基因工程基本步骤

基因工程的基本操作程序

自主学习（理知识，固基础）

基

因

工

程

的

基

本

操

作

程

序

主

要

包

括

四

个

步

骤： 、 、 、 。 学点一、目的基因的获取：

1．目的基因：符合人们需要的，编码蛋白质的 。也可以是一些具有 的因子。 2．获取目的基因的方法 (1)从基因文库中获取目的基因

①基因文库：将含有某种生物不同基因的许多 ，导入受体菌的群体中储存，各个受体菌分别含有这种生物的不同基因，称为基因文库。 ②种类

基因组文库：含有一种生物的 基因。

部分基因文库：含有一种生物的 基因，如cDNA文库。 ③目的基因的获取依据：

根据基因的有关信息：基因的 序列、基因在 上的位置、基因的 产物mRNA、基因的翻译产物蛋白质等特性获取目的基因。

(2)利用PCR技术扩增目的基因。

①PCR含义：是一项在生物体外 特定DNA片段的核酸合成技术。 ②PCR原理：DNA 。

③条件：有一段已知目的基因的 序列，以便根据这一序列合成 。

④过程：目的基因DNA受热形成 ，与 结合，然后在_____ ____的作用下进行延伸形成DNA。

⑤方式：每次循环后目的基因的量增加一倍，即成 扩增=2(n为扩增循环的次数)。 (3)人工合成法：如果 ， 已知，可以通过 用化学方法人工合成。

学点二、

基因表达载体的构建──基因工程的核心

1．表达载体的组成： + + + 等。

2．启动子：位于基因的 ，它是 和结合的部位，驱动基因转录产生mRNA，最终获得所需的 。

3．终止子：也是一段有特殊结构的 ，位于基因的 ，终止 。

4．标记基因：鉴别受体细胞是否含有目的基因，从而将 筛选出来。常用的标记基因是 。

5．表达载体的功能：使目的基因在受体细胞中 ，并且 给下一代；同时使目的基因能够_ __和 作用。

6．不同的受体细胞及目的基因导入受体细胞的方法不同，基因表达载体的构建上也会有所差别。 学点三、将目的基因导入受体细胞

(一)转化的概念：目的基因进人受体细胞内，并在受体细胞内 和 过程。

n

(二) 常用的转化方法： 1．将目的基因导入植物细胞 (1)农杆菌转化法

①农杆菌特点：易感染 植物和裸子植物，对____ ___植物没有感染力；Ti质粒的 可转移至受体细胞，并整合到受体细胞的染色体上。 ②转化过程：目的基因插人

农杆菌→导入

植物细胞→目的基因整合到植物细胞染色体上→目的基因的遗传特性得以稳定维持和表达。 (2)基因枪法

基因枪法：是 植物中常用的一种基因转化方法，但是成本较高。 (3)花粉管通道法

花粉管通道法：这是我国科学家独创的一种方法，是一种十分简便经济的方法（我的的转基因抗虫棉就是用此种方法获得的）。植物花粉在柱头上萌发后，花粉管要穿过花柱直通胚囊。花粉管通道法就是在植物进入受体细胞。

2．将目的基因导入动物细胞 (1)方法：显微注射技术。

(2)操作程序：目的基因表达载体 →取卵(受精卵) →显微注射→注射了目的基因的受精卵移植到__ __性动物的_____ __内发育→新性状动物。 3．将目的基因导入微生物细胞

(1)原核生物特点： 、多为 、 相对较少等。

(2)大肠杆菌最常用的转化方法是： 处理细胞→ 细胞→表达载体与感受态细胞混合→ ___ __ 细胞吸收DNA分子。 学点四、目的基因的检测与鉴定 1．检测

①．首先要检测 ，方法是采用 ②其次还要检测 ，方法是采用 。

③最后检测 ，方法是从转基因生物中提取 ，用相应的 进行 。 2．鉴定：进行 的鉴定。如 互动探究（释疑惑，升能力） 探点一、目的基因的获取 问题1．基因的结构是怎样的？ 探究：

受粉后，花粉形成的花粉管还未愈合前，剪去柱头，然后，滴加DNA（含目的基因），使目的基因借助

问题2．为什么要构建基因文库？直接从含有目的基因的生物体内提取不行吗？

问题 3．基因组文库和cDNA文库的主要区别是什么？ 探究：

问题4．PCR技术与DNA复制有何异同？

探究：

探点二、基因表达载体的构建

问题．基因表达载体的构建需要哪些工具酶，如何将目的基因与运载体连接起来形成重组DNA分子（以质粒为运载体）？

问题4．将目的基因与载体混合并用DNA连接酶处理后，会出现几种结果，怎样从中筛选处所需要重组质粒？

问题5．启动子与起始密码子，终止子与终止密码子是否相同，如不同有何区别？ 探究：

探点三、将目的基因导入受体细胞

问题1．将目的基因直接导入受体细胞不是更简便吗？如果这么做，结果会怎样？

问题2．根据农杆菌可将目的基因导入双子叶植物的机理，你能分析出农杆菌不能将目的基因导入单子叶植物的原因吗？若想将一个抗病基因导入单子叶植物，如小麦，从理论上说，你应该如何做？

问题3．培育转基因动物时，受体细胞能否采用动物体细胞，为什么采用受精卵？

问题4．利用大肠杆菌可以生产出人的胰岛素，联系前面有关细胞器功能的知识，结合基因工程操作程序的基本思路，思考一下，若要生产人的糖蛋白，可以用大肠杆菌吗？

问题5．比较将目的基因导入受体细胞方法？

探点四、目的基因的检测与鉴定

问题1．为什么要有“目的基因检测与鉴定”这一步？

问题3．试分析真核生物的基因导入细菌细胞后，不能正常发挥功效的可能原因

问题4． 什么叫DNA分子杂交技术？DNA分子杂交的原理是什么？

考点1． 目的基因获取

1．以重组DNA技术为核心的基因工程正在改变着人类生活，请回答下列问题。 （1）获得目的基因的方法通常包括 、 和

（2）构建基因文库时需要对DNA分子进行切割和连接所使用的酶分别是 和 。

（3）PCR扩增目的基因的原理是 ，前提条件是 ，PCR所使用的酶是 ，该酶具有什么特点？ 。

（4）运送目的基因进入受体细胞的载体一般选用病毒或 ，后者的形状呈

（5）若目的基因是人的胰岛素基因，则获取的可能方法有 ，将人胰岛素基因分别导入大肠杆菌与酵母菌，从两者中生产的胰岛素在功能和 序列上是相同的。

答案：（1）从基因文库中获取 PCR技术扩增 化学合成（人工合成） （2）限制性核酸内切酶（限制酶） DNA连接酶（3）双链DNA复制 有一小段已知目的基因的核苷酸序列 DNA聚合酶 耐高温（4）质粒 小型环状（双链环状、环状）（5）从基因文库中获取 、PCE技术扩增、人工合成 氨基酸 考点2． 基因表达载体的构建

2． 组建理想的载体需要对天然的质粒进行改造。下图是天然土壤农杆菌Ti质粒结构示意图(示部分基因及部分限制性内切酶作用位点)，据图分析：

①人工改造时，要使抗虫基因表达，还应插入________。

②人工改造时用限制酶Ⅱ处理，其目的是：第一，去除质粒上的________基因，保证T－DNA进入水稻细胞后不会引起细胞的无限分裂和生长；第二，使质粒带有单一限制酶作用位点，有利于________________。第三，使质粒大小合适，可以提高转化效率等。

③若用限制酶Ⅰ分别切割改造过的理想质粒和带有抗虫基因的DNA分子，并构成重组Ti质粒。分别以含四环素和卡那霉素的培养基培养已成功导入抗虫基因的水稻胚细胞，观察到的细胞生长的现象是________________________________。

答案：①启动子 ②tms和tmr 目的基因(或外源DNA)准确插入 ③在含卡那霉素的培养基能够生长，而在含四环素的培养基中不能生长 考点3． 将目的基因导入受体细胞

3． 基因工程有广阔的应用前景。回答下列各题：

(1)获取目的基因后，短期内要得到大量目的目的基因，可利用_______________扩增。 (2)构建基因表达载体的过程要使用的工具酶有___________。

(3)受体种类不同，导入方法不同。选育优良动物，目的基因导入的常用方法是__________；选育优良植物，目的基因导入采用最多的方法是_______。目的基因进入动植物细胞并且在受体细胞维持稳定和表达的过程，称为____________________________。

(4)检测目的基因在转基因生物中是否翻译成蛋白质，方法是从转基因生物的体细胞中提取蛋白质，用相应的抗体进行________杂交，看是否有杂交带。

答案：(1)PCR技术 (2)限制性核酸内切酶和DNA连接酶 (3)显微注射法 农杆菌转化法 转化 (4)抗原－抗体

考点4． 目的基因的检测与鉴定

4．苏云金芽孢杆菌的抗虫基因导入棉花细胞是否已表达，其检测方法是（ ）

A．是否有抗生素抗性 B．是否能检测到标记基因 C．是否有相应的性状 D．是否能分离到目的基因 答案：C

练点7． 根据基因工程的有关内容在下列横线上填写适当的文字。

A_______________B_______________ C_______________D_______________ E_______________F_______________ G_______________H________________

答案：A：mRNA B：逆转录 C：限制性内切酶 D：基因组文库 E：cDNA文库 F：重组DNA分子（构建表达载体）G：目的基因导入受体细胞 H：目的基因检测与表达

练点8． 已知SARS是由一种RNA病毒感染所引起的疾病。SARS病毒表面的S蛋白是主要的病毒抗原，在SARS病人康复后的血清中有抗S蛋白的特异性抗体。某研究小组为了研制预防SARS病毒的疫苗，开展了前期研究工作。其简要的操作流程如下：

(1)实验步骤①所代表的反应过程是________________。

(2)步骤②构建重组表达载体A和B必须使用的酶________________________________。

(3)如果省略步骤②而将大量扩增的S基因直接导入大肠杆菌，一般情况下，不能得到表达的S蛋白，其原因是S基因在大肠杆菌中不能________，也不能________。

(4)为了检验步骤④所表达的S蛋白是否与病毒S蛋白有相同的免疫反应特征，可用________与________进行抗原—抗体特异性反应实验，从而得出结论。

(5)步骤④和⑥的结果相比，原核细胞表达的S蛋白与真核细胞表达的S蛋白的氨基酸序列________(填“相同”或“不同”)，根本原因是________________________。

答案： (1)逆转录 (2)限制性内切酶和DNA连接酶 (3)复制 合成S基因的mRNA(或转录) (4)大肠杆菌中表达的S蛋白 SARS康复病人血清 (5)相同 表达蛋白质所用的基因相同

练点9．图为某种质粒表达载体简图，小箭头所指分别为限制性内切酶EcoRI、BamHI的酶切位点，amp

R

R

为青霉素抗性基因，tet为四环素抗性基因，P为启动子，T为终止子，ori为复制原点。已知目的基因的两端分别有包括EcoRI、BamHI在内的多种酶的酶切位点。 据图回答：

（1）将含有目的基因的DNA与质粒表达载体分别用EcoRI酶切，酶切产物用DNA连接酶进行连接后，其中由两个DNA片段之间连接形成的产物有_______________、_______________、_______________三种。若要从这些连接产物中分离出重组质粒，需要对这些连接产物进行_______________。

（2）用上述3种连接产物与无任何抗药性的原核宿主细胞进行转化实验。之后将这些宿主细胞接种到含四环素的培养基中，能生长的原核宿主细胞所含有的连接产物是_______________；若接种到含青霉素的培养基中，能生长的原核宿主细胞所含有的连接产物是_______________。

（3）目的基因表达时，RNA聚合酶识别和结合的位点是___________，其合成的产物是___________。 （4）在上述实验中，为了防止目的基因和质粒表达载体在酶切后产生的末端发生任意连接，酶切时应选用的酶是_______________。

答案：（1）目的基因-载体连接物 载体-载体连接物 目的基因-目的基因连接物 分离纯化（其他合理答案也给分）（2）载体-载体连接物；目的基因-载体连接物、载体-载体连接物（3）启动子 mRNA（4）EcoRI和BamHI（只答一个酶不给分）

练点10． 科学家通过基因工程方法，将苏云金芽孢杆菌的Bt毒蛋白基因转入普通棉株细胞内，并成功实现了表达，从而培育出了能抗棉铃虫的棉花植株──抗虫棉。其过程大致如图所示：

（1）进行基因工程操作的工具酶有 ，将苏云金芽孢杆菌的Bt基因导入棉花细胞内，使棉花植株产生抗虫性状，引起这种新性状产生依赖于 。细菌的基因之所以能在棉花细胞内表达，产生抗性，其原因是____________________________________。

(2) 基因工程的操作程序主要包括的四个步骤是_______________________________________，其核心步骤是________，其目的是使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以________给下一代，同时，使目的基因能够表达和发挥作用。

(3)上述过程中，将目的基因导入棉花细胞内使用的方法是________，这种导入方法较经济、有效。目的基因能否在棉株体内稳定维持和表达其遗传特性的关键是目的基因是否插入到受体细胞染色体DNA上，这需要通过检测才能知道，检测采用的最好方法是________。

（4）Ti质粒是农杆菌中的一种质粒，其上有T-DNA，把目的基因插入Ti质粒的T-DNA中是利用T-DNA的________________________________特点。含有Bt基因的Ti质粒导入棉花细胞是否可以稳定维持和表达其遗传特性，必须进行检测与鉴定。检测目的基因是否导入成功可以检测Bt基因是否转录出了mRNA，这是检测目的基因是否发挥功能作用 。检测方法是 。

（5）抗虫棉的培育过程中，抗虫基因的受体细胞可以是棉花的一般体细 。最后检验培育的棉花是否抗虫，常用的方法是 。

答案：（1）限制酶和 DNA连接酶 基因重组或重组DNA 它们共用一套遗传密码

(2)目的基因的获取 基因表达载体的构建 将目的基因导入受体细胞 目的基因的检测与鉴定 基因表达载体的构建 遗传(3)农杆菌转化法 DNA分子杂交技术（4）可转移至受体细胞并且整合到受体细胞的染色体DNA上 第一步 从转基因棉花细胞内提取mRNA，用标记的目的基因作探针与mRNA杂交，如果显示出杂交带，则表明目的基因转录出了mRNA

（5）分化的植物细胞具有全能性 用培育的棉花的叶等器官喂食害虫，观察害虫的生活情况