食品级枯草芽孢杆菌表达系统的最新研究进展

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食品级枯草芽孢杆菌表达系统的最新研究进展

王金斌ｍ，陈大超１，李文３，蒋玮１，李鹏１，张倩倩１，唐雪明１’２‘３“

（・上海市农业科学院生物技术研究所，上海２（）１１（）６；２农业部转基因植物环境安全监督检验测试中心，上海２０１１（）６；

３上海市农业遗传育种重点实验室，上海２（）１１（）６）

摘要：综述了枯草芽孢杆菌表达系统的特点、载体及其元件、转化方法及外源基因表达和蛋白分泌机理等

方面的基础研究和最新进展。

关键词：枯草芽孢杆菌；表达体系；遗传工程；综述

中图分类号：Ｑ９３６文献标识码：Ａ

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枯草芽孢杆菌（肋ｃⅢ“ｓｓＭ６ｆｉ池）是芽孢杆菌的一个种，有长期制备发酵食品的历史，是非致病的，且不产生毒素和致热致敏蛋白，被美国食品药物管理局（ＦＤＡ）和中国农业部等部门批准为食品级安全菌株。

自２０世纪８０年代以来，一批针对Ｂ．ｓ“ｂｆｊ凰的遗传操作工具（载体）被深入研究和应用。随着ＤＮＡ重组技术的发明，特别是发现金黄色葡萄球菌的带有抗性标志的质粒可作为枯草杆菌的载体以后，克服了Ｂ．ｓ“６ｆｉ协只有隐秘性质粒的困难。质粒载体ｐｕＢｌｌｏ和ｐｃｌ９４等在Ｂ．ｓ“ｂｆｆ凰中复制机制的研究为将Ｂ．ｓ“６ｆｉ凰开发成一种基因工程菌种和成熟表达系统提供了技术支撑。迄今为止，在Ｂ．ｓ“扫ｆｉ凰及其近缘种中已经克隆和表达了大量的原核和真核基因，其中有的已应用于工业化生产，并取得了一定的成效。

１枯草芽孢杆菌表达系统的宿主

从１９５８年Ｓｐｉｚｉｚｅｎ发现Ｂ．５“６ｆｊ胁１６８菌株为可转化菌株以来，Ｂ．ｓ“ｂｆｉ凰已成为芽孢杆菌属的模式菌种，其菌株１６８的全基因组序列已于１９９７年在ＮＡＴｕＲＥ上发表。截至２０１２年１（）月，在ＮＣＢＩ上公布全基因组序列的Ｂ．ｓ曲Ⅲｉｓ菌种共有１１种（表１）。在全基因组测序的基础上，Ｂ．ｓ幻剜如的基因组

收稿日期：２０１３一０３—１１

基金项目：上海市科委基础重点项目（１（）Ｊｃｌ４１３８（）ｏ），上海市科技兴农重点攻关项目［沪农科攻字（２（）１１）第１—８号］资助

作者简介：王金斌（１９８２一），男，在读博士，助理研究员，主要从事功能基因的挖掘及基因改良的研究。Ｔｅｌ：（（Ｊ２１）６２２０８７５（）；Ｅ・ｍａｉｌｗａｎ舀ｉｎｂｉｎ２（）１３＠１２６．ｃｏｍ＊通讯作者，Ｔｅｌ：（（）２１）６２２（１２７４６；Ｅ—ｍａｉｌ：ｘｕｅｍｉｎ９７０＠ｇｍａｉｌ．ｃｏｍ

１１６王金斌，等：食品级枯草芽孢杆菌表达系统的最新研究进展

学、蛋白组学、分泌表达组学和分子生物学等各领域的研究得以迅速发展。

表ｌ

ＴａｂＩｅ１Ｂ．ｓＨ６Ⅲ括全基因组序列ＮｃＢＩ公布的情况ｔｈｅＮＣＢＩＴｈｅ、ｖｈｏｌｅｇｅｎｏｍｅｓｅｑｕｅｎｃｅＯｆＢ．ｓ“６“ｆ如ｐｕｂｌｉｓｈｅｄｂｙ

Ｂ．ｓ“６ｆｉ凰蛋白质分泌功能发达，其主要的分泌途径可被用于外源蛋白质的高水平分泌表达。但一般高效分泌系统都有较发达的“质量控制”系统，Ｂ．ｓ“６ｆｉｆ括能够分泌表达多种蛋白酶对翻译错误和折叠不成功的蛋白进行酶解修饰。而许多外源表达的蛋白折叠的效率较低，宿主的“质量控制”系统即蛋白酶水解修饰就成为Ｂ．Ｊ“６Ⅲ妇异源表达的主要瓶颈之一。ｓｕｂｔｉＬｉｓｔ数据库对Ｂ．ｓＨ６Ⅲ西蛋白酶和肽酶研究统计显示：有２４种公认和６种可能的蛋白酶，２０种公认和２１种可能的肽酶。目前在科学研究中常用的蛋白酶缺陷型菌株见表２。

表２蛋白酶缺陷型枯草芽孢杆菌菌株

Ｔａｂｌｅ２Ｐｍｔｅａｓｅ＿ｄｅｆｉｃｉｅｎｔＢ．ｓＨ６ｆｆｆ妇ｓｔｒａｉｎｓ

２

２．１Ｂ．ｓ曲Ⅲｉｓ的转录系统转录系统

多ｄ因子２．１．１

ｄ因子的主要功能是帮助核心酶识别特定的启动子而结合到转录的起始部位，转录开始后ａ因子就不再起作用。迄今，在枯草杆菌中发现了多个ｄ因子，如ｄＡ（营养生长）、ｄＥ、ｄＦ、ｄＧ、ｄＫ（生孢特异性）、ｄＢ、ｄＤ、ｄＨ（平台期）、ｇｐ２８和ｇｐ３３２３４等‘”９３；而大肠杆菌只有盯７０、６３２两种。

２．１．２启动子

表３枯草芽孢杆菌表达载体常用启动子序列比较

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上海农业学报１１７

每个ＲＮＡ聚合酶识别不同的启动子，这些启动子的不同主要表现在保守区域。枯草杆菌盯Ａ识别的启动子一３５区和一１０区与大肠杆菌相似，保守序列分别为“ＴＴＧＡＣＡ”和“ＴＡＴＡＡＴ”［１０］；而带其他ａ因子的ＲＮＡ聚合酶识别的启动子的保守区域与ｄＡ的存在很大差异。迄今发现枯草杆菌启动子的组织主要有两种方式：一是单个的启动子，具有单个启动子的基因大多数在快速生长时期进行表达；另一类为复合启动子（最常见如Ｐ４３），它包括重叠启动子和串联启动子。表达载体常用的启动子见表３。

２．１．３终止子

在大肠杆菌中根据转录终止是否依赖Ｒｈｏ蛋白因子可分为两类，而在枯草杆菌基因转录的终止方面，只有少数几个基因如ｓｐ００Ａ、舻ｆ和ｆ印操纵子等得到很好的研究ｒ３］。它们的终止区都有一个富含Ｇｃ的对称序列，基因转录是在一串Ｔ碱基前终止的。有证据表明，枯草杆菌使用的终止子在结构和序列特征上与大肠杆菌相似，而且也发现大肠杆菌的终止结构在枯草杆菌中同样起作用，如入ｔｏ和，，．胛Ｂ７１２的终止子在枯草杆菌中的应用［１“。

２．２Ｂ．ｓＨ６“胁的翻译系统

２．２．１枯草杆菌ｍＲＮＡ的核糖体连接位点（ＲＢＳ）

与其他原核生物一样，枯草杆菌ｍＲＮＡ的核糖体结合位点（ＲＢｓ）也涉及到ＳＤ序列、ｓＤ序列与起始密码间的间隔区以及起始密码子。枯草杆菌中最典型的ＳＤ序列是“ＧＧＡＧＧ”，而大肠杆菌的为“ＡＡＧＧＡ”［０］。ＳＤ序列与起始密码子的间距有时对基因的翻译效率有明显的影响。一般“ＧＧＡＧＧ”的最后１个Ｇ与起始密码子的间距为７～９个碱基。间隔区的碱基组成也影响翻译效率，通常富含Ａ＋Ｔ的间隔区比富含Ｇ＋Ｃ的翻译效率高１５～５（）倍。

２．２．２革兰氏染色与基因表达

随着穿梭载体的出现，人们发现作为革兰氏阴性菌的大肠杆菌除个别基因外，一般不能直接在革兰氏阳性的枯草杆菌中表达；而枯草杆菌的基因可以在大肠杆菌中表达。Ｋｏｂｅｒｔｓ等ｎ２０对大肠杆菌与枯草杆菌的这种差异研究结果表明：Ｓ１蛋白对枯草杆菌翻译具有重要性。由于枯草杆菌核糖体３０Ｓ亚基缺少Ｓ１蛋白，因而不能翻译大肠杆菌基因Ｌ５ｊ。

３载体

３．１质粒载体

在枯草杆菌中，质粒载体主要有三代。第一代质粒载体主要来自其他革兰氏阳性细菌，特别是金黄色葡萄球菌，其中使用广泛的有ｐＵＢｌｌ０、ｐＣｌ９４、ｐＥｌ９４等ｎ３｜。另外，这些质粒被重组在一起可构成带有双抗标记的嵌合质粒，如ｐＫＣｌ、ｐＫＴｌ、ｐＧＫｌ２等。第二代质粒载体是穿梭质粒，即由上述天然质粒与大肠杆菌质粒ｐＢＲ３２２或其衍生质粒构成的双功能载体¨３｜。第三代质粒载体是由枯草杆菌隐性质粒与大肠杆菌质粒构成的嵌合载体，如ｐＨＢ２０１是由枯草杆菌隐性质粒ｐＴＡｌ０６０与ｐｕＣｌ９构成的穿梭质粒［１４‘。这类载体在连续传代和发酵罐培养中比较稳定。

３．２噬菌体载体

不少噬菌体可用作枯草杆菌的表达载体，如西１０５噬菌体、ｓｐｐｌ噬菌体以及其他噬菌体。

３．３染色体整合载体

采用整合质粒将克隆基因整合到宿主染色体，是克服枯草杆菌质粒不稳定性的一个有效途径。根据整合方式的不同，可分为２种：一种为“Ｃａｍｐｂｅｌｌ”型重组，另一种为“ｑｕａｓｉ．ｒｅｃｉｐｒｏｃａｌ”型重组［”。１６Ｉ。４蛋白质的分泌机理

枯草杆菌蛋白分泌机理与大肠杆菌的相似。但是，由于两菌结构上（如枯草杆菌没有细胞外膜，有厚的细胞壁等）和分泌元件上（如枯草杆菌有ＰｒｓＡ和不同的信号肽酶等）的差异，决定了它们之间存在明显不同。枯草杆菌蛋白分泌的简要过程为：分泌蛋白在细胞质以前体的形式合成后，胞质内的分子伴侣和信号识别颗粒结合其上，与信号肽一起使前体蛋白处于分泌构象状态。在信号识别颗粒受体ＦｔｓＹ的介导下，蛋白前体复合物与ＳｅｃＡ结合。当蛋白前体复合物与ＳｅｃＡ结合后，ＳｅｃＡ水解ＡＴＰ释放能量，在转位酶的作用下，前体蛋白转运到膜外。在转运过程中或转运后很短时问内，信号肽酶（ｓｉｐ）移去前体中的信号肽。随后，在膜外促进蛋白折叠的因子如ＰｒｓＡ、金属离子等的作用下，蛋白折叠成有生物活性的构像形式，释放到培养基中［】“。

１１８王金斌，等：食品级枯草芽孢杆菌表达系统的最新研究进展

５枯草芽孢杆菌常用转化方法

５．１原生质体转化法

原生质体转化技术是２（）世纪６（）年代发展起来的一项重要的分子生物学技术。原生质体转化技术的原理是通过溶菌酶处理细胞破壁，使之成为球状的原生质体，将原生质体与ＤＮＡ混合于高渗缓冲液中，在聚乙二醇（ＰＥＧ）介导下，原生质体与ＤＮＡ发生相互凝聚，进行遗传转化［１…。

５．２化学转化法

１９５８年，Ｓｐｉｚｉｚｅｎ建立了一种枯草芽孢杆菌营养缺陷型突变株染色体ＤＮＡ转化方法，因此化学转化法又称为“Ｓｐｉｚｉｚｅｎ转化”一”一。化学转化法的原理是一定生物量的枯草芽孢杆菌在外界营养条件和钙、镁离子作用下，细胞壁和细胞膜形成缺陷，使外源ＤＮＡ转入枯草芽孢杆菌细胞内［１…。

５．３电转化法

对于大多数微生物来讲，电转化是一种常见的转化效率最高的的转化方法，芽孢杆菌属在１９８９年首次实现了通过电转化方法成功进行转化一二”！。电转化法原理是使用瞬时高电压电击感受态细胞悬液，感受态细胞膜在高压电的作用下发生去极化，产生微孔，悬液中的质粒即可通过细胞膜上的孔洞进入细胞内部。目前芽孢杆菌属最常使用的枯草芽孢杆菌的转化率已经达到了１（）４～１（）６ｃｆｕ似Ｌ。

６外源基因的表达形式

６．１外源基因的细胞外表达

为实现外源蛋白分泌表达，最直接的方法就是将该基因插入到宿主分泌蛋白的表达元件（启动子＋ＲＢＳ）和分泌信号（信号肽序列）的后面。在枯草杆菌中，由于其ａ．淀粉酶和一些蛋白酶被大量分泌到培养基中，因此这些酶基因的表达和分泌元件常被用来构建分泌载体。

６．１．１利于本身的可控元件实现外源基因的可诱导分泌表达

在枯草杆菌果聚糖蔗糖酶（ｓａｃＢ）的启动子和结构基因之间有一茎环结构（ａｓｔｅｍ．１００ｐｓｔｒｕｃｔｕｒｅ），称为ｓａｃＲ区，它是一个受蔗糖调控的转录终止序列。当培养基中没有蔗糖时，果聚糖蔗糖酶的转录在此终止，使该酶不能表达；当培养基中有蔗糖时，ｓａｃＲ区的转录终止作用失效¨５；。

６．１．２利用大肠杆菌的Ｌａｃ元件实现外源基因的可诱导分泌表达

根据大肠杆菌Ｌａｃ操纵子的调控原理，一些学者在枯草杆菌启动子（如ｓｐ０２１、Ｐ２５等）和信号序列之间插入操纵子基因（Ｌ口ｃ０），然后将这些元件与调节基因（Ｌｎｃ，）置于同一质粒或不同质粒中，构建成可调控的分泌表达载体。在ＩＰＴＧ的诱导下，成功地表达了许多外源蛋白。

６．１．３温度诱导的外源基因分泌表达

此类分泌表达载体结构模式与第二种相同（单质粒或双质粒系统）。不同的是调节基因受温度调控，平时调节基因表达的阻遏蛋白结合到操纵基因上，抑制外源基因的表达；当温度升到４２℃或４５℃时，调节基因表达关闭或阻遏蛋白（如ｃ１８５７）温敏失活，从而诱导外源基因的分泌表达口“。

６．２外源基因的细胞内表达

由于枯草杆菌分泌蛋白能力强，对其表达外源蛋白的研究主要集中在分泌表达方面，而对胞内表达的研究涉及较少。但是，从一些试验数据发现，用枯草杆菌胞内表达外源蛋白有相当大的发展潜力。７关于枯草芽孢杆菌最新研究成果

随着枯草芽孢杆菌细胞学、信号元件、分泌通路以及调控系统的研究，对于枯草芽孢杆菌分泌表达系统有了更加全面的认识和理解。近年来，国内外在枯草芽孢杆菌外源基因的分泌表达以及调控因子、操纵子、高表达启动子的调控方面都做了大量的研究，相关的研究性论文越来越多（表４）。枯草芽孢杆菌表达系统作为外源蛋白表达的一个有效工具，正在不断丰富和完善。

上海农业学报１１９

表４国内外关于枯草芽孢杆菌表达系统的最新研究成果

ＴａｂＩｅ４ＴｈｅｌａｔｅｓｔｒｅｓｅａｒｃｈｒｅｓｕｌｔｓｏｆＢ．ｓＨ６“ｆ缸ａｔｈｏｍｅａｎｄａｂｒｏａｄ

８展望

总之，与大肠杆菌（Ｅ．ｃｏ∽等其他原核表达系统相比，Ｂ．ｓ“６ｆｉ凰表达系统具有如下明显优势：（１）是一种食品级安全表达系统；（２）没有明显的密码子偏好性，表达产物不容易形成包涵体；（３）具有很强的蛋白分泌功能，有利于目的蛋白的回收和纯化等后续操作；（４）遗传背景研究比较清楚，并具多年的工业生产技术基础。实践证明：Ｂ．ｓ“６ｆｉｆ妇能够表达多种可溶的且具有生物活性的蛋白质。但是，Ｂ．ｓ“６ｆｉ凰表达系统也存在以下不足：（１）存在限制和修饰系统，重组质粒不稳定；（２）能自发形成感受的菌株极少，感受态持续时间短暂，分子克隆效率低；（３）能够产生大量的胞外蛋白酶，往往造成目的蛋白的大量降解。枯草芽孢杆菌表达系统作为外源蛋白表达的一个有效工具，正在不断丰富和完善。随着研究的不断深入，克服其存在的分泌瓶颈，Ｂ．５“６ｆｊ凰表达系统将成为一种优秀的外源蛋白表达系统。

参

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ｃｒｅａｔｅａｎ考文献ｏｆＢ矗ｃｊｆ拙ｓＹ，Ｆｅｒｒａ“Ｅ，ＨｅｎｎｅｒＤＪ，ｅｔａ１．ｃｌｏｎｉｎｇｏｆｔｈｅｎｅｕｔｒａｌｐｒｏｔｅａｓｅｇｅｎｅｉｎｖｉｔｒｏ－ｄｅｒｉｖｅｄｄｅｌｅｔｉｏｎｓ“ｂｆｉ凰ａｎｄｔｈｅｕｓｅｏｆｔｈｅｃｌｏｎｅｄｇｅｎｅｔｏｍｕｔａｔｉｏｎ［Ｊ］．Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ，１９８４，１６（）（１）：１５—２１．

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１２０王金斌，等：食品级枯草芽孢杆菌表达系统的最新研究进展

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［２１］ＢｒｅｉｔｌｉｎｇＲ，ｓｅｒｏｋｉｎＡｕ，ＢｅｈｎｋｅＤ．Ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ

９９（）。９３：３５．ＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌＭｅｔｈｏｄｓ，１９９９，３４：１８３—１９１．ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｉｎｄｕｃｉｂｌｅｇｅｎｅｉｎ砌ｃⅢ“ｓｓ曲ｆｉ胁ｍｅｄｉａｔｅｄｂｙｔｈｅ１８５７２ｅｎｃｏｄｅｄｒｅｐｒｅｓｓｏｒｏｆｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅｘ［Ｊ］．Ｇｅｎｅ，１

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［２６］ｓｔｅｆａｎＭｎｌｌｅｒ，ＴａｍａｒａＨｏｆｆｍａｎｎ，Ｈｅｌｅｎａｓａｎｔｏｓ，ｅｔａ１．Ｂａｃｔｅｒｉａｌａｂｌ－ｌｉｋｅｇｅｎｅｓ：ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎｏｆｔｈｅａｒｃｈａｅａｌｏｓｍｏｌｙｔｅＮ－ａｃｅｔｙｌ－ｐ－ｌｙｓｉｎｅ

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６８９—６９７．ｓ“６ｆｉ“ｓ［Ｊ］．ＡｐｐｌｉｅｄＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙａｎｄＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２０１１，９１：

［２７］ｗｕｓＭ，ｃｈｉＦｅｎｇ，ｚｈｏｎｇＪ，ｅｔａ１．Ｅｎｈａｎｃｅｄｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎｏｆｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｎａｔｔｏｋｉｎａｓｅｉｎ砌ｃｆ池ｓｓ曲删帕ｙｐｒｏｍｏｔｅｒｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ［Ｊ］．

ＷｏｒｌｄＪｏｕｒｎａｌｏｆＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙａｎｄＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２０１１，２７：９９—１０６．

［２８］ＪｅｏｎｇＨｙｕｎＫｉｍ，ＢａｅｋＲａｋＬｅｅ，Ｙｏｕｎｇ．ＰｈｉｌＬｅｅ．ｓｅｃｒｅｔｏｒｙｏｖｅｒｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎｏｆｔｈｅａｍｉｎｏｐｅｐｔｉｄａｓｅｆｒｏｍ

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Ｌｅｔｔ，２０１２，３４：２２５３—２２５８＿ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ．日ｎｃｆｆｆ“５ｓ“ｂｆｆ“ｓｂｙｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｎｇｉｎｄｕｃｉｂｌｅｐａｔｈｗａｙｓ［Ｊ］．ＢｉｏｔｅｃｈｎｏＩ

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ａｎｄＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２０１３，９７（１５）：６８（）３—６８１１．

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｛・Ｈ・Ｈ・Ｈ・Ｈ・Ｈ・｝｛・Ｈ・Ｈ・Ｈ・Ｈ－Ｈ・Ｈ・Ｈ・Ｈ・Ｈ・Ｈ・Ｈ・｝｛・Ｈ－Ｈ・｝｛・Ｈ・Ｈ・Ｈ・Ｈ・Ｈ・Ｈ・Ｈ・Ｈ・Ｈ・｝｛・Ｈ・Ｈ・Ｈ・Ｈ・Ｈ・Ｈ・Ｈ・｝｛・卜｛・Ｈ・Ｈ・Ｈ・Ｈ・Ｈ‘Ｈ‘Ｈ．｝农产品质量安全信息摘编

解读中央一号文件：更加注重粮食品质和质量安全

中共中央、国务院近日印发了２０１４年中央一号文件《关于全面深化农村改革加快推进农业现代化的若干意见》。对此，中国人民大学农业与农村发展学院副院长郑风田表示，继中央经济工作会议上“粮食安全”被前所未有地放在首要地位后，２０１４中央一号文件再次强调完善国家粮食安全保障体系，更加注重粮食品质和质量安全。

中央一号文件全面定调２０１４年及今后一个时期农业农村工作，这已是中央一号文件连续１１年聚焦三农，体现了农业在我国不可动摇的基础地位。郑风田认为，重视粮食安全，不再单单是指粮食的数量安全，而是更加重视农产品质量和食品安全。过去几年的一号文件中，农产品质量和食品安全提到并不多，２０１４年中央一号文件对此有了很多部署。“以我为主、立足国内、确保产能、适度进口、科技支撑”的国家粮食安全战略成为一号文件提及的重中之重。（邵毅整理；来源：新华网）

食品级枯草芽孢杆菌表达系统的最新研究进展

作者：

作者单位：王金斌， 陈大超， 李文， 蒋玮， 李鹏， 张倩倩， 唐雪明， WANG Jin-bin， CHEN Da-chao， LI Wen ， JIANG Wei， LI Peng， ZHANG Qian-qian， Tang Xue-ming王金斌,WANG Jin-bin(上海市农业科学院生物技术研究所,上海 201106;农业部转基因植物环境安全监督

检验测试中心,上海 201106)， 陈大超,蒋玮,李鹏,张倩倩,CHEN Da-chao,JIANG Wei,LI Peng,ZHANG

Qian-qian(上海市农业科学院生物技术研究所,上海,201106)， 李文,LI Wen(上海市农业遗传育种重点

实验室,上海,201106)， 唐雪明,Tang Xue-ming(上海市农业科学院生物技术研究所,上海 201106;农业部

转基因植物环境安全监督检验测试中心,上海 201106;上海市农业遗传育种重点实验室,上海 201106)

上海农业学报

Acta Agriculturae Shanghai

2014,30(1)刊名：英文刊名：年，卷(期)：

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引用本文格式：王金斌. 陈大超. 李文. 蒋玮. 李鹏. 张倩倩. 唐雪明. WANG Jin-bin. CHEN Da-chao. LI Wen. JIANG Wei. LI Peng. ZHANG Qian-qian . Tang Xue-ming 食品级枯草芽孢杆菌表达系统的最新研究进展[期刊论文]-上海农业学报 2014(1)