大肠杆菌为何能用来生产胰岛素

1．问题提出：

在一次模拟考试中有一道试题需判断能否将胰岛素基因导入大肠杆菌用来生产胰岛素。教材中明确提到：1978年，科学家将人体内能够产生胰岛素的基因与大肠杆菌的DNA重组，并且在大肠杆菌内获得成功的表达（必修②第104页）。但让大部分同学及一些老师感到疑惑的是：大肠杆菌是原核生物，既没有内质网，也没有高尔基体，而胰岛素是分泌蛋白，大肠杆菌是怎样加工和分泌胰岛素的呢？

2．我国人工合成牛胰岛素的艰辛历程

众所周知我国科学家率先合成具有生物活性的结晶牛胰岛素，回顾我国人工合成牛胰岛素的艰辛历程，对认识将胰岛素基因导入大肠杆菌，能用于生产胰岛素这一正确的结论有重要意义。

1958年确定人工合成胰岛素的课题。胰岛素是由三对二硫键，其中两对二硫键在A链和B链之间形成，另一对二硫键在A链上。在考虑的合成各种合成方案中，最切实可行的方案是分别合成A链和B链，然后通过巯基的氧化使两条链正确组合。

邹承鲁所在小组的任务是摸索胰岛素分子经过还原、分离纯化之后得到的A链和B链怎样重新组合成天然的胰岛素分子。历经艰辛，最终发现了不使用氧化剂而是在低温下由空气缓慢氧化的方法完成。所得到的粗产物经进一步纯化和结晶，终于得到和天然胰岛素具有相同活力和晶型的晶体。并且胰蛋白酶水解物双向纸层析和电泳的结果进一步证实氧化后所得的胰岛素与天然胰岛素完全相同。（我国科学家在1959年秋得出这些重要的结论，后来被国外其它实验室证实。现已应用到工业生产中。）

上海生物化学研究所由钮经义和龚岳亭领导的小组负责B链的合成，上海有机化学研究所由汪猷领导的小组以及北京大学由邢其毅领导的小组共同负责A链的合成，两条链都是通过传统的片段缩合法来合成。邹承鲁领导的小组负责两条肽链的组合。B链的合成以及由人工合成的B链与天然的A链构建成胰岛素首先获得成功。A链的合成一直不顺利，龚岳亭加入到上海有机化学研究所的小组中帮助解决了问题。在1965年9月 17日，中国在世界上首次用人工方法合成了结晶牛胰岛素。

3．利用基因工程菌生产人胰岛素

在利用基因工程菌生产胰岛素之前，人类已发明了从人的胰脏中直接提取胰岛素、由单个氨基酸直接化学合成、由猪胰岛素化学转型为人胰岛素等方法，这些方法受原料限制，成本高。1982年，美国的Ely LiLi公司首先使用重组大肠杆菌生产人胰岛素，这是第一个上市的基因工程药物。5年后，Novo公司又开发了利用重组酵母菌生产人胰岛素的新工艺。长期以来，人们已开发了多种大肠杆菌工程菌，但具有代表性和实用型的构建方案主要有以下三种。

3.1 AB链分别表达法

该方法中A链和B链的编码区由化学合成，两个DNA片段分别插在含有Ptac启动子和β-半乳糖苷酶基因的表达型质粒上，后者与胰岛素编码序列形成杂合基因，其连接位点处为甲硫氨酸编码。重组分子分别导入大肠杆菌，两种工程菌分别合成β-半乳糖苷酶—人胰岛素A链、β-半乳糖苷酶—人胰岛素B链两种融合蛋白。经大规模发酵后，从菌体中分离纯化融合蛋白，再用溴化氰在甲硫氨酸残基的C端化学切断融合蛋白，释放出人胰岛素的A链和B链。由于β-半乳糖苷酶中含有多个甲硫氨酸，溴化氰处理后生成多个小分子多肽，而A链和B链内部均不含甲硫氨酸残基，故不为溴化氰继续降解。 A链和B链进一步纯化后，以2：1的分子比混合后进行体外化学折叠。

3.2 人胰岛素原表达法

上述方法二硫键的正确配对率较低，通常只有l0％一20％。为了进一步降低生产成本，Ely LiLi公司随后又开发了人胰岛素原表达法。将人胰岛素原逆转录DNA（cDNA）编码序列克隆在β-半乳糖苷酶基因的下游，两个DNA片段的连接处仍为甲硫氨酸编码序列。该杂合基因在大肠杆菌中高效表达后，分离纯化融合蛋白，并同样采用溴化氰特性化学裂解法回收人胰岛素原片段，然后将之进行体外折叠。由于C肽的存在，胰岛素原能形成天然的空间构象，为3对二硫键的正确配对提供了良好的条件，使得体外折叠率高达80％以上。经折叠后的人胰岛素原分子必须用胰蛋白酶特异性切除C肽，才能获得具有生物活性的胰岛素。用胰蛋白酶处理人胰岛素原后，可获得完整的A链以及C末端带有精氨酸的B链，也就是说，与人的天然胰岛素相比，这个B 链多出一个氨基酸，必须用高浓度的羧肽酶B专一性切除多出的氨基酸。虽然这条工艺路线比 AB链分别表达法需要额外使用两种高纯度的酶制剂，但由于其体外折叠成功率相当高，使得最终产品的生产成本大大下降。

3.3 AB链同时表达法

这种方法的基本思路是将人胰岛素的A链和B链编码序列拼接在一起，然后组装在大肠杆菌β—半乳糖苷酶基因的下游。重组子表达出的融合蛋白经溴化氰处理后，分离纯化A—B链多肽，然后再根据两条链连接处的氨基酸性质，采用相应的裂解方法获得A链和B链肽段，最终通过体外化学折叠制备具有活性的重组人胰岛素。与第一种方法相似，其最大的缺陷仍是体外折叠的正确率较低，故目前尚未进入产业化应用阶段。

4．小结与延伸

由于大肠杆菌仅能在细胞内将胰岛素基因表达出无特异性空间结构的多肽链，以及其缺乏真核细胞的蛋白质加工系统等原因，大肠杆菌不能表达出具有生物活性的胰岛素。上述3种工程菌的构建策略均采用胰岛素基因与大肠杆菌β--半乳糖苷酶基因拼接的方法，所产生的融合型重组蛋白不能分泌，主要以包涵体的形式存在于细胞内，然后对肽链进行分离、纯化、体外折叠，方可获得具有生物活性的胰岛素。

从理论上讲，将大肠杆菌某个分泌型蛋白的信号肽编码序列与外源基因拼接，可以使异源蛋白在大肠杆菌中表达并分泌，因此，最近出现一种能促进融合蛋白分泌的工程菌构建策略——将胰岛素基因插入到表达型质粒β—内酰胺酶基因的下游，后者所编码的是降解青霉素的蛋白质，通常能被大肠杆菌分泌到细胞外，这样构建的工程菌具备可分泌型融合蛋白的优良特性，可减少后续分离纯化工序，但要得到具有生物活性的胰岛素仍需对肽链进行分离、纯化、体外折叠。