焦化废水强化处理的方法

炼焦企业生产过程产生的焦化废水中含有喹啉类氮杂环化合物，是典型的有毒难降解污染物[1, 2]，也是造成其出水不能达标的关键因素[3, 4, 5]. 这主要是由于： ①传统活性污泥法和生物膜法中所含多数微生物的酶系统不能识别喹啉的结构，因此很难将其去除[6]; ②含喹啉单元的化合物对许多微生物有毒害或抑制作用，从而影响其他污染物的去除效果. 采用生物强化技术，投加对目标污染物具有较强降解能力的微生物，可缩短处理系统驯化微生物的时间[7]; 有利于解除该污染物对其他微生物的抑制作用，加快其他污染物的去除. 国内外学者已筛选到一些喹啉降解菌，如Rhodococcus sp.、 Comamonas sp.、 Burkholderia picekttii、 Pseudomonas sp.等，并对其喹啉生物降解动力学和降解途径[8, 9, 10, 11, 12]及其在焦化废水生物强化处理的应用进行了研究[13, 14]. 这些研究对认识喹啉的降解机制和强化废水中喹啉的降解有积极的作用，但有关Acidovorax sp.菌的研究主要见于对苯酚及苯衍生物的降解[15, 16, 17, 18]，以喹啉为唯一碳源的研究报道仅见于Zhang等[19]对一个喹啉反硝化反应器中细菌群落结构的研究，目前该菌株对喹啉降解特性的研究未见报道.

本研究以某焦化厂废水处理系统曝气池中的活性污泥为菌源，筛选到1株对喹啉具有高效降解能力的Acidovorax sp.菌株，发现该菌能同时降解异喹啉、 苯、 吡啶、 苯酚等广泛存在于焦化废水中的芳香族化合物，并将其应用于实际焦化废水的处理，以期为后期利用该菌对焦化废水进行生物强化处理的工业化应用提供良好的生物材料和技术支持.

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验菌源

喹啉降解菌DQS-01： 从某焦化厂污水处理系统曝气池活性污泥样品中筛选. 苯酚降解菌D2： 本实验室分离筛选的高效苯酚降解菌，经鉴定为睾丸酮丛毛单胞菌Comamonas testosterone[20].

1.1.2 培养基

对文献[21]所提供的无机盐培养基配方进行改良，在微量元素储备液中去掉NiCl2 ·6H2O和CoCl2 ·6H2O，改良的喹啉无机盐培养基配方如下： Na2HPO4 4.26 g，KH2PO4 2.65 g，MgSO4 ·7H2O 0.2 g，CaCl2 0.02 g，MnSO4 ·7H2O 0.002 g，微量元素储备液1 mL(主要成分： FeCl2 ·4H2O 1.5 g ·L-1，CuCl2 ·2H2O 0.002 g ·L-1，MnSO4 ·7H2O 0.1 g ·L-1，Na2MoO4 ·2H2O 0.024 g ·L-1，ZnCl2 0.006 g ·L-1，H3BO3 0.07 g ·L-1)，去离子水1000 mL，pH=7.0. 灭菌后加入一定量喹啉(0.22 μm微孔滤膜过滤)作为菌种生长的唯一碳源和氮源.

LB培养基： 酵母膏5 g，蛋白胨10 g，NaCl 10 g，琼脂粉10 g，蒸馏水1000 mL，pH=7.0.

1.2 菌种的筛选分离

将采集的活性污泥样品加入无菌水中，在30℃、 150 r ·min-1的摇床培养箱中培养24 h，静置后取10 mL上层清液接种于90 mL LB培养基中培养24 h; 然后以喹啉为唯一碳源和氮源，按10%的接种量将培养液转接至无机盐培养基上进行反复驯化. 喹啉溶液的初始浓度为50 mg ·L-1，以50 mg ·L-1梯度逐渐增大喹啉浓度至1000 mg ·L-1，筛选可以在改良的喹啉无机盐培养基上进行生长的菌落，经平板划线法分离纯化得到纯菌落.

1.3 菌种鉴定

形态学观察. 将最终筛选得到的纯菌落划线接种于LB 固体培养基，30℃ 倒置培养24 h，观察菌落形态; 挑取菌体进行革兰氏染色，用荧光倒置显微镜(LEICA DMI400B)观察菌体形态特征.

生理生化实验. 参照文献[22]进行实验并对菌种进行鉴定.

分子生物学鉴定. 菌种的分子生物学鉴定由大连TaKaRa生物工程公司完成，通过对该菌株的16S rRNA基因进行扩增后对扩增产物进行测序，得到的序列与GenBank数据库中的类似序列进行Blast比对，从而确定其分类地位.

1.4 分析方法

1.4.1 菌体生物量的测定

采用称重法测量，取5 mL发酵培养液，用带有0.22 μm滤膜的针筒式过滤器进行过滤，经蒸馏水洗涤3次，80℃烘干至恒重后测量.

1.4.2 喹啉降解率的测定

参考文献[23, 24]，采用紫外可见分光光度计(Biol-140，美国PE)在277 nm下检测样品中喹啉浓度. 以未加菌的灭菌喹啉无机盐培养基为空白对照，将喹啉初始浓度记为A0，t时间后的喹啉浓度记为At，则：

　　1.4.3 COD降解率的测定

采用密封催化消解法[25]，利用化学耗氧量测定仪(HH-6型，中国姜堰)进行COD的测定. 将溶液初始COD记为c0，t时间后COD记为ct，则：

　　1.5 环境因素对DQS-01菌降解性能的影响

挑取纯培养菌落接种于500 mL LB培养基中过夜培养，使菌体活化及增殖. 将该菌液4000 r ·min-1下离心，沉淀用无菌水清洗3次以去除表面杂质，再转移至无菌水中制备成一定浓度的菌悬液(生物量为150 mg ·L-1左右). 按一定的接种量加入到喹啉无机盐培养基(喹啉初始浓度为300 mg ·L-1)中，在不同摇瓶转速、 初始pH、 温度下振荡培养. 每组实验做三组平行试样，以未加菌的喹啉在同等条件下作为空白对照.

1.6 DQS-01菌降解谱范围分析

以苯酚、 苯、 喹啉、 异喹啉、 吡啶为碳源底物，(NH4)2SO4为氮源，调整培养基中碳源与氮源的含量，使菌体生长初始C/N为5/1，取接种量5%，35℃、 150 r ·min-1振荡培养. 同时设未加菌的灭菌培养液为空白对照.

1.7 DQS-01菌对实际焦化废水的生物强化实验

1.7.1 MBBR的启动挂膜及稳定运行

采用直接低浓度启动挂膜方法[26, 27]，将来自焦化厂曝气池污泥置于实验室自制的MBBR反应器中[28]，曝气24 h(曝气量为0.3 m3 ·h-1，以下同)，将焦化厂调节池出水用蒸馏水稀释，使其COD浓度约为 150 mg ·L-1，加入填料(Mutag BiochipTM，德国)进行曝气，使活性污泥与填料(填充率为5%)[29]充分接触; 48 h后弃掉部分混合液，再加入经稀释后的焦化废水，让COD浓度保持在150 mg ·L-1左右; 采用持续增长进水浓度的方式以促进生物膜的增长成熟. 整个系统挂膜成功及稳定运行约需40 d左右，此时焦化废水进水COD浓度约为600 mg ·L-1.

1.7.2 生物强化实验

将活化的DQS-01菌、 DQS-01菌及本课题组筛选的高效苯酚降解菌D2所组成的混合菌株(生物量为1 ∶1)按接种量为10%(菌液/焦化废水，体积比)的比例投入反应器中，按照1.7.1节的方法使MBBR处于稳定运行状态后，以不投加降解菌的MBBR对焦化废水的降解为空白对照，考察DQS-01及D2菌对焦化废水的生物强化效果.

2 结果与分析

2.1 菌种分离、 筛选及鉴定

通过不断增加无机盐培养液中喹啉浓度，最终筛选到1株以喹啉为唯一碳源、 氮源及能源进行生长的菌株，该菌株在喹啉浓度为50~600 mg ·L-1的培养液中生长良好，当喹啉浓度大于600 mg ·L-1时，菌体生长缓慢直至不再生长.

该菌株在无机盐平板培养基上呈规则圆形，边缘整齐，表面光滑，菌落透明至乳白色，直径1.0~5.0 mm. 经革兰氏染色后在显微镜下观察呈阴性，菌体细胞呈短杆状，有的成对出现，大小为 (0.3～0.8) μm×(1.5～5.0) μm. 同时，对DQS-01菌进行生理生化鉴定，结果如表 1所示，确定该菌属于食酸菌属(Acidovorax sp.). 结合其16S rRNA基因序列分析，将该基因序列登录到NCBI数据库(登录号为KP126996)，得到的结果是该菌与燕麦食酸菌Acidovorax avenae相似度高达100%.

　　表 1 DQS-01菌的生理生化实验结果

2.2 DQS-01菌生长及对喹啉的降解

以15%的接种量将DQS-01接种到初始喹啉浓度为300mg ·L-1的无机盐培养基中，在120 r ·min-1、 30℃条件下恒温培养，每隔一段时间取样测菌体生物量及喹啉降解率. 实验结果如图 1所示，DQS-01菌在接种后能很快适应初始浓度较高的喹啉培养基并迅速进入对数生长期，48 h菌体生物量达到最大; 这段时间内喹啉的降解速率也最大. 因此，在考察各种环境因素对该菌降解性能影响实验中均在菌体培养48 h时取样.

　　图 1 DQS-01菌的菌体生长曲线与喹啉降解率关系

2.3 环境因素对DQS-01菌降解性能的影响

2.3.1 接种量对喹啉降解性能的影响

按1.5节所述，以1%、 5%、 10%、 15%的接种量将DQS-01接种到喹啉无机盐培养基中，30℃、 120 r ·min-1振荡培养48 h后，测定菌体生物量的变化及对喹啉的降解，实验结果如图 2(a)所示，接种量对喹啉降解率的影响较少; 而对菌体生长量的变化影响较大. 接种量为1%时，底物浓度相对较高，使菌体生长受到抑制，菌体生物量增长较慢导致其喹啉降解率不高; 当接种量大于10%时，菌体增殖速率加快，但由于菌体呼吸旺盛，体系溶解氧消耗过快会导致菌体较早进入衰退期，影响喹啉降解. 综合考虑菌体生长及对喹啉的降解情况，选择10%为最佳接种量.

　　图 2 环境因素对DQS-01菌降解性能的影响

2.3.2 摇瓶转速对喹啉降解性能的影响

按10%的接种量将DQS-01接入喹啉无机盐培养液中，30℃恒温培养，考察转速对喹啉降解性能及生物量的影响. 实验结果如图 2(b)所示，当转速较低时，溶解氧少，生物量及喹啉降解率都比较低; 随着转速的提高，溶解氧增多，此时菌体生长较快，菌体呼吸旺盛，喹啉降解率也有所提高; 但当转速达到200 r ·min-1时，过高的氧分压可能导致菌体生长提前进入衰退期或者对菌体产生毒害作用[30]而导致喹啉降解率下降. 因此，确定150 r ·min-1为最佳摇床转速.

2.3.3 初始pH值对喹啉降解性能的影响

分别用1 mol ·L-1 HCl和NaOH调整无机盐培养液的初始pH为6.0、 7.0、 8.0、 9.0和10.0，接种量10%、 150 r ·min-1、 30℃恒温培养，考察不同初始pH条件下菌种生长及喹啉降解性能. 从图 2(c)、2(d)可以看出，喹啉降解所需的最适pH与菌体生长的最适pH不同. 菌体生长的最适pH为7.0，而该菌在初始pH值为6.0~10.0的条件下对喹啉都有一定的降解，且在初始pH为中性及碱性条件下对喹啉的降解效果较好. 在不同的酸碱体系中，DQS-01的代谢途径可能会有所不同. 初始pH为微酸性和中性时，体系pH变化较小; 初始pH值为碱性溶液的体系随着培养时间的延长pH不断降解从而向中性靠近[6]. 由于焦化废水水质偏碱性，故初始pH应调整至8.0~10.0为宜，这与王培明等[31]的研究结果相同.

2.3.4 环境温度对喹啉降解性能的影响

在接种量10%、 初始pH 8.0、 150 r ·min-1条件下考察温度对喹啉降解性能及生物量的影响. 如图 2(e)所示，菌体可在25~45℃范围内生长，对环境温度的适应性较宽. 但随着培养温度的升高，其喹啉降解率及菌体生物量都受到一定影响. 当培养温度为35℃时DQS-01菌对喹啉降解率最高，菌体生物量也最大，因此确定35℃为最佳降解温度.

2.4 DQS-01菌株降解谱的研究

在实际废水处理系统中除喹啉外有多种污染物并存，对底物利用的广谱性更有利于菌的生存以及实际应用. 从图 3可知，DQS-01对不同芳香族化合物的降解程度由易到难依次为： 喹啉>异喹啉>苯>吡啶>苯酚. 从图 3(b)菌种进入对数生长期的时间来看，DQS-01能迅速利用喹啉及异喹啉，其次是吡啶，在以苯酚为碳源时菌体生长速度最慢. 这一现象与以苯酚类化合物为主要成分的焦化废水系统中，喹啉类化合物很难被降解相一致. 这可能是由于苯酚在代谢过程中所产生的代谢产物对喹啉降解酶系的活性有抑制作用.

　　图 3 不同底物对DQS-01菌COD降解率及菌体生物量的影响

2.5 DQS-01菌对喹啉的降解动力学

在上述获得的最佳环境影响因素条件下，研究了DQS-01以喹啉为唯一碳源、 氮源和能源的降解动力学. 在不同初始喹啉培养液中，用Haldane方程[式(1)所示]对该菌株的降解动力学进行了模拟.

　　式中,μ为细胞比生长速率(h-1); μmax为细胞最大比生长速率(h-1); S为限制性底物质量浓度(mg ·L-1); KS为半饱和系数(mg ·L-1); Ki为底物抑制系数(mg ·L-1),Ki越高则反映底物抑制作用越不明显.

选择喹啉初始浓度范围为100~600 mg ·L-1，以μ-S作图，实验结果如图 4所示. 随着喹啉初始浓度的增加，菌体的比生长速率呈现先增大后减小的趋势; 当喹啉初始浓度为202mg ·L-1时，菌体的比生长速率最大. 这是由于低喹啉浓度对菌体的抑制作用较弱; 当喹啉浓度增加，菌体生长受到的抑制越来越强烈，比生长速率迅速下降. 运用Origin软件处理实验数据，用非线性最小二乘法对实验点进行拟合，得到Haldane方程动力学参数为：

μmax=0.640 h-1，KS=164 mg ·L-1，

Ki=253mg ·L-1 (R2=0.977)

　　图 4 实验数据与Haldane模型回归曲线

2.6 DQS-01菌对焦化废水降解的生物强化效果

为进一步了解DQS-01菌在实际焦化废水处理中应用的可行性，按1.7.2节所述将菌株投入实验室稳定运行的MBBR中，实验结果如表 2所示.

　　　　表 2 DQS-01高效喹啉降解菌对焦化废水降解生物强化效果1)

(1)对照组 焦化废水的降解主要来自填料对污染物的吸附及生物膜上各种微生物的降解作用. 当系统运行至60 h时，降解率和降解速率达到最大; 但随着系统运行时间的延长，附着在填料上生物膜开始增厚并从填料上解离下来，而且随着焦化废水中易降解有机物的减少，难降解有机物对系统中微生物的毒害作用进一步加剧，使COD降解率和降解速率有所下降.

(2)单独投加DQS-01菌 在系统运行的0~12 h内焦化废水COD降解速率较慢，这主要是由于焦化废水中含量最高的苯酚类化合物的存在抑制了DQS-01菌的生长，此时苯酚类化合物的抑制作用占主导地位; 随着降解时间的延长，苯酚类化合物浓度逐渐降低，其抑制作用被逐渐解除，COD降解速率逐渐提高至36 h达到最大，这与2.3节的结论一致. 运行36 h后，系统中苯酚类化合物已基本被降解，其他污染物对DQS-01菌的抑制作用占主导，因此COD降解速率开始下降.

(3)单独投加本课题组筛选的高效苯酚降解菌D2 前12 h内COD降解速率最快，这是由于该菌株对苯酚类化合物降解性能较好，能在较短时间内将苯酚化合物降解掉. 当系统运行48 h后，体系内苯酚类化合物浓度变小，喹啉类化合物对D2菌生长的抑制作用越来越明显，降解速率开始变得缓慢，至72 h时焦化废水COD降解率仅为78.2%.

(4)投加混合菌株 在MBBR中添加单一高效降解菌对焦化废水降解效果不是十分理想. 因此本实验将高效菌株混合后用于焦化废水处理，结果发现混合菌株在焦化废水降解过程中有很好的协同作用——高效苯酚降解菌的存在解除了苯酚类化合物对喹啉降解菌的抑制作用; 而喹啉菌对喹啉的降解也降低了喹啉类化合物对苯酚降解菌的毒害作用. 在系统运行60 h后，对焦化废水COD的降解率达到84.2%，出水COD值为93.8 mg ·L-1，已经达到炼焦工业污水排放的一级标准; 当系统运行72 h后，COD降解率达到87.4%.

3 结论

从焦化厂活性污泥中筛选得到1株能以喹啉为唯一碳源、 氮源、 能源的革兰氏阴性细菌DQS-01菌株. 该菌株经形态学观察、 16S rRNA序列分析和系统发育分析鉴定为Acidovorax sp.，具有降解异喹啉、 苯、 吡啶、 苯酚等芳香族化合物的能力，降解谱较广，可在喹啉浓度为50~600 mg ·L-1的溶液中生长，具有较高的耐受能力. 利用该菌株与D2菌株的协同作用，在MBBR系统中对实际焦化废水中进行生物强化处理，系统运行60 h后其COD降解率可达84.2%，出水COD值为93.8 mg ·L-1，已经达到了炼焦工业污水排放的一级标准.(来源及作者：太原理工大学煤科学与技术省部共建国家重点实验室培育基地 李静、李文英)