枯草芽孢杆菌FS106杆菌肽发酵培养基优化

枯草芽孢杆菌FS106杆菌肽发酵培养基优化

杆菌肽(acitraein)，是由美国哥伦比亚大学Johnson等人在1943年从一名患者的胫骨创伤污染中分离到一株产生抗菌物质的细菌——地衣芽孢杆菌，经发酵取得的成品，1948年由Upjorm公司投产，称Baeitracin，商品名为Baciquent。由于该物质是由杆菌产生的多肽，故中文译名为“杆菌肽”。

杆菌肽又名枯草菌素、枯草菌肽、崔西杆菌素。杆菌肽A的分子式：C66H103N17016S。杆菌肽实际上是几种相似多肽组分的混合物，通过其中的某些氨基

酸来区别。杆菌肽的结构是由12个氨基酸组成含有噻唑环的多肽复合体，它是多种氨基酸结合而成的不稳定的多肽，含A、A1、B、C⋯⋯G等多种组分，以A为主。杆菌肽易溶于水，系白色粉末。在pH5.7水溶液中可稳定存在4周。杆菌肽可与多数金属离子生成络合物，并在干燥状有杆菌肽4.2万单位，为淡黄色至淡棕黄色粉末，无嗅、味苦。在吡啶中易溶，乙醚中略溶，在水、甲醇、氯仿、丙酮中几乎不溶。

杆菌肽是目前国内外广泛用于饲料中的一种新型的理想广谱抗菌素，它能够有效抑制G+和G-细菌，如金黄色葡萄球菌、链球菌等，具有抗菌谱广、畜禽吸收量少、排泄快、安全性评估良好、不产生耐药性等很多优良特性，是饲料添加剂中传统抗生素的有效替代品，已被应用于生物表面活性剂、饲料添加剂、食品防腐剂和作为生物学的研究工具。

目前杆菌肽的工业生产主要通过微生物发酵法制得，地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)是目前广泛应用的工业生产菌种。杆菌肽的发酵生产过程国外报道较多，国内相关报道不多，且发酵水平不高。我国的杆菌肽发酵生产始于20世纪60年代，1967年华北制药厂首先在国内生产杆菌肽，不久因故停产。随着我国畜牧养殖业的兴起，杆菌肽于上个世纪90年代开始大量生产，以芽孢杆菌为菌种，玉米和豆粕为主要原料，通过生物发酵、锌络合制备而成。我国天津新星兽药厂选育获得的高产菌株，生产能力为700μg／mL，与国外报道1200μg／mL的水平相差还是很多。国内杆菌肽发酵工业的生产水平亟待提高。

微生物的代谢分为初级代谢与次级代谢，杆菌肽属次级代谢产物。初级代谢贯穿于生命活动的始终，与菌体生长水平平行进行。而次级代谢一般只在菌体对数生长后期或稳定生长期进行。因此，此类微生物的生长和次级代谢过程可以划分为两个阶段，即菌体生长阶段和代谢产物合成阶段。杆菌肽在合成阶段形成的次级代谢途径。

但是，培养条件的改变可改变次级代谢产物的合成时期。在生长阶段菌体生长迅速，中间产物很少，当容易利用的氮、磷、糖消耗到一定量之后，菌体生长速度减慢，菌体内某些中间产物积累，原有酶活力下降或消失，导致生理阶段的转变，即由菌体生长阶段转向次级代谢产物合成阶段。此时，原来被阻遏的次级代谢的酶被激活或开始合成。如果在菌体生长阶段终了后立即加入蛋白质，这些酶便不能合成，次级代谢过程将不能进行。

有研究得出选用肉汤胰蛋白胨培养基、肉汤鱼蛋白胨培养基、豆芽汁培养基(此三种实验室常用)、黄豆粉培养基(目前工业生产选用)进行发酵，其中豆芽汁培养基发酵的杆菌肽所得抑菌圈最大，与其他发酵液差异较显著，说明培养基的营养成分不同，发酵效果不同；通过对加复合盐与未加复合盐的豆芽汁培养基发酵比较，差异不明显，可见豆芽汁培养基营养十分丰富。从不同蛋白胨的肉汤培养基所产杆菌肽的量进行分析．表明不同氮源对杆菌肽产量影响大。另外，培养

基中碳源越高，氮源相对低，可控制菌数的增加，有利于杆菌肽的形成，但如果碳源过高，杆菌肽的形成反而下降，可能是由于糖浓度过高，使培养液的粘稠度增加，发酵液溶解氧减少，从而降低了菌体细胞膜的通透性，影响了菌的正常代谢。导致杆菌肽产量下降。

某课题组在成功分离到一株产杆菌肽的枯草芽孢杆菌 FS106基础上，对该菌株产杆菌肽的发酵培养基进行优化，以期提高杆菌肽的发酵水平。 研究的方法和途径

材料与方法

1 材料

1．1 供试菌种 指示菌种：金黄色葡萄球菌，为本实验保藏。生产菌种 ：枯草芽孢杆菌 FS106，为本实验保藏。

1．2 培养基 斜面培养基(g／L)：牛肉膏 3，蛋 白胨 10，NaC15，琼脂 20，pH7．0～

7．2；种子培养基 ：斜面培养基去除琼脂制备而成 ；初始发酵培养基( L)：玉米粉 5，黄豆粉10，(NH 1，牛肉膏 5，酵母膏 1，NaC15，pH7．0—7．2。 4)2SO4

2 方法

2．1 液体发酵培养 种子发酵培养 ：将枯草芽孢杆菌FS106活化斜面接一环至 50mL种子培养基(250mL三角瓶 )，30℃、230r／min培养 15h。二级发酵培养：取 1mL种子液至 50mL发 酵培养基(250mL三角瓶)，30℃、230r／min振荡培养 36h。

2．2 发酵无菌滤液制备 取一定的发酵液 ，用离心机(9000r／min)离心 15min，上清液用细菌滤器 (0．45μm)过滤 ，得到发酵液的无菌滤液 ，进行抑菌活性的测定。

2．3 杆菌肽抑菌活性的测定 I矗 采用抑菌圈指示法测定发酵液杆菌肽抑菌活性，以金黄 色葡萄球菌为指示菌，将 2mL金黄色葡萄球菌的菌悬液加入 6ml 45～50℃的牛肉膏蛋白胨培养基中，迅速摇匀，倒入直径为15cm的无菌平皿中，待凝固后，用打孔器打出直径 2．5mm 的孔洞 ，每孔加发酵液 20μL，室温扩散 30min后置于 37℃恒温箱中培养24h，观察并记录抑菌圈的直径。

2．4 发酵培养基的优化

(1)培养基成分 的单因素优化。

(2)碳源优化：分别用 5g／L溶性淀粉 、葡萄糖 、蔗糖 、麦芽糖 、玉米粉 、柠檬酸 、柠檬酸钠 、Na2CO3 等量代替基础培养基中的碳源，进行杆菌肽发酵，

以确定最佳碳源。

有机氮源优化：分别用 10 L尿素、酪蛋 白、黄豆粉、蛋 白胨、胰蛋 白胨作为基础培养基中的有机氮源 ，采用摇瓶发酵培养条件 ，进行杆菌肽发酵，以确定最佳有机氮源。

无机氮 源优 化：分别用 lg／LKNO3、NaNO 、(NH )：SO4、NHNO 、NHCI作为基础培养基 中的无机氮源 ，进行杆菌肽发酵 ，以确定最佳的无机氮源。 生长因子优化：生长因子 的浓度为 6g／L，分别改变 2种生长因子牛肉膏与酵母膏的比例(6：0、5：1、4：2、3：3、2：4、1：5、0：6)，进行杆菌肽发酵，以确定最佳的生长因子。

(2)Plackea—Burman(简称 PB)试验设计优化 培养基成分。根据培养基成分单因素的实验 ，供试菌种发酵培养基 的影 响 因素包括 玉 米粉、蛋 白胨、KNO，、牛 肉膏 、NaC1、CaCO3 、ZnSO4 ·7H20，实验选用 10因素 2水 平的PB试验

设计，对这 7个因素进行研究 ，另外 3个 因素为虚拟变量 ，用于估计误差。

试验设计 的每个 因素取 2个水平，根据前期实验确定各因素的水平 ，根据常规 PB试验设计要求高水平约取低水平的 1．5倍。试验设计和数据分析皆采用 SAS统计学软件 ，每组试验 3次重复 ，结果取平均值。

结果形式

单因素实验通过测定抑菌圈的大小判定其产量的出最优因子，PB实验选择 N=12的l0因素 2水平的 PB试验设计 ，实验设计与结果见表 1与表2，其中 x4、x7、x9为空白项，用于检验实验误差，根据常规PB试验设计要求高水平为低水平的 1．5倍 。

后面一项（抑菌圈直径）

表2PB实验设计因素水平及显著性

极差R 调整R` 显著性排序

最终得到最佳的培养基配方。

参考文献

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