01_辣椒青枯病拮抗菌株的筛选及田间防效的测定
辣椒青枯病拮抗菌株的筛选及田间防效的测定
郭坚华1,郭亚辉1,张立新2,祁红英3,1
(11南京农业大学植保学院植病系,南京 210095;21江苏南京市栖霞区农业技术推广站;31江苏淮阴市蔬菜研究所)
摘要:用抑菌圈2定殖力双重测定法筛选出6个定殖密度大于105cfu/g根,抑菌能力亦较强,同时又极易于人工培养的菌株,作为青枯病的潜在生防菌株。温室试验,防病效果分别达8314%(J2)、9116%(J3)、5814%(FH17)、7510%(BB11)、6616%(BT4)和4116%(BT6),增产效果为2113%～11011%,其中以J3增产效果最为显著,BB11次之。1996年在南京和淮阴两地的辣椒青枯病小区进行试验,移栽40d后各菌株平均防效分别为:6610%(J2)、6116%(J3)、5812%(FH17)、6214%(BB11)、7218%(BT4)和3711%(BT6);平均增产效果为4517%(J2)、7615%(J3)、3214%(FH17)、7815%(BB11)、2913%(BT4)和1910%(BT6)。关 键 词:青枯劳尔氏菌;抑菌圈2定殖力双重测定法;发病率;防治效果中图分类号:S436.418.1;S476 文献标识码:A 文章编号:100529261(2001)0320101206由青枯劳尔氏菌(Ralstoniasolanacearum)引起的植物细菌性青枯病是一种广泛分布于热带、亚热带和某些温带地区的世界性病害,是多种农作物减产的主要原因。由于土传病害用化学方法难以防治,且易产生抗药性,造成环境污染,因此青枯病等土传病害的生物防治引起了国内外的高度重视。
最初用于筛选拮抗菌株的离体抑菌圈筛选法,是依据微生物的抗生现象而进行的。以抗生素的有无作为筛选依据,可能会使许多有益的微生物被忽视而得不到理想的结果。在离体条件下,细菌抑制病原菌的能力与在活体上抑制此病原菌引起的病害不存在普通的相关,所以在琼脂培养基上产生最大抑菌圈的菌株并不一定是最好的生防因子。Weller[1]认为,当试图开发生防系统时,预先在琼脂培养基上筛选菌株的方法可能不适用。一般认为,首先从与所防治病害同样的环境中,或植株根茎部筛选,选到有效菌株的机会可能较多。另一种方法是筛选能在根部定殖的细菌而不管其抑菌活性。提出这个假设的根据是根部病原菌的生防菌株应该是较好的根部定殖者[1]。Bennet和Lynch[2]设计一种试管法,用以测定在无菌条件下的细菌菌株于植物根部定殖的能力。Kloepper等[3]报道了在灭菌土系统中,利用细菌菌株处理大豆种子选择优秀的种围定殖菌方法。Scher等[4]报道了一种用未灭菌土测定玉米根部细菌定殖能力的试管法。土壤中微生物环境较为接近于自然环境,且能够进行大量筛选,在此系统中,54株供试菌中有24个菌株能够与土壤中原有微生物竞争,而在玉米根部定殖。相对于灭菌系统,其优点是能够检测细菌菌株在土壤中的竞争能力,以及在根部的生长能力。 收稿日期:2000204205
基金项目:江苏省应用基础项目(BJ93072)
作者简介:郭坚华(19662),女,博士,副教授;郭亚辉现工作于河北邯郸农业高等专科学校。
101
在综合前人经验基础上,本研究着眼于抗生素和竞争定殖能力两个方面,发展出抑菌圈2
定殖力双重测定法,进行了植物青枯病拮抗细菌的筛选。此筛选方法的有效性得到了多次温室和田间小区生防试验的证明。
1 材料和方法
111 试验菌株、植物和培养基
青枯劳尔氏菌菌株Tm215,1995年分离自南京地区青枯病发病番茄,后接种在辣椒上也可致病;番茄品种“苏抗五号”、“早丰”和辣椒“苏椒2号”从江苏省农科院蔬菜所购得。培养基:LB(Luria2Betani)培养基[5];CPG培养基[6];马铃薯葡萄糖(PDA)培养基[7]。112 青枯病拮抗菌的筛选11211 拮抗菌的筛选及标记 以Tm215为指示菌,从连种两年以上的番茄地(南京)、辣椒地(南京)和生姜地(安徽)土壤中,以PDA培养基筛选出拮抗菌并进行革兰氏染色试验。菌株J1～6、BT1～10来自番茄根围,FH1～18来自辣椒根围,BB1～11来自生姜根围。菌株的利福平抗性标记参照任欣正[8]的方法。11212 植株幼苗处理 将生长一致的番茄幼苗从沙土中拔出(此时已有一定的伤根现象),分别浸根于Tm215菌株以及抑菌圈法筛选出的45个拮抗菌菌株的悬浮液中。30min后取出,一
)生长30d。盆部分用于测定细菌在根部的初始定殖密度,其余种于盆钵中,室温下(5～14℃
钵中为连种三年番茄的田间自然土。11213 菌株在植株幼苗根部定殖能力的测定 先用自来水将幼苗根部冲洗干净,再于灭菌水中清洗3次,尽可能洗去根表杂菌和处于可逆吸附状态的试验菌,剪断,用灭菌玻棒轻轻研碎,置于1ml灭菌水中,放置10～20min,使根内细菌释放出来,取不同稀释浓度的菌悬液涂于含600mg/L利福平的CPG培养基平板上。另一部分幼苗在温室盆钵中生长30d后取出,作同样方法的处理,计算出平均每克根上定殖的活菌数(即定殖密度)。113 温室生防试验
从试验112选出的拮抗菌中取6个终定殖密度大于105cfu/g根、抑菌能力亦较强的菌株J2(Serratiasp1)、J3(Pseudomonassp1)、BT4(Escherichiasp1)、BT6(Corynebacteriumsp1)、FH17(Bacillussp1)、BB11(Bacillussp1)和1株抑菌能力最强但定殖能力较弱的菌株FH16,进行温室生防试验。将生长一致(约10～12cm高)的辣椒苗从土中拔出后,浸根于上述菌株约2×108cfu/ml浓度的菌悬液中30min后取出,栽种于Tm215浓度约为2×106cfu/g土中。所有盆钵土壤均提前一天准备。对照1带土移栽,用灭菌水浇根;对照2用灭菌水浸根;对照3以灭菌的培养液浸根。每组24株苗,分8盆栽种。观察其生长状况和发病率,40d后统计发病率和病情指数,算出防病效果。71d时计算每组辣椒产量(植株均已枯萎)、增产率。114 田间小区试验
1995年底在南京市栖霞区尧化镇农场播种辣椒(大果早丰),1996年3月移入大棚。1996年2月中旬在江苏淮阴市青浦区露地播种辣椒(苏椒2号),3月下旬进行第一次移栽,4月下旬再移栽入露地。各菌制成颗粒剂,每粒重110g左右。移栽时每穴放5～10粒,各处理组大体一致。每处理设3个重复,每小区4m2,对照设12组(南京)和6组(淮阴),分散于各处理组之间(因青枯病在田间自然条件下发生不均匀,本试验根据地块大小,设立尽可能多的对照,且穿插于试验地不同部位,取其发病率的平均值)。苗期每小区随机抽取8株,定期测量株高、茎102
第3期 郭坚华等:辣椒青枯病拮抗菌株的筛选及田间防效的测定
粗、叶片数,观察叶色,作为植株生长情况的指标;待发病时,记录发病始期,随后每隔一周检查每小区发病株数和严重度,至辣椒成熟。统计40d时各组的发病率和各组总产量。
2 结果与分析
211 各菌株抑菌能力以及在植株根部的定殖能力
从3000余株根围细菌菌株中选出45个抑菌圈直径大于110cm的菌株。在这45株拮抗菌中,根部定殖密度大于104cfu/g根者有22株。其中有17株的定殖密度高于青枯病菌在相同环境中的定殖密度(表1中Tm215的根围终定殖密度为4次重复的平均定殖密度)。
表1 青枯菌及其拮抗菌在辣椒根部定殖的情况
G+菌株J1
J4J5J6BB5BB6BB7BB10BB11BT2BT6BT7BT9BT10FH1FH2FH3FH12FH13FH15FH16FH17抑菌圈直径
(cm)[***********][***********][***********][1**********]3初始密度
(cfu/g根)114×10111×102110×104110×104113×103611×103111×102112×105212×106215×104310×104214×106211×106212×106110×104611×103111×103117×105115×103112×102111×104115×1064
6
终定殖密度
(cfu/g根)110×10
111×102110×103
----310×102110×105510×102112×106112×102211×102513×102015×102
--113×104
--112×102116×1054
3
G-菌株J2
J3BB1BB2BB3BB4BB8BB9BT1BT3BT4BT5BT8FH4FH5FH6FH7FH8FH9FH10FH11FH14抑菌圈直径
(cm)[***********][***********][***********][1**********]2
初始密度
(cfu/g根)118×10311×106216×106510×105510×105510×105118×105117×105117×105113×106310×106310×106116×105116×104112×106111×104411×106210×106310×106211×106210×106210×1065
5
终定殖密度
(cfu/g根)112×105
315×106115×105110×105111×105111×105115×104111×104110×104211×105210×105511×104111×102
-210×105211×102214×104211×102411×105110×105212×105110×1054
注:-表示未能测出其定殖密度。
从表1可看出,其一,青枯拮抗菌的不同菌株在辣椒根部的定殖能力与其在平皿上产生的抑菌圈大小无关,如菌株FH13、FH16等,抑菌圈较大但定殖力却极弱甚至未能测出;其二,不同菌株的菌悬液浸根后测得的初定殖密度与30d后测得的终定殖密度无一定的比例关系,这可能是由于不同菌株在自然土壤环境中对辣椒根表的附着能力、自身的增殖能力和存活能力不同所致,终定殖密度才能代表此菌在根部的定殖能力;其三,在23株革兰氏阳性菌中,检测
不出终定殖密度者有8株,占3418%,定殖能力较强的(终定殖密度大于105cfu/g根)有3株,占1310%。在22株革兰氏阴性菌中,未检测出终定殖密度者只1株,占415%;定殖能力较强者为13株,占5911%。从涂板结果看,600mg/L的利福平对绝大多数杂菌有抑制作用,只发现平皿中有一种低等真菌的污染,因其菌落形态与试验菌株差异显著,故对统计结果无影响。高浓度的利福平使多种参试拮抗菌改变了原来的菌落形态,在统计结果时应加以注意。另外高浓度利福平也可能会使某些菌株降低定殖能力,使我们忽略了一些原本优良的定殖菌株。
103
中国生物防治 第17卷
212 温室生防试验
结果表明(表2),通过抑菌圈2定殖力双重筛选法而得到的潜在生防菌株绝大部分实现了
预期的生防效果。其中抑菌能力很强但定殖能力一般的J2和BB11菌株,以及抑菌能力一般,定殖能力最强的J3菌株对辣椒青枯病的防效最佳。但抑菌能力最强而定殖能力很弱的FH16菌株防病、增产效果却不够理想。可见在筛选优良的拮抗菌株时仍应两者兼顾。试验中,由于拔苗移栽造成植株根部部分损伤,而浸根处理可能使伤口进一步扩大,受到较多病原菌侵染,所以对照2和对照3发病较对照1严重。对照3发病率和产量与对照2相比无明显区别,说明各处理组菌液中的营养成分对最后产量无明显影响。为了与自然状态相比较,在此后的田间小区试验中我们只采用对照1的方式,而忽略拮抗菌剂中营养成分对植株的影响。但在温室生防试验中,为了排除培养液可能造成的影响,便于对结果进行分析,我们使用了对照3(以灭菌培养液浸根)。表2中防治效果和增产率的计算均以对照3为参照。
J2、J3、FH17、BB11、BT4和BT6等6个菌株的防病效果和增产效果较为明显,除了菌株
本身的优良特性之外,事先在土壤中拌有适当浓度的病原菌,使对照组及各处理组土壤中病菌含量一致,也是得到稳定防效的原因。从辣椒的生长状况看,以J3处理组植株最为茎壮叶绿,体现出最为明显的增产效果,可能该菌能够分泌或促使植物分泌其生长的促进物质。
表2 辣椒青枯病的温室生防试验
菌株
发病率(%)防治效果(%)产量(g)
[***********]19516
增产(%)
菌株
FH16FH17BB11
发病率(%)防治效果(%)产量(g) [***********]12
[***********]6
[***********]1011813
增产(%) [***********]3
对照1 4518对照25010对照35010J2813J3412
8314
9116 621511011
BT4BT6
213 田间小区试验
由表3、4可见,J2、J3、FH17、BB11和BT4均维持了较好的生防效果,但FH17和BT4的增产能力不够强。J3菌株虽然在淮阴地区试验地防病效果略低,但增产效果却十分显著;BB11的增产能力高于温室和番茄小区试验(因效果不理想未发表),且这种提高在不同地区的试验中均有反映,可能是该菌株与辣椒之间的互作关系更有利于植物的生长。BT6的防病、增产效果在淮阴地区试验田中尚可,而在南京地区试验地防治效果较差。该菌株的表现可能与不同地区的气候、土壤等环境条件有关,难以稳定地用于田间青枯病的生物防治。从田间小区试验结果可看出,J2、J3和BB11为稳定的防病、增产菌株,以J3为最佳。如果用于辣椒青枯病的的田间生防,BB11可能会取得与J3相同的效果,这点还需进行多次的试验予以证明。
表3 辣椒青枯病淮阴小区生防试验
菌株 J2
J3 FH17 BB11
3
发病率(%)
[**************]5
防治效果(%)
[**************]0
增产(%)
[**************]7
菌株
BT4BT6
发病率(%) 914
20133218
防治效果(%)
71133811
增产(%)
33132214
对照
注:由于意外原因,FH17的3个小区试验中只有一个小区取得了自然的结果,其它菌株均为3个小区的平均值。
104
第3期 郭坚华等:辣椒青枯病拮抗菌株的筛选及田间防效的测定
表4 辣椒青枯病南京小区生防试验
菌株
J2
重复
1
2312312发病率对照发病率防治效果
(%)
(%)[***********][1**********]911(%)[***********][1**********]119增产
(%)[***********][1**********]810菌株
BB11
重复
12312312发病率对照发病率防治效果
(%)[***********][1**********]818(%)[***********][1**********]911(%)
增产
(%)
J3
FH17
[***********][1**********]BT4
BT6
[***********][1**********]119
[***********][1**********]133 讨论
在生防菌株的筛选过程中,从总体看,G-菌与G+菌相比,G-菌具有较好的根部定殖能力。Rovira[9]曾报道在燕麦和番茄上定殖的细菌中,有91106%是G-细菌。Scher等[4]的试验表明,不管是灭菌还是未灭菌的土中,G+菌均难以在根部定殖。本研究中1310%的G+菌和5911%的G-菌在番茄幼苗根部有较强的定殖能力。这种明显的不同可能是由于在土壤中,G+菌的繁殖速度比G-菌慢的原故[10]。
抑菌圈2定殖力双重测定法用于青枯病生防因子的筛选,对于提高大田防治成功率是一种简便而且行之有效的方法。利用此方法筛选出的菌株J2、J3、FH17、BB11和BT4对辣椒青枯病具有优良的防病作用,明显提高了作物产量。从温室和田间小区生防试验结果来看,各菌株的防病效果和稳定性有明显的差异,而且这种差异也是相对稳定的。所以,在今后的试验中,我们将选取一些普遍稳定且防效较好的菌株进行进一步研究。我们设想,可在此基础上制成一种防效较稳定的生防菌剂母剂,在不同地区实际推广使用时,亦再结合对当地土壤有效的菌株,推出针对不同地区土壤和气候条件的系列生防菌剂。
在本实验室与南京市栖霞区尧化镇植保站合作进行的预备试验中发现,田间自然发病率较低时,所统计的生防菌株田间试验结果很不稳定,难以说明一个菌株的生防效果。此外,由于青枯病在田间自然发病情况是不均匀的,所以要想取得较为准确的田间小区试验结果,将同一处理小区包括对照组分散在田间不同部位时,能取得较稳定的结果。如果依靠轻病田内少数几次试验对生防菌株进行取舍,很可能会丢失原本极有生防前景的菌株。从本研究结果可见,一个较高的对照发病率更能显示出生防菌的防病效果。由于40d后辣椒地里各种不同的病害明显增多,影响产量统计的因素也增多,所以我们选择了这个时间来进行防病效果和增产率的统计。但辣椒移栽大田后一般约两个月才采收完毕,若计算最后采收的辣椒总产量,与我们的结果相比,增产率应较低。据田间观察的结果,与其它菌株处理组相比,J2、J3、BB11三菌株处理的田块中,辣椒生长较能保持原先的良好趋势,但发病率仍比前期为高。如何对40d以后的田间植株进行良好的保护,是茄科植物青枯病生物防治中的一大难题。我们此后的研究发现,仅用单一的菌株进行防治较难达到理想的效果。
参考文献
[1] WellerDM.Biologicalcontrolofsoilborneplantpathogensintherhizospherewithbacteria[J].Ann.Rev.Phytopathol.,
1988,26:379-407.
[2] BennetRA,LynchJM.Bacterialgrowthanddevelopmentintherhizosphereofgnotobioticcerealplants[J].J.Gen.Mi2
105
中国生物防治 第17卷
crobiol.,1981,125:95-102.
[3] KloepperJW,SchrothMN,MillerTD.Effectsofrhizospherecolonizationbyplantgrowth2promotingrhizobacteriaon
potatoplantdevelopmentandyield[J].Phytopathology,1980,70:1078-1082.
[4] ScherFM,ZiegleJS,KlopperJW.Amethodforassessingtheroot2colonizatingcapacityofbacteriaonmaize[J].Can.J.
Microbiol.,1984,30:151-157.
[5] 萨姆布鲁克・J,E・F・弗里奇,T・曼尼阿蒂斯著.分子克隆实验指南[M].金冬雁等译.北京:科学出版社,1993.[6] ChenWY.Effectsofavirulentbacteriocin2producingstrainsofPseudomonassolanacearumonthecontrolofbacterialwiltof
tobacco[J].PlantPathology,1984,33:245-253.
[7] 方中达编著.植病研究方法[M].第二版.北京:中国农业出版社,1979.
[8] 任欣正,张建华,方中达.无致病力产细菌素拮抗菌nOE-104在番茄植株上定殖能力的研究[J].植物病理学报,
1988,17(3):129-133.
[9] RoviraAD.Astudyofthedevelopmentoftherootsurfacemicrofloraduringtheintialstagesofplantgrowth[J].JAppl.
Bacteriol.,1956,19:72-79.
[10] BowenGD,RoviraAD.Microbialcolonizationofplantroots[J].Annu.Rev.Phytopathol.,1976,14:121-144.
ScreeningforBiocontrolAgentsAgainstRalstoniasolanacearum
GUOJianhua,GUOYahui,ZHANGLixin,QIHongYing,FANGZhongda
(DepartmentofPlantPathology,NanjingAgriculturalUniversity,Nanjing210095,China)
Abstract:Cayennepepperbacterialwilt,causedbyRalstoniasolanacearum,isone
ofthemostimportantdiseasesinChina.Biocontrolisconsideredtobethemostenvi2ronment2safeandefficaciousapproachestocontrolthedisease.Inthisstudy,screen2ingforpotentialbiocontrolagentsagainstthediseasewasperformedbasedonabilitiestoinhibitthepathogeninvitroandtocolonizehostrootsinplanta.6bacterialstrains(Corynebacteriumsp.BT6,Bacillusspp.FH17,BB11,Escherichiasp.BT4,Serratiasp.J2,andPseudomonassp.J3)wereselected.Allstrainsexhibitedpathogen2inhibitingzonediameterslargerthan1cmonartificialmediaandroot2colo2nizingpopulationcountshigherthan1×105cfu/groot30dafterroot2dippingandplanting.Thedisease2controllingefficacyofthesestrainswasassayedbothinthegreenhouseandinfieldplots.Ingreenhouseexperiments,therootsofseedlingsweredippedincellsuspensionsbeforeplantinginsoilscontainingR.solanacearum.Thediseaseincidence40daftertreatmentwasreducedby42%to92%,andtheyield71daftertreatmentwasincreasedby21%to110%.Fieldplotexperimentswerecom2pletedundernaturalconditionwithoutinoculationofthepathogeninQixiaofNan2jing,andHuaiyinofJiangsu,oncultivarsDaguozaofengandSujiao2,respectively.Onaverage,thediseaseincidence40daftertreatmentwasreducedby37%to73%,andtheyieldatripenesswasincreasedby19%to79%.AllstrainstestedexcepttheBT6showedhighdisease2controllingefficacyandyieldincreasingpotential.Keywords:cayennepepper;Ralstoniasolanacearum;biocontrolagents;efficacy
106