天山雪莲愈伤组织培养与次生代谢物形成的研究_贾景明

DOI:10.13313/j.issn.1673-4890.2005.07.004

第７卷　第７期２００５年７月

中药研究与信息

Research & Information on Traditional Chinese Medicine

Ｖｏｌ．７，ＮＯ．７Ｊｕｌ．　　２００５

天山雪莲愈伤组织培养与次生代谢物形成的研究

贾景明，吴春福，吴立军，胡高升

（沈阳药科大学中药学院，辽宁　沈阳　１１００１６）

[摘要] 目的：研究不同培养条件对天山雪莲愈伤组织生长及总黄酮产生的影响，探讨组织培养生产总黄酮的可能性。方法：通过脱分化培养获得天山雪莲愈伤组织，并对该组织含有的总黄酮进行测定。结果：在MS+NAA+6-BA培养基上培养10～15d，能获得紫红色愈伤组织，且总黄酮含量较高；温度梯度、NH4NO3浓度、培养基和培养时间对愈伤组织的生长和总黄酮产生均有显著影响。结果：天山雪莲愈伤组织培养条件对总黄酮产生有影响。

[关键词] 天山雪莲；愈伤组织；总黄酮

天山雪莲Saussurea involucrata Kar.et Kir.为菊科Compositae菜蓟族 Trib.Cynareae Less.凤毛菊属Saussurea DC.雪莲亚属植物，生长在海拔2800～3400ｍ雪线附近的高山流石滩、高山沼泽草地、高山草坡以及高山山顶碎石间，是一种高原多年生珍稀草本植物。天山雪莲民间主要用来除寒、壮阳、调经止血、祛痰及治疗风湿关节炎、痈疮肿毒和高山反应等病症。现代药理研究表明天山雪莲具有抗炎镇痛、抗癌、扩张血管、降血压、清除自由基、抗疲劳、终止妊娠和收缩子宫等作用[1]。天然天山雪莲次生代谢产物成分复杂，具有药理活性的化合物主要集中在黄酮、生物碱和多糖类[2,3]。研究发现，天山雪莲总黄酮和总生物碱具有较强的抗炎、镇痛、抗辐射和扩张血管作用[4,5]。天山雪莲为高山特有品种，通过对其化学成分和药理活性分析比较发现，特定生长环境对该植物体内特殊成分的形成、积累和遗传有着特殊作用，因此实现其人工栽培较难，加上人为盲目采挖，致使目前雪莲资源日益匮乏，雪莲物种濒临灭绝。运用植物组织培养技术进行雪莲次生代谢产物生产的研究越来越受到人们

公司），光照控温培养箱 （HPG－280B，哈尔滨东联电子技术公司），超净工作台（HD－1360，哈尔滨东联电子技术限公司），电子分析天平（FA2004，上海天平厂），HPLC系统（日本岛津），紫外-可见分光光度计(723型，沈阳天美达科学仪器有限公司)。

MS[6]培养基母液、甘氨酸、肌醇、6－BA、NAA、蔗糖、TRYPTONE、酵母粉、蔗糖均为分析纯试剂，75％乙醇。1.3 愈伤组织培养

1.3.1 植株的诱导 将天山雪莲的种子用75%酒精消毒30s，然后用0.1%氯化汞溶液消毒8min，无菌水冲洗4次，用消毒好的滤纸吸干水分后，接种于培养基上。培养基组成：MS+3.2%蔗糖+0.65%琼脂粉。

1.3.2 愈伤组织诱导 种子萌发后45d长成带叶的幼苗，将叶或茎切成0.5cm长的外植体，平放在愈伤诱导培养基上。培养基组成：MS+3.5mg·L-1NAA+0.55mg·L-1 6－BA+3.2%蔗糖+0.65%琼脂粉；pH=5.8；培养温度：（24±1)℃；光照强度：58.4

m-2·s-1；光照时间：12h·d -1。培养一周后，外的重视。本文研究不同理化因子对天山雪莲愈伤组µmol·

织生长与总黄酮产量的影响，为实现天山雪莲产业植体开始膨大，2周后在切口或叶边缘产生黄白色

的愈伤组织。化大规模培养奠定基础。

1.3.3 愈伤组织继代培养 20～30d后，将黄白色的１　方法

L-11.1 材料 野生天山雪莲药材和种子：新疆维吾尔自愈伤组织在继代培养基（培养基组成：MS+3.5mg·

L-1 6－BA+3.2%蔗糖+0.65%琼脂粉）治区药材公司提供，沈阳药科大学孙启时教授鉴NAA+0.55mg·

上继代培养，其他培养条件同上，15d继代１次，定。

1.2 仪器与试剂 细胞显微照相系统（CK－40－使其转变成紫红色的愈伤组织，同时每3d调查愈伤32PH+ZKD－2，德国OLYMPUS公司），温度梯度培养箱（TG－100－AD5－50，上海保兴生物设备有限

组织的生长量。

1.3.4 愈伤组织分化培养 将继代培养得到的紫红色愈伤

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组织转移到分化培养基（培养基组成：MS+4mg·L-16－BA+2mg·L-1 NAA+3%蔗糖+0.65%琼脂）上进行分化培养。其他培养条件同上。约经20d左右愈伤组织出现芽点，10d后形成再生苗。1.4 愈伤组织检测

1.4.1 愈伤组织鲜重测定 从培养容器中取出天山雪莲愈伤组织，用滤纸吸净其表面水分，称重即得鲜重（FW）。

1.4.2 愈伤组织干重测定 将从培养容器中取出的雪莲愈伤组织置于40℃下真空干燥至恒重，称此时重量即为组织干重（DW）。1.4.3 培养物中总黄酮的分析

1.4.3.1 紫外分光光度法[7] 用紫外分光光度法测定天山雪莲培养物中的总黄酮含量。

1.4.3.2 薄层层析检测法 天山雪莲培养物的乙醇提取液中检测出Rf值为0.15的组分，与芦丁对照品显色斑点位置一致。

1.4.3.3 HPLC检测[8] 流动相：甲醇:水:冰醋酸（40:60:1.0）；检测波长：257nm；流量：1.0 mL·min-1；灵敏度：0.02AUFS；柱温:室温；进样量：10µL。２　实验结果

2.1 愈伤组织多态性对总黄酮产生的影响　培养基组成：MS+3.5mg·L-1NAA+0.55mg·L-16－BA+3.2%蔗糖+0.65%琼脂粉，pH=5.8；培养温度：（24±1)℃；光照强度：58.4 µmol·m-2·s-1；光照时间：12h·d-1的培养条件下，经过3次继代，每次15d，考察了愈伤组织多态性对总黄酮产生的影响，发现培养的天山雪莲愈伤组织出现6种形态：水渍状、白色颗粒状、淡黄色致密状、淡绿色致密状、紫红色团粒状和深紫色团粒状愈伤组织，见图1所示。

淡黄色致密状　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　淡绿色致密状　　　　　　　　　　

水渍状　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　白色颗粒状　　

紫红色团粒状　　　　　　　　　　　　　　　　　深紫色团粒状　　

图１　

愈伤组织的不同形态

下同。)却有明显差异，结果见表1。

由表1可知，培养15d时，深紫色团粒状愈伤组织的细胞生物量最高为45.4gDW·L-1，而总黄酮含量却不是最高，仅为50.1mg·g-1；紫红色团粒状的愈伤组织总黄酮含量高达59.5mg·g-1，高于深紫色团粒状愈伤组织的细胞总黄酮含量，而细胞生物量却低于深紫色团粒状愈伤组织19.8gDW·L-1；水渍状、白色颗粒状、淡黄色致密状和淡绿色致密状的愈伤

这6种愈伤组织在继代培养基上培养都能生长，组织无论是细胞生长量还是总黄酮含量均较低。但其生长量和总黄酮含量(按紫外分光光度法测定，2.2 不同培养基对愈伤组织生长和总黄酮产生的

影响 　为了探讨同一基因型植物在愈伤组织培养时

表１　　不同形态愈伤组织对细胞生长量和总黄酮的影响　对培养基的选择是否存在差异，实验考察了紫红色

-1-1愈伤组织干重 总黄酮含量 天山雪莲愈伤组织在附加3.5mg·L NAA+0.55mg·L愈伤组织形态 -1-1

水渍状 白色颗粒状 淡黄色致密状 淡绿色致密状 紫红色团粒状 深紫色团粒状

/g·L

23.2 27.5 18.3 19.8 35.6 45.4

－１

/mg·g 21.0 31.8 29.2 15.4 59.5 50.1

注：培养基初始接种量为１０．０ｇＦＷ・Ｌ，培养１５ｄ。　

6－BA＋3.2%蔗糖+0.65%琼脂粉的MS、B5、N6、White、Miller和H培养基[9]上分别进行培养。培养条件为：pH=5.8；温度：（24±1)℃；光照强度：58.4 µmol·m－2·s－1；光照时间：12h·d－1；接种量为10.75gFW·L-1，培养15d后调查愈伤组织生长情况和总黄酮含量，结果见图2。

由图2可知，经过15d的培养，愈伤组织在

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弱趋势。

2.4 NH4NO3 对愈伤组织生长和总黄酮产生的影响在MS培养基的无机成分中，N源对愈伤组织生长和总黄酮形成的影响最为明显。实验通过改变培养基中的NH4NO3浓度，考察NH4NO

3对天山雪莲组织生长和总黄酮形成的影响，培养基组成和培养条件同上，结果见图4。

基上愈伤组织的生长量最低为6.8gDW·L-1，相差18.8gDW·L-1。同样，在MS培养基上愈伤组织的总黄酮含量最高为49.5 mg·g-1，最低的为White培养基。从愈伤组织的颜色看，MS培养基上生长的愈伤组织多为紫红色，少数为浅黄色、白色或绿色，在其他培养基上生长的愈伤组织多数呈浅紫色、白色和绿色等。这种差异源于不同培养基大量元素和微量元素浓度的变化导致细胞对培养基表现出的选择性差异，MS培养基中NH4+和NO3-以及全氮的含量较高，其它培养基全氮的差异不大。由实验可知MS培养基比B5、N6、White、Miller和H培养基更适合其愈伤组织的继代生长和总黄酮的产生。

2.3 愈伤组织细胞的生长动态 　将紫红色的愈伤组织细胞团（0.3cm×0.3cm×0.3cm）转接在继代培养基上，培养基组成和培养条件同上。随培养时间的延长，考察天山雪莲愈伤组织生长量的增加与总黄酮含量的相关性，结果见图3。

由图3可以看出，愈伤组织细胞在2～

8d呈延迟生长，8～15d呈对数生长，从培养的第8天开始细胞处于旺盛的分裂状态，到第13天，细胞干重从2.8 gDW·L-1达到16.1 g·L-1，增加了5倍以上。总黄酮含量从32.0 mg·g-1增加到40.1 mg·g-1，增加1.25倍。在培养的第15天细胞干重达到19.5gDW·L-1，

从图4中可以看到，在NH4NO3初始浓度为

1650mg·L-1情况下，随着培养基中的NH4NO3浓度的提高，细胞干重和总黄酮含量随NH4NO3浓度的增加而增加，在2250mg·L-1含量下，总黄酮含量达到最大值60.6mg·g-1。而在2450 mg·L-1含量下，细胞干重达到最大值为33.5gDW·L-1，细胞生物量增加而总黄酮含量却呈下降趋势，总黄酮含量为60.4mg·g-1。当NH4NO3浓度达到2650mg·L-1时，总黄酮含量降为60.1mg·g-1，此时NH4NO3浓度对总黄酮的形成意义不大。表明高浓度的NH4NO3在一定程度上有利于天山雪莲细胞生长和总黄酮的生成。在对KNO3的实验研究中也发现了同样现象。

2.5 温度梯度变化对愈伤组织生长和总黄酮产生的影响 本实验通过对温度梯度的调控，考察了天山雪莲愈伤组织的生物量和总黄酮含量的变化情况，结果见表2。

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表２　　温度梯度变化对愈伤组织生长和总黄酮含量的影响　培养方式　正常培养 培养 温度 梯度

培养温度／℃　24 28 26 24 24 24

培养时间／ｄ　15 1～5 6～10 11～15 16～20 20～25

１５ｄ内的生物量／ｇＤＷ・Ｌ　

25.5 27.4 30.5 35.7 38.5 38.6

－１

总黄酮含量　／ｍｇ・ｇ　49.5 36.0 40.9 73.2 51.1 31.7

－１

裂的多相性，少见形成再生植株。

在培养过程天山雪莲愈伤组织出现的多种形态，不仅表现在外形特征上和继代难易上，更重要的是各类型愈伤组织在分化能力有明显差异，白色和淡黄、绿色愈伤组织均无分化，仅紫红色愈伤组织在一定条件下有分化能力，这可能与愈伤组织细胞的胚性化程度差异较大有关系。因此，对同一种基因型外植体诱导出的愈伤组织，其组织类型是由其组成细胞决定的。当组成细胞的类型比例或者细胞状态发生变化时，愈伤组织就会表现出相应的改变，而通过控制不同状态的细胞比例，即可控制愈伤组织的形态。

培养基组分对愈伤组织诱导和多态性的形成有直接影响，初始愈伤组织是由颜色、质地和形态有明显差异的细胞团块形成的。在实验设计的6种培养基中，仅在MS培养基上诱导的愈伤组织经继代培养得到紫红色愈伤组织。说明MS培养基所含有的各种成分及其配比适合天山雪莲愈伤组织的生长和总黄酮的形成。

实验研究表明，天山雪莲愈伤组织形态、培养基组成和温度梯度变化是影响愈伤组织生物量增加和总黄酮产生的关键。芦丁是培养物中的主要成分，本实验按测定总黄酮含量的常规方法以芦丁作对照品检测了培养物中总黄酮含量。在继代培养中以紫红色为标志，选择有紫红色的愈伤组织进行继代培养是提高天山雪莲愈伤组织总黄酮含量的一个简便有效的方法。通过脱分化培养获得天山雪莲愈伤组织，在培养基组成为：MS+3.5mg·L-1 NAA+0.55mg·L-16－BA+3.2%蔗糖+0.65%琼脂粉，培养条件：pH=5.8；培养温度：（24±1)℃；光照强度：58.4 µmol·m－2·s-1；光照时间：12h·d－1。通过继代培养可获得紫红色愈伤组织，这种愈伤组织细胞分裂旺盛，有效成分产出量大，同时也适合于液体的悬浮培养。

通过对天山雪莲愈伤组织次生物质代谢影响因子的研究发现，愈伤组织生物量是次生代谢物形成的主要的物质基础，培养初期诱导愈伤组织快速增殖，使其达到一定的生长量，在培养的中、后期延缓愈伤组织生长使其形态变得致密，实现有效成分的累积和增加。而温度是影响天山雪莲愈伤组织生物量和有效成分积累的重要环境因子之一。采用温度梯度培养方式即愈伤组织培养温度由28℃到26℃再到24℃梯度递减时，培养周期15d，有利于天山雪莲愈伤组织

注：接种量为１．７５ｇＤＷ・Ｌ－１

结果可知，在正常培养温度24℃条件下，培养15d愈伤组织生物量为25.6gDW·L-1，总黄酮含量为49.5mg·g-1。将愈伤组织首先置于28℃下培养5d，调查细胞生长量比在正常培养温度条件下的细胞生长量高1.9gDW·L-1，总黄酮含量为36.0mg·g-1，低与正常培养的含量13.5mg·g-1。当培养温度由28℃到26℃再到24℃梯度递减时，培养15d调查，细胞生长量达到35.7g·L-1，是正常培养条件下的1.4倍，总黄酮含量达到73.2mg·g-1，是正常培养条件下的1.47倍。当培养时间在15～25d时细胞生物量缓慢增加，有效成分含量则快速降低，分别为38.6g·L-1和31.7mg·g-1。可知培养温度由28℃→26℃→24℃的梯度变化在一定程度上将大大提高天山雪莲培养物有效成分的含量。３　　讨论

实验研究发现，在愈伤组织的形成中，细胞分裂的速度受培养条件中温度的影响较大。温度高，细胞分裂速度快、产生的细胞小，组织衰老、褐化严重；温度低，细胞分裂速度慢，产生的细胞大。适宜的培养温度是（24±1)℃。

天山雪莲愈伤组织的诱导及多态性对器官分化、细胞悬浮培养和天然物质形成都很重要。实验发现：紫红色团粒状的愈伤组织结构松散，生长旺盛，易于培养和继代；深紫色团粒状愈伤组织结构松脆，较致密，生长快，易出胚状体，但这种组织细胞凋亡快，适宜于再分化培养，不利于长期继代培养；水渍状愈伤组织的细胞多为不规则型，细胞内液泡较大，生长缓慢，无光泽，属于衰败型的组织；白色颗粒状愈伤组织在有效的激素调控下通过继代有转变成紫色愈伤组织的可能；淡黄色致密状和淡绿色致密状愈伤组织的细胞生长缓慢，细胞分裂频率低，经常处于芽分化状态。由于细胞分

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的细胞生长和总黄酮的积累，这种现象可能同该物种长期在寒冷条件下生长、发育，其内在基因表达对温度的一种特殊要求。另外，虽有报道培养基中富含大量的NH4NO3有利于细胞生物量的积累和次生代谢物的形成[10]，但在天山雪莲的培养中发现，当培养基中NH4NO3浓度达到2250mg·L-1并逐渐增加时，愈伤组织的总黄酮含量却呈下降趋势，此时增加NH4NO3浓度对总黄酮的形成意义不大。

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