脑片孵育的方法来模拟。由于上述理由,制作脑缺血动物模型在脑缺血损伤机制和药物治疗的研究中占居非常重要的地位。实验性脑缺血动物模型是在实验动物身上模拟人类脑组织缺血造成的病理生理改变,是研究缺血性脑损伤不可缺少的手段,不但可以揭示脑缺
血损伤的病理生理机制,还可以为试验和判断新的疗法和药物的治疗提供试验对象。三、脑缺血动物模型的分类如前所述,临床上脑缺血的表现有多种不同的形式,其病因也多种多样,单一的动物模型不可能同时模拟不同的脑缺血疾病。因此,根据实验所要解决的问题,已研究和制作了不同类型的脑缺血动物模型。通常,根据缺血的范围、损伤的形式,脑缺血模型可以分为多种类型。根据缺血的范围,可分为弥慢性全脑缺血模型和局灶性脑缺血模型;根据缺血程度,可分为完全性脑缺血和不完全性脑缺血模型;根据缺血的时间,又可分为短暂性缺血和永久性脑缺血模型,短暂性脑缺血又可进一步分为一次性短暂脑缺血和多次性短暂脑缺血模型。此外,根据血流恢复的情况,还有缺血再灌流模型。表1 脑缺血动物模型的分类[2]───────────────────────────────────────弥漫性脑缺血模型(Globe cerebral ischemia)1. 二血管结扎的前脑缺血模型(一过性结扎双侧CCA+低血压)2. 四血管结扎全脑缺血模型(一过性结扎双侧CCA+永久性椎动脉闭塞)3. 脑内压升高的脑缺血模型(1)双侧半球前脑压缩性缺血(2)单侧半球前脑压缩性缺血4. 低氧-缺血模型局灶性脑缺血模型(focal cerebral ischemia)1. 大脑中动脉闭塞模型2. 自发性高血压大鼠的脑梗塞3. 光化学诱导的局灶脑缺血模型4. 血管内栓线技术的局灶脑缺血模型5. 脑血栓和栓塞的混合模型(1)血凝块栓塞(2)微球栓塞(3)光化学启动的血栓栓塞(4)花生四烯酸诱导的血栓栓塞沙土鼠的脑缺血模型(ischemia in gerbil)1. 双侧CCA结扎模型2. 单侧CCA结扎模型───────────────────────────────────────四、脑缺血模型的制作制作脑缺血动物模型的方法很多,但常用方法主要有结扎法和栓塞法两种,结扎法是运用外科手段结扎脑的供血动脉,中止脑的血氧供应,它可以进一步分为颅内结扎和颅外结扎。颅外结扎主要是用于制作全脑缺血模型,可进一步分为①4血管结扎,即结扎颈总动脉/颈内动脉和椎动脉;②2血管结扎,即结扎两侧颈总/颈内动脉,同时抽取动物一定量的血液,使血压降低到50mmHg以下,达到造成全脑缺血的目的。这种方法因为需要监视和控制血压,实验条件要求严格,且因椎动脉未予结扎,往往造成的脑缺血是不完全的。另一种两血管结扎法是用沙土鼠(Gerbil)进行,利用沙土鼠脑底Willis动
脉环发育不全后交通动脉缺如的特点,结扎两侧的颈总或颈内动脉造成前脑缺血。栓塞法是用自体血凝块、塑料或玻璃微球来栓塞实验动物颈动脉、脑内大动脉或微动脉,造成脑组织缺血模型,该法简便易行,但可控性、可重复性差,且不能再灌流。1. 实验动物实验动物的选择对脑缺血模型是非常重要的,理论上兔、猫、狗和灵长类都可被用来制作脑缺血模型,但更多的人倾向于选择使用鼠作实验。这主要是基于如下认识:因为鼠是小动物,价格便宜,躯体小,消耗药品试剂较少;鼠的脑血管解剖和生理与高级动物无明显差异;一些在体的实验操作更容易进行,甚至在伦理学上更容易接受等等。因此,本节将以鼠类的脑缺血模型为主加以介绍[3]。2. 仪器和设备制作脑缺血动物模型的仪器设备分为二类:一类是为动物手术服务,包括一套手术器械,手术显微镜,颅钻,脑立体定位仪,温度控制装置(控温仪、红外线灯和加热垫),呼吸机;另一类是用于监测和分析的仪器,包括脑电记录装置,血压记录装置,多谱勒血流记录仪,血气血糖分析仪。3. 四血管结扎脑缺血模型的制作这是一个广泛应用的脑缺血模型。最常用的为Pulsinelli的改良方法[2,4]。该模型选用Wistar大鼠,可以在清醒和自由运动状态下制作严重的脑缺血和恒定的病理学改变。该模型分二个阶段制作,第一阶段:将动物麻醉,按置在脑立体定位仪上,调节耳杆和门齿高度使鼠头前倾约30度,同时用橡皮栓住鼠尾给以轻度的牵拉力,使颈椎伸直,翼孔呈水平位,便于观察。枕骨下第一颈椎水平正中切口,仔细分离两侧第一颈椎横突,暴露第一颈椎横突上的翼孔,翼孔下有两则椎动脉通过,用小的单极或双极电凝器插入翼孔烧灼闭塞双侧椎动脉。然后动物取背位,颈部正中切口,分离颈动脉鞘,注意不要损伤迷走神经和颈动脉鞘后方的颈交感干。用外科缝线套住两侧颈总动脉(不要结扎),将线头藏于皮下,简单关闭切口;第二阶段:待动物麻醉清醒后自由饮水,但禁食12~24小时后,将动物于清醒状态下,取背位,分别用绳子固定四肢和门齿,以控制动物挣扎。小心分离颈前部的切口,辩认套在颈总动脉上的缝线,轻轻牵起,将线套收紧或者用微血管夹夹闭双侧颈总动脉。此时在2~3秒钟内大鼠将昏迷并丧失对光反射。缺血后2~3分钟可出现异常脑电图,并持续到缺血结束。颈总动脉的关闭时间根据实验设计而定,通常取10~20分钟。昏迷和反射消失是缺血是否成功的标志。据统计约有四分之三的大鼠经上述二阶段处理可导致缺血成功。缺血期间自
主呼吸和角膜反射的存在提示脑干血液供应的存在,这是因为脊髓前动脉供血的原因。缺血结束后松开颈总动脉,动物通常很快清醒。但在24~72小时内将有一部分动物出现缺血性抽搐,如果缺血持续30分钟,在24小时内将有20%、72小时有40%的鼠发生缺血性抽搐,这些发生抽搐的鼠在结果分析时应被排除。约有四分之一的鼠缺血不成功,其中2/3是昏迷不完全,另外1/3死于呼吸衰竭。该模型的制作的关键是烧灼椎动脉,由于椎动脉不能直接看到,这就需要操作者具有一定的经验,适当的掌握烧灼的时间和电极与翼孔的角度,同时要避免损伤脑干。4. 大脑中动脉结扎模型的制作结扎大脑中动脉(MCA)是制作局灶性脑缺血模型的常用方法,早期大多用较大的实验动物(猫、狗)制作,近年来用大鼠制作的大脑中动脉结扎模型已被大家接受并得到广泛的应用。目前比较标准的模型是Tamura 1981年报道的方法[5]。他们于近侧段结扎SD大鼠的大脑中动脉,并详细比较了结扎后脑血流改变和组织病理学,结果发现结扎后4小时产生较为恒定的纹状体和皮质损害的脑血流(CBF)阈值是25ml/100g/min,这一阈值明显较猫、猴要高。具体操作程序是:动物麻醉下,头皮切口,分离颞肌,取外眦和外耳门连线的中点,用牙科钻或环形颅钻钻开颅骨、暴露大脑中动脉,于手术显微镜下辩认大脑中动脉及其分枝,在分枝的下方即MCA的近段,分离结扎或烧灼MCA,同时取颈部切口分离结扎同侧的颈总动脉(图1)。在分离结扎或烧灼MCA时,应避免损伤附近的脑组织,通常用钝头的直角钩子固定于定位仪上,操纵定位仪旋钮,轻轻地将MCA提起,然后烧灼或结扎。该模型操作的关键有两点:(1)精确的定位结扎部位,一定要在MCA的豆纹动脉分枝的下方,如果在其上方结扎将很少出现皮质和基底节梗塞灶。但是在实验操作时往往不能辩认出MCA的分支,此时可以嗅沟为标志,在其以下进行结扎;(2)同侧颈总动脉的永久结扎,能够加重MCA供血区的缺血程度,是恒定的脑梗塞出现的必要条件,有时甚至配以暂时的对侧颈总动脉结扎。图 1图1 大脑中动脉结扎示意图该法的优势是病理生理变化接近人类的MCA栓塞,经改进后也可进行重灌流研究。其缺点是开颅破坏了颅内压的恒定,扰乱了脑脊液循环的动力学,并易致细菌侵入,从而影响组织病理学评价。此外,附着在MCA上交感神经纤维可因结扎或电凝而损伤,使血管的自调节功能受损[6]。5. 光化学脑梗塞动脉模型的制作光化学脑梗塞模型是一种新的局灶性脑缺血动物模型,其机理是其些光敏感染料注入机
体后,在特定波长光波作用下发生光化学反应,产生并释放一些活性物质,如氧自由基等。这些活性物质造成血管内皮细胞损害、血小板粘附、进而发生释放反应,激发血管内凝血过程,导致血栓形成。最常用的光敏染料是玖瑰红B(四碘四氯荧光素二钠,rose bengal),动物麻醉后用脑立体定位仪固定头部,光敏染料经尾静脉注入,数小时后切开头皮,用卤素灯或氙灯为光源,滤除红外及紫外光部分后,直接或经光学纤维传导投照到脑部。光线经过颅骨,对选定的皮质区域照射5~10分钟,局部照射强度为30~40k/x(千勒克斯)。照射数分钟即可见软膜及脑实质的血管内广泛的血小板聚集,血脑屏障破坏和血管源性水肿,血管内膜断裂管径不规则,皮质深层神经元变性,上述病理改变以12~24小时最为严重,实验者可通过调整光束的照射范围、强度、时间和光敏染料的剂量来控制梗塞灶的大小和深度。典型的梗塞灶边缘整齐呈碗状,深入整个皮质并可延及皮质下结构[7]。该模型具有定位准确,手术操作相对简便,避免了开颅和操作血管壁交感神经纤维的缺陷。其不利的方面是微血管损害突出,早期血脑屏障开放和血管源性水肿明显,且不能进行重灌流。6. 自发性高血压鼠的脑卒中模型自发性高血压鼠(spontaneously hypertensive rats,SHR)是遗传性高血压大鼠,有许多品种。最常用的为日本种SHR,由Okamoto[8]从Wistar京都鼠中选择较高血压者经遗传定向选种繁殖而成,该鼠出生后数周开始自发性血压升高,峰值可达26.7kPa (220mmHg)。虽然SHR并不倾向于自发性卒中,但它们对脑血管闭塞较正常大鼠敏感很多。双侧CCA结扎可引起脑血流的明显降落,结扎SHR的大脑中动脉比正常血压大鼠产生更大的皮质梗塞灶[9,10,11]。在SHR基础上培育出的易卒中性高血压大鼠(stroke-prone strain of SHR,SHRSP)其血压更高,峰值可达32~33kPa,自发性脑出血或脑梗寒发生率可达60~80%。其卒中发生的部位主要在前内侧皮质、枕皮质和基底节[12]。SHR和SHRSP的微血管病理学特征包括多灶性血脑屏障开放、血浆蛋白漏出、内皮损伤、血管平滑肌纤维样溃变、基膜增厚和成纤维细胞增殖。虽说结扎SHR和SHRSP鼠大脑中动脉可制作更大和更恒定的梗塞,但它们只代表遗传学上的一个小的群体,与原发性高血压患者的性质有很大差异,且这类鼠来源有限,饲养困难,在国内研究中无法大量开展。7. 血管内栓线技术的局灶缺血模型血管内栓线技术阻断大脑中动脉的方法由小泉[13]和Longa[14]分别报告。该法是在无需开颅的条件下产生局灶性脑梗塞,并且可通过拔出栓线实现血流再通
体后,在特定波长光波作用下发生光化学反应,产生并释放一些活性物质,如氧自由基等。这些活性物质造成血管内皮细胞损害、血小板粘附、进而发生释放反应,激发血管内凝血过程,导致血栓形成。最常用的光敏染料是玖瑰红B(四碘四氯荧光素二钠,rose bengal),动物麻醉后用脑立体定位仪固定头部,光敏染料经尾静脉注入,数小时后切开头皮,用卤素灯或氙灯为光源,滤除红外及紫外光部分后,直接或经光学纤维传导投照到脑部。光线经过颅骨,对选定的皮质区域照射5~10分钟,局部照射强度为30~40k/x(千勒克斯)。照射数分钟即可见软膜及脑实质的血管内广泛的血小板聚集,血脑屏障破坏和血管源性水肿,血管内膜断裂管径不规则,皮质深层神经元变性,上述病理改变以12~24小时最为严重,实验者可通过调整光束的照射范围、强度、时间和光敏染料的剂量来控制梗塞灶的大小和深度。典型的梗塞灶边缘整齐呈碗状,深入整个皮质并可延及皮质下结构[7]。该模型具有定位准确,手术操作相对简便,避免了开颅和操作血管壁交感神经纤维的缺陷。其不利的方面是微血管损害突出,早期血脑屏障开放和血管源性水肿明显,且不能进行重灌流。6. 自发性高血压鼠的脑卒中模型自发性高血压鼠(spontaneously hypertensive rats,SHR)是遗传性高血压大鼠,有许多品种。最常用的为日本种SHR,由Okamoto[8]从Wistar京都鼠中选择较高血压者经遗传定向选种繁殖而成,该鼠出生后数周开始自发性血压升高,峰值可达26.7kPa (220mmHg)。虽然SHR并不倾向于自发性卒中,但它们对脑血管闭塞较正常大鼠敏感很多。双侧CCA结扎可引起脑血流的明显降落,结扎SHR的大脑中动脉比正常血压大鼠产生更大的皮质梗塞灶[9,10,11]。在SHR基础上培育出的易卒中性高血压大鼠(stroke-prone strain of SHR,SHRSP)其血压更高,峰值可达32~33kPa,自发性脑出血或脑梗寒发生率可达60~80%。其卒中发生的部位主要在前内侧皮质、枕皮质和基底节[12]。SHR和SHRSP的微血管病理学特征包括多灶性血脑屏障开放、血浆蛋白漏出、内皮损伤、血管平滑肌纤维样溃变、基膜增厚和成纤维细胞增殖。虽说结扎SHR和SHRSP鼠大脑中动脉可制作更大和更恒定的梗塞,但它们只代表遗传学上的一个小的群体,与原发性高血压患者的性质有很大差异,且这类鼠来源有限,饲养困难,在国内研究中无法大量开展。7. 血管内栓线技术的局灶缺血模型血管内栓线技术阻断大脑中动脉的方法由小泉[13]和Longa[14]分别报告。该法是在无需开颅的条件下产生局灶性脑梗塞,并且可通过拔出栓线实现血流再通
通。具体操作步骤是颈部正中切口,暴露颈总和颈外动脉(图2)。首先,分离结扎颈外动脉的分枝枕动脉、甲状腺上动脉和咽升动脉。然后分离颈内动脉,注意勿损伤邻近的迷走神经和舌下神经绊,小心分离并结扎颈内动脉在颈部的唯一分支翼腭动脉。结扎和切断颈外动脉,用丝线套住颈外动脉的残端,用微血管夹在颈外动脉起始处夹闭颈总动脉。于颈外动脉的残端或由颈总动脉分叉处剌一小口,由此插入4-0号单尼龙线,如果由颈外动脉残端插入尼龙线,应轻轻牵拉颈外动脉残端以增大它于颈内动脉的夹角。轻轻推进尼龙线使之由颈外动脉通过分叉处进入颈内动脉,当缝线在血管内推进时能够看到它到达颅底,此时可感觉到轻微的阻力,这是颅内动脉穿过颅骨时的弯曲,缝线稍作弯曲后并继续伸延。从分叉处开始计算推进尼龙线的长度为17.5mm左右。由于分叉处到大脑中动脉起始处的长度为14mm,这样尼龙线的前端进入了大脑前动脉,从而阻断了大脑中动脉的血液供应。而大脑前动脉可通过前交通动脉获得血流。放开血管夹,收紧颈外动脉残端的丝线,防止出血。拔出尼龙线便可达到血管再通的目的。尼龙线的选择和处理:由血管内树脂灌注技术测量而得知颈内动脉颈部和大脑前动脉近端的内径分别为0.3和0.2mm,所选栓线的直径应为0.2mm为宜。使用前通过加热使尼龙线的前端形成一个小的球形的膨大,使便于推进。有时,将尼龙线在混有硬化剂的硅胶中浸一下以增加尼龙线的硬度。为了防止推进过程中出现凝血,用肝素处理一下尼龙线也是必要的。该模型是近年来颇受重视的局灶脑缺血模型。具有不开颅,不损伤血管的交感神经纤维,又能进行重复灌流研究的优点。最近有人证实[15],不结扎颈内动脉在颈部的分支,翼腭动脉并不影响大脑中动脉的栓塞效果,同时还可减少颈内动脉的血栓形成,从而更有利于重灌流研究。不结扎翼腭动脉也可使手术操作进一步简化。图 2图2 大鼠脑血管解剖和大脑中动脉栓线技术示意图五、脑缺血模型的测量指标用于脑制备评价的测量指标很多,包括行为学、组织病理学、生物化学、生理学和分子生物学。具体地如何选择评价指标要根据实验者的实验设计,根据实验设计者所要试验的假说来决定。一般的指标有死亡率、神经病学缺失、行为学损害、组织病理学损害等等。1. 死亡率是一个比较简便的指标,在研究药物疗效时有一定的作用,但对于脑缺血操作机制的研究所提供的信息非常有限;2. 神经病学缺失的记分方法:这是模拟人类卒中后的临床症状进行评分,但在实际应用
中其指标变异太大且客观性不够,应用受到限制。例如大脑中动脉结扎后是否出现运动损害更多的是决定于缺血是否累及内囊而与梗塞 灶的大小关系不大。常用大脑中动脉结扎后的神经缺失评价为5级记分法:无神经缺失记为0级;对侧前肢不能充分伸直,显示轻度局灶性神经病缺失记为1级;2级为中度局灶性神经损害,动物向对侧、旋转;显示严重的局灶性神经损害为3级,动物倒向对侧;4级损害是不能自发行走,并伴有不同程度的意识障碍;3. 复杂的行为学指标对评价缺血损伤有一定的作用。如逃避反射的跳台试验、Y型迷宫和Morris水迷宫等,但这类指标要求较高,需对研究人员和实验动物进行专门的训练,花费时间较长。许多研究人员选择更为客观的测量指标,如CBF、脑的糖代谢和组织病理学观察。要注意的是这类指标的脑区间的差异较大,需同时进行多参数分析。在上述指标中评价缺血性损害的金标准(gold standard)是组织病理学观察。例如大脑中动脉结扎后,用脑梗塞灶体积的大小、半影区的大小来评价缺血损害的程度。全脑缺血模型鼠海马CA1区锥体细胞丢失的数量,或者纹状体内神经元死亡的数量来评价全脑一过性缺血损害的程度和某些药物的治疗效果。六、影响脑缺血损害的相关因素由于有许多因素可以影响缺血性脑损伤的过程和后果,因此,在制作脑缺血动物模型时应该对这些因素加以考虑并尽可能的加以控制,以保证脑缺血动物模型的成功和结果的恒定。影响脑缺血损害的调节因素主要有:动物的种类、血压、血糖水平、麻醉条件、缺血动物的体温和脑温。1. 脑缺血的程度和时间对脑损伤的影响脑血流减少的程度和持续时间的长短是决定缺血损害的两个最重要的相关变量。一般情况下,引起脑电图(EEG)上缺氧去极化表现的脑缺血持续几分钟就可引起所有动物种类某种程度的脑损害。引起EEG缺氧去极化电位CBF的阈值(ml/100g组织/min)在不同的动物有所不同,通常在大鼠CBF低于正常值的35~40%,大的动物低于25~30%,持续几分钟即可引起缺氧除极化。阈下缺血一般引起的脑损害是可逆的,但这类缺血时间持续过长,也可引起选择性神经元坏死,甚至脑梗塞。因此,脑血流减少的程度和持续时间决定了缺血时脑损害的发展进程和结果(表2)。为了控制动物之间的变异和提高缺血损害的可复制性,缺血动物的CBF和EEG将被监测,EEG可用电生理记录仪,CBF可用激光多谱勒血流计或者氢清除率的方法测定。表2 缺血程度和时间对脑损害的影响──────────────────────────
────缺血时间 缺血程度(%对照CBF)(min) 35~45% <35~40%──────────────────────────────0~30 可逆性功能紊乱 选择性神经元坏死~60 选择性神经元坏死 梗 塞>60 梗 塞 梗 塞──────────────────────────────2. 体温和脑温对缺血性脑损伤的影响缺血和缺血再灌流期间动物的体温或脑温的高低是影响缺血性脑损害程度的另一重要因素。实验证明脑温降低3~4℃,即可明显地减轻缺血性脑损害。反之,人为的增加脑的温度将加重缺血性脑损害。在制作脑缺血模型时,动物的体温/脑温将受诸多因素的影响而发生改变。例如麻醉可使代谢率减低、体温下降;脑缺血本身可使脑组织代谢下降;手术时切开头皮和打开颅骨,使脑的散热加快等都可使脑温降落,从而影响缺血损伤的程度。因此,制作脑缺血模型时,应该监测脑温并设法维持在正常水平。精确的脑温监测是在硬膜下按置温敏电极,许多实验室常用监测直肠温度的方式配合加热垫和红外线灯泡照身来维护动物的体温在37.5℃左右。但应该注意在长时间的缺血期间(>10分钟)直肠的温度不能直接反映脑温,通常要低2~3℃左右。3. 麻醉对缺血性脑损害的影响麻醉剂对缺血模型脑损害的影响是通过影响细胞活动、代谢率、体温和血流来实现的。但各种麻醉剂对上述指标的影响是不同的,例如,halothane和barbiturate主要是抑制中枢神经系统的活动,而Ketamin和氟里昂有时将有中枢“兴奋”作用。barbiturate具有血管收缩作用,减少脑的基础血流。而halothane在低剂量时可扩张血管增加脑血流。由于在制作动物模型时不可避免的要使用麻醉剂,因此,实验者应该熟悉各种麻醉剂对各种生理、生化活动的影响,根据自己的实验需要选择麻醉剂,尽量地减少和控制麻醉对实验结果的负效应。4. 血液因素对脑缺血损害的影响血液因素包括血压、血糖、血粘滞度、血CO2和O2张力。高血糖加重脑缺血损害已被许多实验室所报道,其机制尚不清楚,可能和加重缺血期的无氧孝解和乳酸堆积有关。因此在动物经受缺血手术前一般需禁食,并在缺血期和制作后监测其血糖水平。血CO2和O2分压对缺血后果的影响是直接的。此外动脉灌注压通过其对CBF的影响而对脑缺血后果发挥作用,通常脑灌注压在较广泛的范围内维持CBF相对恒定,但当动脉压下降到一定的程度时(人类50~60mmHg,鼠60~70mmHg),脑血流的自动调节能力将逐渐丧失。
因此,监测血CO2、O2分压和动脉血压都是制作脑缺血动物模型的必要操作程序。实验性脑缺血动物模型的制备是针对缺血性脑血管病提供一个强有力的研究对象,使我们从不同方面增加对缺血的认识。近年来有关脑缺血模型研究和应用的发展趋势是动物小型化(以大鼠或沙土鼠为主),强调缺血损伤的可控性和可重复性,同时严格控制各种干扰因素,尽量避免这些干扰因素对实验结果的影响。七、参考文献1. 姚志彬、邝国璧。脑缺血损害机制和保护的研究进展。脑研究前沿。姚志彬、陈以慈主编,广东科技出版社1995, p223-233.2. Pulsinelli WA and Jacewicz M. Animal models of brain ischemia in stroke: pathophsiology Diagnosis, and Management ed. 1991; p49-67.3. Ginsberg MD and Real Busto BS. Rodent models of cerebral ischemia. Stroke 1989; 20(12):1629-1641.4. Pulsinelli WA and Brierley JB. A new model of biloteral hemispheric ischemia in the unanethetized rat. Stroke 10:267:1979.5. Tamura AA, Graham DI, McCulloch J, et al. Focal cerebral ischemia in the rat: Description of technique and early neuropathological consequences following middle cerebral artery occlusion. J Cereb Blood Flow Metab 1981; 1:55-60.6. Bederson Jb, Pitts LH, Tsuji M, et al. Rat middle cerebral artery occlusion evaluation of the model and development of a neurology evaluation. Stroke 186; 17:472.7. Watson BD, Dietrich WD, Watchel M, et al. Induction of reproducible brain infarction by photochemically initiatied thrombosis. Ann Neurol 1985; 17:497.8. Okamoto K, Yamori Y, Nagaoka A. establishment of the stroke-prone spontaneously hypertensive rat (SHR). Circ Res 1974; 34-35 (suppl):I-143-I153.9. Fujishima M, Ishitsuka Y, Nakatomi Y, et al. Changes in local cerebral blood flow following bilateral carotid occlusion in spontaneously hypertensive and normotensive rats. Stroke 1981; 12:874-876.10. Ogata J, Fujishima M, Morotomi Y, et al. Cerebral infarction following bilateral carotid artery ligation in normotensive and spontaneously hypertensive rats: a patholgoical study. Stroke 1976; 7:54-60.11. Ibayashi S, fujishima M, Sadoshima S, et al. Cerebral blood flow and tissue metabolism in experimental cerebral ischemia of spontaneously hypertensive rats with hyper-, normo-, and hypoglycemia. Stroke 1986; 17:261-266.12. Yamori Y, Hories R, handa H, et al. Pathogenetic similarity of stroke in stroke-prone spontaneously hypertensive rats and humans. Stroke 1976; 7:46-53.13. Shigeno J, Teasdale GM, Mclulloch J, et al. Recirculation model following MCA occlusion in rats. J Neurosurg 1985; 63:272-277.14. Longa EZ, Weinstein PR, Carlson S, et al. Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats. Stroke 1989; 20:84-91.15. 李毅平,张
雅结,罗毅男,等。应用改良的血管内栓线技术制作大鼠局灶脑缺血模型。中国神经精神病杂志1995; 21(2):107.评价改良的大鼠MCAO再灌注模型,为实验研究提供可重复性好、稳定可靠的动物模型。方法 20只SD大鼠随机分为A、B两组,A组用头端烧制成圆球的传统 “圆头线栓”,B组采用头端用万能胶包裹成梭形膨大的改良“梭头线栓”制作大鼠MCAO模型,阻断大脑中动脉血供3h后将“线栓”拔出,造成再灌注损伤。采用“盲法”分别于再灌注10min和再灌注24h对大鼠进行神经功能缺失评分;再灌注24h后处死大鼠,脑切片TTC染色,数码相机照相,采用图像分析系统测量脑梗死体积比;根据统计结果评价改良的MCAO再灌注模型,分析MCAO再灌注后神经功能缺失评分与脑梗死体积比之间的关系。结果 B组大鼠脑梗死体积比大于A组(P<0.01);B组大鼠脑梗死体积比明显较A组稳定,变异系数(coefficient of variation,CV)分别为CVB=0.12,CVA=1.08);再灌注10min和再灌注24h对大鼠进行神经功能缺失评分,B组评分均高于A组(P<0.05);MCAO再灌注模型大鼠神经功能缺失评分与脑梗死体积比的大小成线性相关关系(r=0.873,P<0.01)。结论采用改良的“梭头线栓”制作MCAO再灌注模型,神经功能缺失评分和脑梗死体积比变异度小、稳定性高,是可靠的制模方法;神经功能缺失评分能反映脑梗死的严重程度,可用作评价药物疗效的指标。【关键词】 线栓法;大脑中动脉阻塞再灌注模型;大鼠 An Experimental Study on the Improved Model of MiddleCerebral Artery Occlusion Reperfusion (Department of Human Anatomy, Ningxia Medical College,Yinchuan 750004) Abstract: Objective To evaluate the modified method of suture-embolus by which to establish the model of the middle cerebral artery occlusion(MCAO)and reperfusion in rats on the evaluation of neurobehavioral function and on the volume ratios of brain infarction. Methods Sprague-dawley(SD) rats were marked by group A or B; there were 10 rats in every group. The rats of group A subjected to temporary MCAO with heated round tip suture-embolus; the rats of group B subjected to temporary MCAO with glue-coated shuttled tip suture-embolus. After occlusion for 3 h, the sutures were removed and the brains of rats were reperfused. The neurobehavioral function of rats were evaluated by a person who had known nothing about the group of the rats at 10minutes and 24 h after reperfusion. Then the rats were killed. The brains of the rats were removed and stained with 2, 3, 5-triphenyltetrazolium chloride(TTC), Calculated the infarct volume ratios through the results of TTC by the system of the image analyses. The results were compared between two groups. Results The infarct volumes ratios were significantly higher in rats of group B
B than those of the group A(P<0.01). The infarct volume ratios of the rats of group A was tended to be significantly smaller and more inconsistent than those of group B(coefficient of variation(CV)of the group A is 1.08, CV of the group B is 0.12). There was a significantly liner correlation between the neurobehavioral function and the volume of brain infarction(r=0.873, P<0.01). Conclusion Establishment of the model of MCAO reperfusion using the glue-coated shuttled tip suture-embolus is proved to be a reliable and effective method. The evaluation on the neurobehavioral function can reflex well in the volume of brain infarction. Key words: suture-embolus method; middle cerebral artery occlusion; reperfusion model; rat急性脑梗死(acute cerebral infarction,ACI)的发病率、死亡率、致残率均高,严重威胁着人类的身体健康和生活质量。对于急性脑梗死的实验研究,建立可重复性好,稳定可靠的动物模型非常关键。为了解梗死的演变过程和药物疗效观察,学者们发明了多种大脑中动脉局灶性脑缺血模型,有开颅机械闭塞法[1]、微栓子栓塞阻断法[2]、化学刺激诱导血栓性闭塞法[3]、光化学诱导血栓形成法[4]、血管内栓线阻塞法[5]等。其中由Koizumi[6-7]报道的采用颈内动脉插线的方法制成可实现再灌注的大脑中动脉阻塞模型,因其勿需开颅、创伤小、可实现再灌注和更接近人类急性脑梗死经药物溶栓后血管再通的病变过程,引起学者们的关注。Longa[5]等1989年报道,将线栓的头端烧成光滑的圆球对模型改进,被广大学者采用。但模型制作中选用“线栓”的粗细以及“线栓”头端的形状、大小等方面没有可靠的标准,导致模型制作中存在成功率、梗死体积等方面的差异而影响了实验结果。本实验是对Longa[5]法进行改良,制作SD大鼠MCAO再灌注模型,并对其稳定性、可靠性进行评价。 1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 实验动物及分组 成年SD大鼠20只,雌性,体重(280±10)g。大鼠随机分为A、B两组:A组普通“圆头线栓”组,Longa[5]法,B组改良“梭头线栓”组。 1.1.2 主要仪器、试剂和材料 手术显微镜、显微手术器械、数码照相机、计算机图象分析系统、螺旋测微器、游标卡尺;氯化三苯基四氮唑(tripenylteazolium chloride,TTC)、Na2HPO4·12H2O、NaH2PO4·2H2O、氯化钠、多聚甲醛、肝素、水合氯醛;溪流牌渔线、哥俩好牌万能胶。 1.2 方法 1.2.1 “线栓”的制备 1)普通“圆头线栓”的制备 将直径为0.2mm渔线切成5cm长的线段,加热拉直,一端烧烤成圆球状膨大,手术显微镜下用螺旋测微器测量选取圆球直径为0.3mm的线栓,并用记号笔在距膨大端0.8、
1.8 cm处做标记(图1,见封2)。75%酒精消毒后放入肝素化生理盐水中备用。 2)改良“梭头线栓”的制备 选头端切割整齐的线段,一端4mm长段伸入万能胶中挂胶少量,挂胶端垂直向下悬空室温放置24h,完全晾干后再挂胶一次,室温放置24h晾干,手术显微镜下选取头端成光滑梭形的线段(梭形头长4mm,最大直径0.3mm),并用记号笔在距膨大端0.8、1.8 cm处做标记(图1,见封2)。75%酒精消毒后放入肝素化生理盐水中备用。 1.2.2 MCAO再灌注模型的制备 SD大鼠腹膜腔注射3.5%水合氯醛(350mg/kg)麻醉后,仰卧位固定于手术台上,颈部剪毛,消毒,正中线左侧3~5mm做纵行切口,暴露左侧颈总动脉(common carotid artery,CCA)、颈外动脉(external carotid artery,ECA)、颈内动脉(internal carotid artery,ICA),结扎并剪断颈外动脉的分支甲状腺上动脉和枕动脉(图2,见封2)。在距离ECA根部约5mm处两点结扎并剪断ECA,将断端拉向心脏方向使其与颈内动脉基本成直线,并在其根部放置结扎线打活结备用。分别在颈总动脉近心端和颈内动脉远心端置动脉夹,在颈外动脉残端剪一小口,将备好的“线栓”从小口插入,轻轻扎紧备线(图3,见封2)。移开颈内动脉上的动脉夹,将线栓缓慢推入。当距“线栓”端0.8cm处的标记接近颈总动脉分叉处时,注意调整“线栓”方向,避免误入翼腭动脉(Pterygoid palatine artery,PPA)。当距“线栓”端1.8cm处的标记到达颈总动脉分叉处时,注意用力轻柔,当插线遇阻力时,停止插线,此时“线栓”的前端已越过大脑中动脉(middle cerebral artery,MCA)起始部,阻断大脑中动脉血液供应,制成MCAO模型,记录MCAO时间。扎紧备线,移去颈总动脉处的动脉夹,逐层缝合切口,“线栓”尾部留在切口外1cm。MCAO 3h时将“线栓”从尾部轻轻拉出,感觉到阻力为止,剪断,此时“线栓”膨大的头端已退回颈外动脉切口处,完成再灌注。进行神经功能缺失评分后,单笼饲养。 1.2.3 神经功能缺失评分 参照Longa[5]、Bederson[1]神经功能缺失评分法,由不知情分组的实验人员分别于再灌注10min和再灌注24h对大鼠进行神经功能缺失评分。0分:无神经损伤症状;1分:提尾时右侧前肢屈曲抱于胸前;2分:向右侧转圈;3分:向右侧倾倒;4分:不能自发行走,意识丧失;5分:死亡。 1.2.4 脑梗死体积测量 1)TTC染色再灌注24h,麻醉大鼠,断头开颅,完整取出大鼠全脑,弃小脑,生理盐水冲洗后放置于特制的蜡槽中。用双面刀片沿蜡槽上的刻度切口将鼠脑切成6片(每片厚度2mm),按顺序快速放入特制的TTC反应槽中(图4,见封2),置盛有TTC溶液的孵育缸内移入3
7℃温箱,避光反应30min,脑片中正常组织被染成红色,梗死组织呈白色(图5,见封2)。30min后将TTC反应槽从孵育缸中移出,置于4%多聚甲醛溶液中,4℃冰箱固定24h。 2)脑梗死体积的计算 脑片固定后,按顺序排列,数码照相机照相(嘴侧面和尾侧面分别照相),照片中红色区域为正常脑组织,白色区域为梗死组织。照片输入计算机图像分析系统,测量各区面积,参照罗勇[8]等的方法计算梗死灶体积和整脑体积:V=∑(A1+A2)·d/2 式中V为总体积;A1、A2分别表示切片嘴侧、尾侧面积;d为切片厚度。计算梗死灶体积占整脑体积的百分比(%),用比值表示梗死灶的大小,将所得值用于统计学处理。 1.3 统计学方法各组数据均以均值±标准差(x±s)表示,两组间差异用独立样本t检验,组内比较用变异系数,用SPSS 11.5软件处理。 2 结果所有大鼠于手术完成后1~2h内苏醒,均出现左侧Horner征,表现为左眼眼裂变小,瞳孔缩小。两组20只大鼠中,A组有3只大鼠未出现神经功能缺失症状,其余17只大鼠均表现出不同程度的神经功能缺失症状。A组和B 组各有2只大鼠于手术当日夜间死亡,4只鼠均排除在外,其余大鼠均于MCAO再灌注24h进行神经功能缺失评分后处死,TTC染色计算脑梗死体积。 2.1 神经功能缺失评分(见表1)表1 A、B两组大鼠神经功能缺失评分(略) 2.2 脑梗死体积比A组有3只大鼠脑片TTC染色未发现梗死区,两组其余大鼠脑片左侧半均表现出不同大小的梗死区。 2.2.1 两组大鼠脑梗死体积比的比较 (见图6,表2)表2 两组大鼠脑梗死体积比比较(略) 2.2.2 神经功能缺失评分与脑梗死体积比的关系观察发现,大鼠神经功能缺失评分高低与脑梗死体积比的大小呈相同变化趋势,神经功能缺失评分高的大鼠,其脑梗死体积比也大(见图7、8)。对再灌注24h 的评分与脑梗死体积比进行相关性统计分析,Pearson相关系数r=0.873,P<0.01,两者之间存在线性相关关系。 3 讨论 3.1 采用改良线栓法可增加大鼠MCAO再灌注模型的稳定性依照大鼠脑部动脉血管的解剖结构特点,制备合适的“线栓”是保证制模成功、梗死体积稳定的关键。大鼠头颈部的动脉分布与人类相似,颈总动脉上升至甲状腺水平高度分出颈内动脉和颈外动脉。颈外动脉在下颌角平面以下分出枕动脉、甲状腺上动脉等。颈内动脉在鼓泡和枕骨之间入颅,在鼓泡内侧发出颅外分支翼腭动脉(Pterygoid palatine artery,PPA),相当于人类上颌动脉,主干继续沿鼓室内侧延伸,进入鼓室与枕骨基板之间的后破裂孔进入颅腔。
主要分支有大脑前动脉(anterior cerebral artery)、大脑中动脉(middle cerebral artery,MCA)、大脑后动脉(posterior cerebral artery)、脉络膜前动脉(anterior choroidal artery,AchA)、下丘脑动脉(hypothalamic artery,HTA)等。其Willis环构成(图9,见封2),从前向后依次为大脑前动脉干、大脑前动脉、颈内动脉、大脑后动脉、后交通动脉、小脑上动脉起始段和基底动脉终末段。制模时,线栓在颈内动脉的颅内段要途经大脑后动脉、下丘脑动脉、脉络膜前动脉等。线栓过细,不能阻塞大脑中动脉,造模失败。线栓过粗,插线栓塞MCA起始端的同时,势必会导致脉络膜前动脉、下丘脑动脉和一些直接起于颈内动脉小动脉的栓塞,导致MCAO后,不仅有MCA供血区,如尾壳核和临近皮质缺血,还会导致非MCAO供血区,如海马、下丘脑、丘脑梨状皮质和内囊等结构的缺血,致脑梗死体积不稳定。本实验参照Koizumi[7]、Longa[5]等的基本方法,加以改进。A组大鼠使用参照Longa等的方法制作的“圆头线栓”(图1,见封2),结果有3只大鼠未出现脑梗死,组内其他大鼠虽出现梗死灶,但其梗死体积比变异度大,变异系数为1.08。分析原因,可能是膨大的圆头越过MCA的根部,阻断了大脑前动脉的血供,但来自ICA主干的血供可能未完全阻断所致(图10,见封2)。B组大鼠使用改良的“梭头线栓”(图1,见封2),以其头端3~4mm长的膨大段阻塞于MCA起始部,阻断ICA顺流的血液,也阻断大脑前动脉回流的血液,达到完全阻塞大脑中动脉。同时,膨大头端以后线的直径较细,可避免AchA等小动脉的栓塞而出现梗死区的变异(图11,见封2)。实验结果显示,B组10只大鼠除2只夜间死亡不做TTC染色,其余8只大鼠的脑梗死体积比变异度小,变异系数为0.12,明显优于A组。说明采用本实验改良的“梭头线栓”可以制作出可重复性好、稳定可靠的MCAO再灌注模型。在手术切口选择方面,目前国内外学者多采用颈部正中切口,本实验采用了左侧颈部旁正中线3~5mm纵形切口,这样便于肌肉分离,出血少,手术视野暴露较好,颈内外动脉及其分支的分离易于进行。另外,颈部旁侧切口对气管刺激性小,呼吸道分泌物少,有利于手术顺利进行。本实验制模过程中不结扎双侧的CCA,保证了非MCA供应区域的侧支循环,以便更好的区分各区域间损伤的区别,再灌注时可实现迅速恢复血供。同时也不结扎ICA的颅外分支PPA,减小手术创伤,并可避免血栓的形成[11],保证了再灌注时血流的通畅。 3.2 脑梗死体积比能直接反映大鼠MCAO再灌注损伤程度TTC(2,3,5-triphenyltetrazolium chloride)染色是一种用于评价组织内脱氢酶