α-淀粉酶的固定化及淀粉水解2
实验6 α-淀粉酶的固定化及淀粉水解作用的检测
高二年级 班 姓名 实验日期：____月 日 【知识准备】 1．背景知识
酶是生物体内各种化学反应的催化剂，它有高度的专一性和高效性。但酶在水溶液中很不稳定，且不利于工业化使用。固定化酶就是将水溶性的酶用物理或化学的方法固定在某种介质上，使之成为不溶于水而又有酶活性的制剂。将固定化酶装柱，当底物经过该柱时，在酶作用下转变为产物。 2．实验原理
本实验是采用吸附法制备固定化酶。
（1）使用的吸附剂是石英砂 ，石英砂是由天然矿石粉碎而成，它的化学成分是二氧化硅，其化学反应活性很低。
（2）使用的α-淀粉酶通常由枯草杆菌深层发酵制备，具有较强的液化淀粉的能力，可用于制备糊精，其最适pH5.5～7.5，最适温度50℃～75℃。 3．各种淀粉酶水解淀粉的反应如下：
α-淀粉酶只将淀粉水解为糊精 ，淀粉溶液加入KI-I 2指示溶液时显现蓝色，而转变成糊精后显现红色。
将吸附有α-淀粉酶的石英砂装柱，使淀粉溶液流过柱，若柱的流出液在加入KI-I 2溶液时可看到溶液呈现红色，表明水解产物中有糊精。
α-淀粉酶制成不溶性的固定化酶后，酶的稳定性增加 ，包括酶对热的稳定性，对蛋白酶的抵抗能力、对各种试剂的稳定性都不同程度地增加。由于稳定性增加，保存期也相应延长，数日内酶活力不减。 4．思考题
① 为什么使用石英砂作为酶的吸附剂？
② 如何证明α-淀粉酶已将淀粉水解？
③ 如何证明洗涤固定化酶的流出液中没有淀粉酶？
【实验目的】
1．制备固定化的α-淀粉酶
2．固定化的α-淀粉酶水解淀粉的测定
【材料用具】
α-淀粉酶溶液，0.5%淀粉溶液，石英砂，5mmol/L KI-I2溶液，蒸馏水 5ml 层析柱 50mL 烧杯， 250mL 烧杯，滴管，玻璃棒，点样板 铁架台
【实验步骤】
一、新制淀粉固定化酶
1．用50ml 小烧杯称取5g 石英砂，加入2ml α–淀粉酶溶液，浸泡10分钟，使α–淀粉酶固定到石英砂上。在等候期间可以先完成实验步骤“二”。
2．用10～15ml 的蒸馏水清洗石英砂后，取清洗液2滴加到点样板上，同时滴加0.5%淀粉溶液混匀，再加入1滴KI-I 2溶液，若溶液变为蓝色，说明未固定到石英砂上的α–淀粉酶已完全除去。反之，需要重复这一步骤。
3．固定有α–淀粉酶的石英砂装入层析柱，将酶柱固定在铁架台上，用滴管加0.5 % 淀粉溶液，使淀粉溶液约以10滴/ 分的流速过柱。
4．将5滴淀粉溶液加入1号点样孔，再滴加1滴KI-I 2溶液，观察颜色变化（对照1）。将5滴清水加入2号点样孔，再滴加1滴KI-I 2溶液，观察颜色变化（对照2）。
5．将流出的反应液每5滴按顺序加在3-12号点样孔中，再加1滴KI-I 2溶液，观察颜色变化（待测样品）。记录实验结果。
6．实验后，用10倍柱体积的蒸馏水洗涤酶柱，放置在4℃冰箱中保存，几天后再重复上述实验，看是否有相同的结果。
二、检验其他班同学几天前制作的固定化酶的催化效果
【结果分析和实验结论】
1．本实验为什么要确定10滴/分的流速？加快流速是否能出现相同的结果？
2．石英砂是怎样固定α-淀粉酶的？你得出此结论的依据是什么？
3．本实验中对照1和对照2各有什么作用？
4．根据实验步骤二的结果，评价一下α-淀粉酶固定化酶的稳定性，并陈述你的理由。
实验结束时，请清理桌面。不要清洗用于固定淀粉酶的烧杯。凡是被发现水池中有石英砂的桌子，学号与该桌号相同的同学，将被扣减一定的分数。 【实验考核】 检查人：
【预习作业】
实验步骤
1．用50ml 小烧杯称取g 石英砂，加入 α–淀粉酶溶液，缓慢搅拌 分钟，使α–淀粉酶固定到 上。
2．用10～15ml 的蒸馏水清洗石英砂，取最后流出的清洗液滴加到点样板上，同时滴加 溶液混匀，再加入KI-I 2溶液，若溶液变为 色，说明未固定到石英砂上的α–淀粉酶已。
3．先把放入层析柱中，再装入固定有的石英砂；将灌注了固定化酶的层析柱放在支架上，用滴管加 溶液，使淀粉溶液约以 的流速过柱。
4．取加入1-2滴KI-I 2溶液，观察颜色变化（样品1）。此份样品的作用是做
5．接收流出的反应液至点样板小孔中，每滴加在一个孔中，再加入1滴。
【课后习题】
1．下列有关酶与一般化学催化剂共同特点的叙述中，不正确的是（ ） A ．用量少而催化效率高 B ．改变了反应的平衡点 C ．反应前后不发生变化 D ．可降低反应的活化能
2．下列有关固定化酶优点的叙述中，不正确的是 （ ） A ．由于固定化酶有一定的机械强度，易实现催化过程的连续化 B ．不太容易从反应体系中有效的分离回收 C ．固定化酶可反复使用 D ．固定化酶的稳定性高
3．用唾液淀粉酶催化淀粉水解实验时，将唾液稀释十倍与用唾液原液实验效果基本相同，这说明酶具有 （ ） A ．专一性 B ．高效性 C ．多样性 D ．稳定性 4．酶是生物催化剂，与非生物催化剂相比，它具有的突出特性是（ ） A ．多样、专一、高效 B ．只在细胞内起作用 C ．化学本质属蛋白质 D ．只能在核酸指导下合成