肉毒神经毒素的作用机制及研究进展

军事医学科学院院刊 2005年12月第29卷第6期Bu llAcad M ilM ed S c, i Dec 2005; Vol 29 No 6

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肉毒神经毒素的作用机制及研究进展

孟露露, 荫 俊

(军事医学科学院微生物流行病研究所病原微生物生物安全国家重点实验室, 北京 100071)

[摘要] 肉毒神经毒素(botuli num neuro t ox i ns , BoNT s) 是目前已知的毒力最强的毒素蛋白, 它通过与神经肌肉接头处的神经元上的受体结合, 抑制神经递质释放而引起松弛性麻痹, 进而导致生物体死亡, 是重要的生物恐怖剂之一。研究BoNT 的作用机制, 获得具有中和活性的保护性抗体, 对肉毒毒素中毒的防治具有重要意义。本文就Bo NT 的作用机制及近年来的研究进展作一综述。[关键词] 肉毒神经毒素; 神经递质; 突触小泡[中图分类号] R 996. 1

[文章编号] 1000-5501(2005) 06-0563-04

[文献标识码] A

Advances in research on m echanis m s of action of botulinu m neurotoxi n s

ME NG Lu-Lu, YI N Jun

(State K ey L abo rato ry of P athogens and B i osecurity , Instit ute o fM icrob i o l ogy and Ep i de m i o logy , A cade m y o fM ilitary M ed-i ca l Sc i ences , Be ijing 100071, Ch i na)

[Abstract] Botu li nu m neuro tox in (BoNT ) is t he mo st potent known tox i n affecti ng hu m ans . By b i ndi ng to the specific neurona l receptors at neuromuscular juncti ons(NM J),

t he BoNT inh i bits the re l ease of neuro trans m itters , causes flacc i d

In th i s article ,

paralysis and even death o f the organ is m s . It is listed as one of the m ost dangerous bioterroris m agents . T here are grea t sen -ses to illustrate the m echan is m s of action o f BoNT i n order to obta i n the t herapeu ti c neutra li zing anti body . the advances i n the research on the m echanis m s of acti on o f BoNT are rev i ewed . [K ey words] botuli num neurotox i n ; neuro trans m itter ; synaptic vesicle 肉毒神经毒素(botuli num neuro tox in , BoNT ) 是由厌氧的肉毒梭菌(C lostr i diu m botulinum ) 产生的外毒素。在分子数相同的条件下, 其致死力是白喉毒素的300倍, 蓖麻毒素的3万倍, A -银环蛇毒素的300万倍, 箭毒的10亿倍[1], 是目前已知毒力最强的分子, 被美国疾病控制预防中心(CDC) 列为A 级生物恐怖剂[2]。根据免疫性质的不同, Bo NT 包括A ~G 7种血清型。人类肉毒毒素中毒多数由A, B 及E 型引起, 少数由F 型引起, 而动物多数由C 及D 型引起。BoNT 的前体是相对分子质量为150@103无生物活性的单链蛋白, 在内源或外源蛋白水解酶的作用下裂解为100@103的重链和50@103的轻链, 形成由二硫键链接的有活性的双链蛋白, 双链蛋白包括三个与功能相关的结构域:位于重链C 端的受体结合区, N 端的跨膜区和轻链的蛋白酶水解活性区(图1) 。毒素通过与受体结合侵入神经元, 通过轻链的蛋白酶水解活性裂解介导神经递质释放的蛋白, 破坏神经递质的胞吐作用, 导致麻痹和死亡。

图1 肉毒毒素分子的一级结构[4]

1 BoNT 作用的靶细胞

1. 1 BoNT 的生物学效应

无论BoNT 的分子以何种方式(吸入或注射) 进入体内, 最终都会选择性地侵入神经组织, 作用于神经肌肉接头处运动神经元的突触前膜, 通过受体介导的内吞作用进入胞

质

内, 抑制调节肌肉的收缩与舒张的神经递质) ) ) 乙酰胆碱的

[收稿日期] 2005-03-14

[作者简介] 孟露露(1971-), 女, 辽宁省营口市人, 在读博士

生。

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释放而引起松弛性麻痹, 最终使半横膈肌失去功能, 生物体因呼吸抑制而死亡。不同物种对毒素的敏感性不同, 人与马对毒素的敏感性与小鼠接近, LD 50为0. 1~1ng /kg体重; 两栖类则不敏感。症状出现的时间也由于摄入的剂量与途径的不同, 显示出数小时至数日的滞后期。例如, 由创伤感染引起的中毒, 会因肉毒梭菌孢子的繁殖而使滞后期延长至一个月

[3]

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织中的多聚糖脂的亲和力更高。基于这种差异以及以后的一些发现, M ontecucco 于1986年提出了一种目前已被广泛接受的双受体模型。根据这种模型, 神经元中含量丰富的多聚糖脂捕获并募集毒素分子, 使其到达神经细胞的表面形成低亲和力的结合, 再由少量而特异的蛋白受体与这些分子形成高亲和力的结合并介导细胞内吞作用, 使毒素进入胞内。但具体由哪种蛋白介导尚无定论。有报道指出, 膜蛋白家族的突触结合蛋白(synapto tagm i n , syt) Ⅰ和sy t Ⅱ是介导B 型BoNT 与细胞结合的蛋白受体[8]。syt 广泛分布于神经组织中, 是见于突触前小泡的钙结合蛋白, 至少由13个家族成员组成, 能调节神经元及非神经元细胞的膜转运。在神经元细胞的应激反应中, 钙离子能引发具有分泌功能的细胞器与质膜融合从而介导突触传递及神经内分泌细胞释放激素, 而sy t 作为钙离子浓度变化的感受器对锚靠的突触小泡与质膜的融合具有重要作用。Rumm el 等[9]通过研究进一步发现sy t Ⅰ和sy t Ⅱ还可介导G 型BoNT 进入细胞而不需神经节苷脂的存在, 而对其他5种血清型的毒素分子则不具有此功能。最近, M ontecucco 等[10]又提出新的模型, 认为毒素的受体可能不是由单独的一个或两个受体组成, 而是由成簇的受体在突触前膜的微结构域形成阵列(arrays o f presynaptic re -cepto rs , APRS) 。这种APR S 具有流动性, 并带有鞘糖脂和富含胆固醇的脂质微结构域的某些性质, 在APRS 中存在跨膜蛋白信号分子。在A PRS 中, 唾液酸中的寡糖由于含量高并具有侧向移动性可作为启动分子与毒素形成低亲和力可逆结合(图2a), 在信号分子及APRS 其他成分的参与下引发级联反应将毒素分子捕获, 形成高亲和力的不可逆结合(图2b), 毒素-A PR S 复合物被募集到突触前膜, 在膜上形成凹陷并内化, 通过破坏突触小泡的再循环发挥生物活性(图2c) 。但APRS 的精确成分及

其拓扑性质还有待进一步研究。

。

1. 2 BoNT 与受体的结合

在BoNT 的双链分子中, 重链的C 端(H C ) 是受体结合区。最新研究显示, 在H C 中包含有两个亚结构域[4]:即分别位于H C 的N 端与C 端的H C -N 与H C -C 。在H C -N 中含有两个七B -链缠绕而成的果胨团(je ll y -ro ll) 样的基序, 与豆凝集素(一种糖结合蛋白) 相似。在不同血清型的毒素分子中, 该亚结构域的氨基酸高度同源, 表明它们有相同的三维结构。有研究显示, H C -N 结构域能介导形成膜通道, 使轻链进入胞内发挥蛋白水解酶作用[5]; 而在H C -C 亚结构域中含有被修饰的B -三叶草型折叠基序, 这种基序也存在于白介素-1、成纤维细胞生长因子和蛋白酶抑制剂中, 是识别与结合细胞的部位[6]。从H C 中去除H C -N 区并不影响其与神经细胞的结合, 而H C -C 区10个氨基酸的缺失就会使H C 失去与细胞结合的能力。H C -C 区的氨基酸残基在不同血清型中同源性较低, 这表明H C -C 区不仅是受体结合部位, 它的氨基酸残基的也决定了不同血清型结合的受体有所不同。而近年有文献报道, 通过对7种血清型H C -C 端序列的比对, 发现存在H , SX W Y , G 的保守序列, 质谱及点突变研究证明它们在与神经节苷脂的结合中发挥重要作用[7]。

人们早已得知, 神经元中的多聚糖脂如鞘糖脂、神经节苷脂在毒素与神经元细胞的结合中发挥重要作用。毒素分子与体外分离纯化的多聚糖脂有较高的亲合力, 而与神经组

图2 肉毒毒素与受体结合的APR S 模型[10]

2 BoNT 分子的转运

现有的研究表明, BoNT 分子与膜结合后, 并不是直接进

入到细胞质中, 也不是被胞吞到酸性的细胞小室中, 而是通过温度与能量依赖的方式被内化到小囊泡腔中, 这是所有在细胞内发挥作用的细菌毒素所必需、也是目前了解最少的过

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合作准备。在突触囊泡蛋白rab -3的作用下, 囊泡和突触前膜可逆性附着呈系着状态(te t her i ng ), 系着状态使小突触泡蛋白、突触融合蛋白、SNA P -25形成SNARE 复合体, 将囊泡带到活性区的锚靠位点, 此位点与质膜和钙通道紧密相连, 钙的内流触发囊泡和突触前膜融合, 使囊泡中的递质释放到胞外。因此, 在S NARE 复合物形成之前任何一个蛋白的裂解最终都会抑制神经肌肉接头处神经递质的释放(图3) 。研究发现, 小突触泡蛋白必须形成完全的螺旋结构才能与SNAR E 复合物结合, 而与毒素分子的结合在随机的无规卷曲下就能发生, 表现出与毒素分子优先结合的熵优势[15]。SNAR E 复合物一旦形成, 毒素分子则不能再将其降解。不同血清型的毒素分子能选择性裂解S NARE 复合物中的不同组分, 在所裂解的底物中都含有一个9氨基酸残基的同源区, 称为S NARE 的二级识别序列(S NARE secondary recogn-i ti on , SSR ), 毒素与SSR 的结合没有特异性, 但只有SSR 与切割位点的距离正确时才能水解底物, 因此, 毒素识别底物的特异性很可能是通过识别空间位置实现的。如BoNT /A能裂解SNAP-25中的肽键G l n 97-A rg 98而不作用于G l n 15-A rg 16; Bo NT /D裂解VAM P 中L ys 59-L eu 60而不作用于L ys 83-L eu 84, 在其余几种血清型的毒素分子中也存在同样情况[15]

。

程。内化的毒素不能再被抗体中和。以往研究认为, 毒素分子必须暴露在低的p H 环境中才能发挥作用, 但将未经酸化处理的轻链直接注入细胞质中也能抑制胞吐作用, 因此, 酸性环境并不是毒素发挥作用的必要条件。内化的毒素要发挥作用必需跨过小泡膜的疏水区障碍, 但具体的过程尚不十分清楚。离子通道模型认为是小泡膜上的质子泵ATP 酶使小泡腔酸化, 导致水溶的中性毒素分子的构象发生变化, 暴露出疏水区, 在膜脂双层形成离子通道, 使毒素分子的轻链进入胞浆。Be i se 根据此模型进一步提出渗透裂解模型, 认为离子通道的形成改变了电化学梯度, 最终使囊泡裂解, 毒素被释放出来[3]。而裂隙模型则认为, 在酸性条件下, 毒素分子的疏水区与膜脂双层的疏水内核紧密接触, 重链形成跨膜的裂隙, 在分子伴侣的作用下, 使轻链的疏水区朝向脂质层, 与重链分离, 在胞质的中性p H 环境诱导下重新折叠成水溶性的中性构象。对BoNT /B的晶体结构的分析显示, 重链的跨膜结构域由两个长的A -螺旋区组成, 但在酸性(p H 610) 条件下, 该区域的构象表现出很大的柔性, 既不伸展也不形成螺旋。由于尚没有在p H 4. 0条件下Bo NT 的晶体结构的数据, 还无法得出Bo NT 的构象变化是p H 依赖的这一结论[11]。轻链在重链的协助下穿过小泡膜后定居在细胞的不同部位, 使细胞表现出不同的毒性效应持续时间。共聚焦显微镜和点突变的研究显示, BoNT /A的轻链通过其N 端和C 端的信号蛋白定位在细胞的质膜上, 对细胞表现出长效作用, 时间可持续3~12个月; 而BoNT /E的轻链分布在细胞质中, 对细胞的效应时间少于4周, 其机制还有待研究[12]。

3 BoNT 分子与底物的作用

Bo NT 是一类Zn 2+依赖的蛋白水解酶家族。它的催化活

性位于毒素分子的轻链(L 链), 在轻链的中部存在一个约20个氨基酸长度的保守区, 含有HEXXH +E 的锌结合基序, 能催化蛋白底物的裂解[13]。点突变表明锌结合基序中G l u 262(BoNT /A) 的突变能使轻链的蛋白水解活性消失。近来, 根据BoNT 的三维结构对轻链的酶催化机制的分析结果, 在切割键中的羰基氧向Zn 2+靠近, 形成米氏复合物的过程中, G l u 262可以提供质子并帮助形成过渡态四面体[14]。轻链催化的底物是一种在细胞的内吞与胞吐过程中的发挥重要作用的蛋白复合物:可溶性-N-乙基马来酰亚胺敏感因子(N SF ) 黏附蛋白受体(so l ub l e -N-ethy l m a l e i m i de -sens itive factor a ttach -m ent prote i n recepto r , SNARE) 。这种复合物由t -SNARE 靶膜蛋白家族〔包括突触融合蛋白(syntax i n) 家族, 见于神经元质膜, 与突触小泡的停靠与融合有关〕、SNA P -25(synaptosome -assoc i a ted pro tei n of 25@103) 家族及v -SNARE 囊泡膜蛋白家族〔包括小突触泡蛋白(synapt obrev in) 家族, 亦称小泡相关膜蛋白(VAM P) , 是由见于小突触小泡的一种膜内在蛋白〕构成。根据囊泡与靶膜的结合与融合的SNARE 假设:转运囊泡和膜相应靶点的选择性锚靠是通过囊泡膜蛋白和对应的靶膜蛋白间形成复合物而发生的。在胞吐的起始阶段, N SF 和可溶性N SF 附着蛋白作用于小突触泡蛋白、突触融合蛋白和SNAP-25, 此过程导致原来存在的SNAR E 复合解聚, 激活SNARE 蛋白, 并移走n -sce1等胞吐作用的负调控因子, 为融

图3 BoNT 的作用位点[15]

4 研究意义

4. 1 在小分子拮抗剂的设计, 疫苗及中和性抗体研制中的

应用

肉毒梭菌是分布比较广泛的菌种, 其强毒性及分布的广泛性使其成为重要的生物恐怖源。目前, 对Bo N T 中毒主要采用重组疫苗和抗血清进行防治, 还没有商品化的特异的小分子预防与治疗药物。通过在原子水平对Bo NT /E的催化机制的研究发现, 催化结构域中的谷氨酸被谷氨酰胺替代后, 虽然分子的三维结构没有改变, 但已失去水解底物的能力, 这种一个氨基酸的改变使得分子丧失毒性的现象提示可以通过对氨基酸的修饰来设计酶抑制剂及研制疫苗[14]。最近, 美国的研究人员对1990种化合物进行了高通量筛选, 通过高效液相色谱及三维模建, 有望得到一些对轻链的酶活性具有抑制作用的化合物。而韩国的研究人员发现一株针对重链跨膜区的单抗可能因具有阻断毒素内化的功能而具有中和毒素的活性[16]。因此, 研究毒素的作用机制, 对小分子拮抗剂的设计, 疫苗的研制及具有治疗作用的中和性抗体的获得无疑具有重要的意义[17]。

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4. 2 BoNT 的其他应用

根据BoNT 能抑制神经递质释放这一特性, 已有商品化的小剂量BoNT 类药品用于临床治疗非自主性肌肉活动异常, 如肌张力障碍、肌痉挛等[17]。研究毒素的作用机制对了解毒素的药理学, 临床合理用药具有指导作用[19]。胞内物质的跨膜运输是重要的细胞事件, 膜融合是关键的步骤, 有许多蛋白参与; 而其中有许多蛋白是肉毒毒素的作用底物, 研究毒素分子的作用机制对阐明膜融合的发生及胞内物质的转运将具有理论指导意义

[20]

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[9] Ru mm elA , K a math T, H enke T . Synaptot agm i n s Ⅰand Ⅱact as

n erve cell recep tors f or bot u li num neu rotoxi n G[J].J B i o lChe m, 2004, 279(29):30865-30870.

[10] M ontecucco C, Rossetto O , Sch i avo G . P resynapti c recep t or ar -rays for cl ostri d i al n eurotoxins [J].T rends M i crob i o, l 2004, 12(10):442-446.

[11] Sw a m i nat han S, E s w ara moorthy S . S truct u re an al ysis of t h e cata -l ytic and b i nd i ng sites of C lostrid i um botulinum neu rot oxi n B [J].N at Stru ct B io, l 2000, 7(8):693-699.

[12] Fe m andez -Sal as E, Ste w ard LE, H o H, e t al . Plas m a m e m b rane

locali zation s i gnals i n the li gh t chai n of bot u li num neu rotoxi n [J].Proc NatlA cad SciUSA, 2004, 101(9):3208-3213.

[13] R i goniM, C acci n P , J ohn s on EA , et a l . S ite -d i rected m utagene -sis i den ti fi es acti ve -site res i dues of the li gh t chai n of bot u linum n eurotoxi n t ype A [J].B i oche m B i ophys Res C o mm un , 2001, 288(5):1231-1237.

[14] Sw a m i nat h an S, Es w ara moorthy S , Desi gan K . S truct u re and en -z y m e activit y of botu li num n eurotoxi n s [J ].M ove D is order , 2004, 19s (9):s17-s22.

[15] H an s on M A, S teven s RC. Cocrystal struct u re of synap tobrevi n-II

bound t o bot u li num neu rotoxi n type B at 2. 0! resol uti on [J].N at S truct B i o, l 2000, 7(8):687-692.

[16] Y ang GH, K i m KS, K i m HW, et al . Isolati on and characteri za -tion of a neu traliz i ng anti body s pecific to i n tern ali zation do m ai n of C lostri d i um bot u linum neurotox i n typ e B[J].Tox i con, 2004, 44(1):19-25.

[17] H anson M A , OostT K, Sukonpan C, e t a l . Stru ctural bas i s f or

BAB I M i nh i b i ti on of bot u li num neu rot oxi n type B p rot eas [J ].J Am C he m Soc , 2000, 122(45):11268-11269.

[18] Setler PE. Phar m acol ogy of botuli nu m tox i n t ype B [J].Eur J

N euro, l 2001, 8S :9-12.

[19] Cord i variC, M isra PV , Catan i a S , et al . New therapeu tic i nd ica -tions for botu li num toxins[J].M ove D isord er , 2004, 19s (9):157-168.

[20] Grah a m M E, W as hboum e P , W il son M C, et a l . SNAP -25w i th

m utations i n the zero l ayer s upports nor m alm e m brane f u sion k-i n eti cs[J ].J C ell Sc, i 2001, 114(Pt 24):4397-4405.

。

[参考文献]

[1] A tass iM Z , Osh i m aM . Stru cture , acti v i ty, and i m m une (T and

B cell ) recogn iti on of botu li num neu rot oxi ns[J].C ritR ev I mm u -no, l 1999, 19(3):219-260.

[2] No w ako w s k iA , W ang C , Po w ers DB, e t al . Potent n eutrali zation

of bot u li num n eurotoxi n by reco m b i nant oligocl ona l an ti body[J].Proc NatlA cad SciUSA, 2002, 99(17):11346-11350. [3]

S c h iavo G , M atteoliM, M on tecu cco C. Neurotox i ns affecti ng n euroexocytos i s[J].Phys i olR ev , 2000, 80(2):718-750. [4] G i nals k i K , Ven clovas C , Lesyng B, e t a l . S truct u re -bas ed se -quen ce ali gn m en t for t he B -trefoil subdoma i n of the cl ostri d ial n eurotoxi n fa m ily provi des res i due l evel i n for m ation abou t t he pu -tati ve gangli osi de b i nd i ng s i te[J].FEBS Lett , 2000, 482(29):119-124.

[5] Kori az ova LK, M ontalM. Trans l ocati on of bot u li num neurot ox i n

ligh t chain p roteas e t h rough t h e heavy cha i n channel[J ].N at S truct B i o, l 2003, 10(1):13-18.

[6] Ihara H, Kohad T , M ori m oto F , e t a l . S equence of t h e gen e for

C l ostri d i um bot u li num t ype B neu rot ox i n ass oci ated w it h i n fant botu li s m, express i on of t he C -ter m i n al half of heavy chai n and i ts b i nd i ng acti v i ty [J].B ioch i m B iophys Acta , 2003, 1625(1):19-26.

[7] Rumm elA , M ah r h ol d S, B i gal k eH, et al . The HCC-do m ai n of

botu li num neurotox i ns A and B exh i b its a si ngu lar gang li oside b i nd i ng site d is p l ayi ng serot ype specifi c carbohydrate i n teraction [J ].M olM i crob io, l 2004, 51(3):631-643.

[8] DongM, R i chards DA, Goodnough M C, e ta l . Synap t otag m i ns Ⅰ

and Ⅱm ediat e entry of botu li num neu rot ox i n B i n t o cells[J].J CellB io, l 2003, 162(7):1293-1303.

(本文编辑 杨兆弘)

(上接第549页)

内建立超压防护。同时, 超压监测装置可实时监测各舱内相对外界大气环境的超压值。

(3):37-39.

[参考文献]

[1] 朱春来. 水面舰艇集体防护系统[J].舰船科学技术, 2001, [2] 钟玉征, 胡庆宝, 王学峰. 毒剂侦检分析[M].北京:兵器工业

出版社, 2002. 199.

[3] GJB 1629-1993. 军事后勤装备防核、生物、化学武器通用规

范[S ].

[4] 刘亚军, 徐新喜, 谭树林, 等. 具有超压功能的手术舱室环境设

计与仿真研究[J].军事医学科学院院刊, 2005, 29(5):453-456.

5 结论

本研究按照监测预警、报警控制、滤毒净化、建立超压、

超压监测5个控制环节建立了方舱式机动医疗系统的超压集体防护体系, 使该机动医疗系统在所处大气环境含有有毒有害生物、化学和放射性物质时, 具有监测预警和报警控制的能力, 能使单舱和系统各舱连接使用时分别建立并保持300Pa 和130P a 以上的超压防护, 并能实时监测各舱内的超压状态, 能够满足医疗作业对超压集体防护的要求, 保证了系统具有维持一段时间正常工作的能力。

(本文编辑 杨兆弘)