流式细胞仪

毕业设计

题目：

院（系）： 物理科学与技术学院

专业年级： 电子科学与技术2010级

姓名： 李 顺 学号： [1**********]80

指导老师： 杨 奕 教授

2014年5月15日

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流式细胞仪的设计与制备

郑重申明 本人郑重声明：本人所呈交的毕业论文，是在指导老师的指导下独立进行研究所取得的成果。毕业论文中凡引用他人已经发表或未发表的成果、数据、观点等，均已明确注明出处。除文中已经注明引用的内容外，不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的科研成果。对本文的研究成果做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。

本声明的法律责任由本人承担。

I1 II

摘要

流式细胞仪是这样一种进行细胞计数的仪器：细胞在流液中排成一列，经喷嘴流出，然后进入激光束汇聚的测量区，激光照射细胞后产生的散射光以及荧光等信号被周围分布的光电探测管接收，光信号经过一系列的放大转换后到计算机中进行分析。利用的原理是流式细胞术，一种起源于1934年发展至今的细胞检测自动化方法。COMSOL MULTIPHYSICS是一款基于有限元算法进行多物理场耦合的软件。本文主要采取COMSOL软件进行流液系统的模拟对流式细胞仪的其它几个系统都进行了详细说明与理解。同样，该研究还需要大量的后续研究本文中尚未做到。

关键词：

流式细胞仪，细胞检测自动化，COMSOL，模拟 I 1

流式细胞仪的设计与制备

Abstract Flow cytometer is an instrument which is used to analyze the particles and then sort them. The particles suspend in fluid and every particle will be analyzed over the brief period time. The particle is being illuminated as it passes through the analysis point which is an area where the laser beams focus on and a large of information about particle will be obtained by photoelectric detection. Optical signals after a series of amplification converted into the computer for analysis.

Flow cytometer is based on flow cytometry. The flow cytometry is a technical for the analysis of individual particles which is a method of cell count automation originated from 1934.

COMSOL MULTIPHYSICS is software which is based on finite element method for multi-physics. This article mainly takes the COMSOL software to simulate fluidic system and have a detail describe about several other systems and give a further study. There are much work which are not done in

the article need to be done in future.

Keyword: Flow cytometry, cell count automation. COMSOL, simulation

II

目录

摘要 ...................................................................................................................................................................................... I Abstract ................................................................................................................................................................... II 绪论 ..................................................................................................................................................................................... 1

第一章．流动室和液流系统 ................................................................................................................. 3

1．1液流系统 ..................................................................................................................................................... 3

1.1-1.细胞悬液可能出现的问题 ..................................................................................................... 3

1.1-2.流动室的结构 .................................................................................................................................. 3

1.1-3.窄液流的实现---COMSOL层流模块 ............................................................................. 4

1.2．粒子追踪 ................................................................................................................................................... 6

1.2-1.comsol粒子追踪模块简介.................................................................................................... 6

1.2-2.流体流动粒子追踪 ...................................................................................................................... 7

1.2-3．流式细胞仪对粒子的要求 .................................................................................................. 8

1.2-4．采用粒子追踪进行模拟流动室情况 .............................................................................. 9

1.3．液流系统 ................................................................................................................................................. 11

第二章.激光源及光学系统 .................................................................................................................. 12

2.1.光学系统 .................................................................................................................................................... 12

2.1-1．光学系统的作用 ....................................................................................................................... 12

2.1-2.照射光 ................................................................................................................................................. 12

2.1-3.光学系统组成的测量区 ......................................................................................................... 12

2.2.光学系统与细胞信号的关系 .............................................................................................. 13

2.2-1.激光照射到细胞后的结构 ................................................................................................... 13 1

流式细胞仪的设计与制备

2.2-2.产生前向散射光与侧向散射光的原因............................................................................. 13

第三章．光电检测系统 ............................................................................................................................ 15

3.1..荧光信息检测 ..................................................................................................................................... 15

3.2.光电检测系统 ........................................................................................................................................ 15

第四章．计算机分析系统 ...................................................................................................................... 16

4.1.信号的转换 .............................................................................................................................................. 16

4.2．数据处理方式 ..................................................................................................................................... 16

4.3.从数据中获取信息的方式 .......................................................................................................... 17

第五章．分选系统 .......................................................................................................................................... 18

5.1.流式细胞仪分选的发展 ................................................................................................................ 18

5.2.流式细胞仪分选规律 ...................................................................................................................... 18

5.3．分选出“感兴趣”的细胞 ....................................................................................................... 19 总结 ........................................................................................................................................................................... 19

参考文献 .............................................................................................................................................................. 20

致谢 ........................................................................................................................................................................... 21

绪论

[1,2] 流式细胞术（Cytometer）来源于两个希腊字母，翻译成中文分别是细胞以及测量的意思，

是一种微粒的检测以及分选的技术。如今，流式细胞术已经是一种集仪器，激光，荧光，计算机等于一体的创新型技术了。取得如今这样的成就与此领域的先驱们的卓越贡献是分不开的。早在1930年，Casperrsson 和Thorell便开始研究细胞计数，到了1934年，Moldaven开始设想一个仪器模型[3]，它看起来像一个显微镜，在试验台上放置了一根毛细试管，当细胞在其中呈一列经过发光管前面时可以被照亮，来自细胞的光信号随后就被安置在显微镜目镜之前的光电管分析。之后几十年Coulter等人逐渐发展了在悬浮液中进行细胞计数的仪器[4]。在1965年与1967年之间，Kamentsky与Melanmed制作了一个基于显微镜的流式细胞仪[5,6,7]，用于通过探测光信号来区分样品中的一场细胞。在Kanmentsky发表文章后的几年，Fulwyler，Dittrich，Gohde，Van Dilla以及Herzenberg等对以上设计做出了诸多重大改进。使之与今天的流式细胞仪非常接近。和如今的细胞仪一样，1969年的细胞仪虽然并不完全像一个显微镜，但是仍然是基于Moldavan的原型和Kamentsky的仪器，当细胞呈一列流经激光照射区，细胞被照射后产生的光信号被周围的光电探测器所探测。而我们现在定义的流式细胞仪是关于一个仪器[8-14]，用于探测经过激光照射后来自单独的细胞的信号。

现代的流式细胞仪已经朝着高维复杂化发展。引进了一个新概念，可以作为用准确而有效的策略分析复杂的多参数数据基础。并且向定量荧光测量迈出了一大步，应用于基于液滴的多位分析，半自动的高通流式细胞仪以及荧光能量共振转移分析蛋白质的作用。应用范围还涉及到了从多色彩表型特征到基因组与蛋白质组的分析等。

多参数流式细胞计数的使用完美的在基于函数的研究中展现了。细胞毒素活性的评估和周期性T细胞的功能可以用细胞追踪染料，表型标记和功能探针来判定。细胞内的细胞因子着色通常使用可视化特异性抗体T细胞。结合功能性和表型的标记，特异性子细胞可以被进一步的观察。磷酸翻译细胞内的酶使用高特异性抗体（区别于磷酸化和非磷酸化状态的蛋白质）来进行信号级联放大。结合免疫表型，异源群体内单个细胞细胞的离散生物化学信号等因素可以仔细的检查。连续复杂的凋亡过程可以通过同时监控多个凋亡特征来进行评估。使用多个抗体观察细胞表位的周期性规律的蛋白质提供了比单独测量DNA含量更多的信息。

流式细胞仪的单细胞分辨率和高通量能力可以在群落中识别极少量的细胞。直接调查研究正常造血细胞发育的不同细胞对对抗血液学疾病和理解疾病的产生和发展非常重要。，那些与发病源有关的细胞衍生微粒可以通过传统的流式细胞术分析出来。

从结构的角度来说，流式细胞仪分为四个部分：流动室与液流系统，激光源及光学系统，光电检测系统，计算机分析系统。其中前两个方面会在后文着重介绍，后两个方面也会相应介绍。流式细胞仪从1969年至今依旧保留一些固定的技术没有变，三十多年的发展与改变主要在流式细胞仪分析的量上而非性质上的改变。如今可以同时分析更多参数的细胞，每秒分析的细胞数也更多。对于弱的荧光信息更加敏感。可以被探测到。此外，流式细胞仪的体积变得更小，价格也更低。不过细胞仪没有变的位置在于：依旧要求粒子一个接一个的通过分析区，光电探测管分布在探测去周围以探测来自细胞的散射光信息以及荧光信息。相对于技术上的一些改变，在应用的多样性方面取得了更大的进步。使用范围大大的增加了。根据Medline的数据来看，1970年流式细胞仪的使用数是0，到了1980年则为113,1990年为2286.到了2000年则为4893。2009年时则已经高达8811了。使用量是一个方面，更为重要的一个方面是使用领域方面：在20世纪70年代，细胞仪主要用来分析白血球个人工培养的细胞。如今，浮游生物，细菌，分解后的组织，植物细胞，病毒，染色体，乳胶微球。DNA片段等等都涉及到了流式细胞仪。另外，早期的流式细胞仪观察的荧光主要来自于细胞表面的染色的 1 页 第 1

蛋白质或者细胞核内染色的DNA。现在则可以检测到浮游生物的自发荧光等。

通过其历史以及其后的发展，我们可以看到，流式细胞仪是结合了数学，工程学，化学，生物学，物理学等而产生的一个仪器。流式细胞仪不仅仅只是探测我们自身的细胞以及培养皿中的细胞，随着它应用的领域被进一步开发，相信会带来更多惊人的成绩以及自身进一步完善和发展。也将促进各个领域走向合作并开阔我们的认识。在这篇文章中，主要以COMSOL来对流式细胞仪相关的部分进行几何层次以及数据方面的验证模拟。 COMSOL multiphysics 是COMSOL公司发布与1998年发布的一款软件，可以对基于物理场的系统进行模拟和仿真。COMSOL为常见的仿真应用提供了COMSOL Desktop图形用户界面，预定义用户接口及其相关的模拟工具，一系列的专业模块将这种多物理场仿真平台拓展到各种特定应用领域的仿真，并可以与很多第三方软件进行相互接口。COMSOL基本模块式运行所有专业模块所必须的基础。专业物理场模块可以增强COMSOL的物理核心接口，提供大量的用于电气，机械，流体流动和化工等应用领域的物理场接口。相应具体的模块内容以及应用，后文涉及到的部分将做详细的介绍。本文着重结合COMSOL来对以流式细胞仪的结构体系为大纲进行仿真。

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第一章．流动室和液流系统

1．1液流系统

1.1-1.细胞悬液可能出现的问题

在流式细胞术中，与传统的纤维检查法不同，粒子是流动的，即粒子需要悬浮在流液中，当粒子流经分析区时每个粒子都会在一段确定的光照时间内被详细分析，这意味着可以分析很多细胞并且大量细胞的统计信息可以在短期内获得。这些之前提到过的向下流动的单细胞，需要时，在悬浮液中单独存在的。但是，即使是名义上单细胞悬浊液如果细胞有集合的趋势的话也会包含细胞块；或者如果他们处于一个高浓度的悬浊液中细胞会出现伪块，在某些情况下，在细胞仪分析区其他细胞也会发生类似的情况。甚至在低细胞浓度的悬浊液中，总有一定几率会发生上述情况。在细胞仪的流体就是为了降低那些多细胞在分析区聚合的可能性。另外，流体必须促进类似的光照射的每个细胞，必须构建的避免阻塞流液管，必须保证细胞尽可能快的流入和流出测量区（始终产生足够强度的散射光和能被敏感探测器探测到的荧光）。

1.1-2.流动室的结构

限制细胞在一个窄通道内一致的经过激光束中心的一种方法是使用一个窄直径的光清晰管，或者强制细胞从一个窄喷嘴中

流出通过激光束；问题是如果细胞过大或者过于集中，将细胞从

一个非常窄的喷嘴喷出或者通过一个窄的管将会堵塞通道。依据Cronsland-Taylor在1953年做的工作，利用流体力学的流体聚焦

来解决堵塞问题[16]。他注意到“试图去计数流液中悬浮的小粒子

通过一个试管迄今为止还没有非常成功”因为粒子（比如血红细

胞），实验者必须选择一个宽口径试管能让两个以上的细胞同时通

过一个特殊的部分，否则，因为试管和悬浮液的折射率不同，窄

试管会让显微镜观测试管内容非常困难，另外，窄试管更容易阻

塞。Crosland-tayler把细胞限制在一个焦点上的策略是“窄液流”，

但是为了防止经过小室和喷嘴时堵塞，将细胞悬液注射到快速流

动的宽液流（鞘液）的中间，根据流体动力学原则，细胞会被限

制在宽液流的一个窄的核心。这个所谓的流体动力学聚焦导致液

流沿着一条轴线流动，它是第一次应用到细胞仪上（被

Crosland-Taylor），他们意识到那是一种限制细胞在一个确定位置

但不需要容易被阻塞的窄液流的方法。液流系统就设计为这样一

种结构：“流动室”是一个处在细胞仪的样品流注入到鞘液流的位

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流式细胞仪的设计与制备

置，在加入到鞘液流之后，细胞悬液的速度（m/s）即不增加也不减少，以便和鞘液流的速度相等，结果是核心液流的横截面直径所包含的的细胞既不会增加也不会减少导致液流的速度改变以保证同样的样品流量。（ml/s）。细胞悬液的注入速率直接影响了核心液流的宽度和细胞被限制在激光束照射中心的严格性。

用流体动力学聚焦令细胞流在宽鞘液流中被限排成一列因此堵塞很少发生，这里依然需要一个快速的分析，为了更好的限制细胞流在激光束的中心，也为了避免多个细胞在分析区重合。这些特点应该在设计流式细胞仪是考虑到。一些细胞仪的照射细胞液流在一个流动室的光学清晰区域（因为在一个透明容器中）。其他系统使用流式细胞是激光交叉照射液流刚从喷嘴流出流动室时的位置。在所有情况中，流动室增加液流的速度是通过一个压缩喷嘴孔径的出口比入口的孔径更窄。孔径的差别一般在10倍~40倍，引起的速度增加在100-1600倍[17]的之间，当整个液流（细胞悬液在鞘液流中心）流向流动室的出口，孔径变得更窄并且速度变得更大。便随着口径的缩小和速度的增加，细胞的路径变得更紧凑的限制激光束的中心因此所有细胞可以被均匀照射并且细胞可以快速的经过激光束。另外，细胞在窄液流中彼此之间会散的比较开，因此在分析去重合的可能性更低。

总而言之，关于流式细胞仪的流液系统。中心液流细胞在宽鞘液流中的流体动力学聚焦促进细胞在激光束中心排成一列经过结合了小直径管和喷嘴而没有堵塞的问题。另外，流动室自身加速液流，不但增加了细胞的分析速率，也是的中心液流更窄并且使他更精准的排成一行均匀的被激光束照射，同时，增加了液流中细胞之间的距离使其在分析去发生重合的频率更低。

1.1-3.窄液流的实现---COMSOL层流模块

流式细胞仪的设计与制备

保持鞘液流速10m/s不变，改变中心流液流速，逐渐加大中心流液流速，来观察其中液流的情况。

一般情况下，出口处的液流速度为入口处液流速度的100~1600（3维情况）倍;但目前我们模拟的为二维情况则为10~40倍。

模拟该结构下注入液体的速度情况：

1.2．粒子追踪

粒子追踪为COMSOL Multiphysics的功能模块，可与COMSOL的任何专业模块联合使用，将粒子追踪模块联合层流模块来研究细胞在流体中的运动情况以及流速的关系。

1.2-1.comsol粒子追踪模块简介

Comsol中的粒子追踪模块是作为一个功能模块辅助专业模块进行分析。它使用离散元技术求解进行粒子追踪计算，是对有限元的有力补充。

主要应用于：

1.AC/DC电磁场分析：如质谱仪分析，束物理场和离子光学，电子倍增。 2.流动分析：如流体流动可视化，喷雾。分离和过度，布朗运动。

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3.RF分析：如平滑渐变材料中的光线追迹。 4.等离子体分析：如粒子能量的角分布函数。 5.声学分析：如声致泳动力分析。 6.通用数学：经典力学。

三大物理运用模式： 1. 数学粒子追踪。

-人工设定运动方程。

-可使用无质量，牛顿，拉格朗日或者哈密尔顿公式。 -完全自由定义各种运动方程，比如可以计算光线追迹。 2. 带电粒子追踪。

-模拟电场，磁场作用下粒子或者电子的运动轨迹 -内建电磁力，碰撞力的定义 3. 流体流动粒子追踪。

-模拟流体中的宏观或微观粒子运动

-内建拖曳力，重力，介电泳，声致泳动等作用力

1.2-2.流体流动粒子追踪

1..粒子属性

在comsol流体流动粒子追踪中，粒子属性这一项有两个公式选择:牛顿力与无质量。 后续将有许多其他项的选择均是基于牛顿力公式。

2.流体粒子追踪的域，边界，对，全局特征选项 -布朗力 -介电泳力 -曳力 -电场力

-流体粒子间作用力 -重力 -磁场力

-热泳力 -声辐射力

后面我们用到的几种特征为曳力以及流体粒子间作用力。 ·曳力

只有在牛顿力公式下曳力特征才能加入模型进行计算。使用曳力特征需要定义湍流分布，速度场，动力粘度，以及湍流动能。

1.2-3．流式细胞仪对粒子的要求

因为流式细胞术是一种分析单粒子的技术，必须一开始要获得粒子悬浮液，从历史上来看，被

流式细胞探测的粒子通常是来自血液。这是符合流式细胞术的理想悬液，因为他们都是作为单细胞存在，并且不需要进行细胞分析的前加工。人工培养的细胞同样适合尽管粘连细胞在他们生长时需要一些措施把他们的表面分开。到了后来，细菌精子和浮游生物也可以被分析，流式技术也曾经被用于分析那些没有细胞的单粒子。如病毒，核子，染色体，DNA片段和乳胶微球等。此外，细胞就算不是以单粒子的形式出现也可以经过机械破碎或者酶消化之后进行流式细胞分析。组织也已被分解成单细胞并且这些单细胞可以经过流式细胞仪。单细胞分析的优势是，当测量单细胞时细胞可以以500/s到超过5000/s的速度被探测并且大量的细胞的特征都可以被列举，对应和汇总。单细胞技术的缺点是当细胞不是以单粒子形式出现时需要被分解成单粒子；当组织被分解后进行分析时，一些细胞个体的特征会改变并且关于组织的结构以及细胞分布等信息都会丢失。

早期流式细胞术中，因为粒子在一束激光前的狭小的流液中流动，有尺寸限制，通常，细胞或者粒子必须落在直径1um和接近30um之间，特别的细胞仪可能会增大敏感性以保证更小的粒子（如DNA

流式细胞仪的设计与制备

片段或者小细菌）被测量，也可能有增大流量以保证大分子（如植物细胞）通过。但是一般的细胞仪，一方面，不会特别灵敏以探测来自非常小的细胞的信号，另一方面，也会被特别大的粒子阻塞。 使用于流式细胞仪的粒子悬浮液应该集中在5x105~5x106/ml之间，在这种悬浮液中，他们可以几乎是一个接一个的流经细胞仪。

重要的一点是，要知道用来进行细胞着色的荧光染料本身需要适合细胞仪，这个需要了解照射光的波长的知识，在光电探测仪器之前的特异性波长滤波器的知识，以及染料自身吸收和发射光的知识。用于着色细胞的荧光必须能够吸收特定波长的照射光，探测器必须能适合滤光器以探测到发射的荧光。

1.2-4．采用粒子追踪进行模拟流动室情况。

1.3．液流系统

第二章.激光源及光学系统

2.1.光学系统

2.1-1．光学系统的作用

当细胞悬液从流动室流出时，会经过分析区，而分析区则是激光束的照射区，用以激发细胞的荧光信号或者获取照射之后的散射信号等，采集以及测量收集来自细胞的光信号进行计算分析，因此，分析区也可以叫做测量区。光学系统在此处则是测量区的核心部件。

2.1-2.照射光

在大多数的细胞仪中，荧光细胞被激光照射，激光提供了窄束强光照射。液流中的粒子可以迅速

的穿过激光束，在理想情况下，一次只有一个粒子被照射到，照射光强到足够产生散射光和可被探测到的荧光。

现在的细胞仪所使用的荧光依然是气体激光（如氩离子，氪粒子，氦-氖激光器）或者固体激光器（如红色，绿色，蓝色二级激光管）。所有的情况都会产生特征波长，来自激光器的波长都是固定不变的，激光的波长取决于激光媒介。直到目前为止，流式细胞仪光学实验台最常用的激光器是氩离子激光器；它是流式细胞仪早期使用的激光器，因为它可以提供（488nm）的蓝绿光，可以很好的被荧光吸收，（一种长期用于荧光显微的荧光材料）；氩离子激光也可以产生绿光（514nm），（351nm和364nm）的紫外光，以及一些低强度的其他颜色的光。一些细胞仪只会采用氩离子激光器产生的488nm

流式细胞仪显示的细胞的所有信息来自于细胞处于激光束的那段时间。那段时间开始于前段进入激光束结束语细胞后端离开激光束，激光束与液流聚焦的位置称作测量区或者分析区，如果有更多的激光束，就有更多的分析区，一个标准的流式细胞仪，激光束是椭圆横截面，最亮的位置在中心，测量区域在10x60um-20x60um之间，激光束穿过的维度和高度保证每个细胞都会经过。在商业和研究的细胞仪中，细胞会一5-50m/s的速度流经每个分析区；一次，他们每个细胞将会在激光束中处于0.2-4us

的时间。因为荧光染料特定的吸收光以及发射光需要几纳秒的时间，处于测量区的时间内细胞上的荧光染料将会吸收然后放出光接近一千次。

2.2.光学系统与细胞信号的关系

2.2-1.激光照射到细胞后的结构

2.2-2.产生前向散射光与侧向散射光的原因

在激光方向右边的透镜收集的光已经从原来的方向散射了一个比较大的角度了，被这些透镜收集到

的光被透镜的口径和他自身到分析区的距离界定了叫做侧向散射光（SSC），或者（90度角散射光）；激光被散射成这些角度主要是因为细胞质以及细胞不整齐的表面的结构。细胞核不整齐的粒细胞会比细胞核是球状的淋巴细胞散射更多的光到侧向。同样的，纤维母细胞会比单细胞产生更多的侧向散射光。

第三章．光电检测系统

3.1..荧光信息检测

到目前为止被描述的信号（SSC和FSC），是激光照射细胞后同一种颜色的信号。在单激光器系

统里，通常使用488nm的氩离子激光器或者蓝色固体激光器；在有两个以上的激光器的系统中，散射光也通常是488nm因为是从主要的激光束中收集。这些散射光提供细胞的物质特征信息。除了这些散射光，细胞也会发出荧光。荧光即为一种发出的相对吸收的光的波长较长的光，即分子吸收高能量的光然后放出一些能量更低的光子。荧光吸收488nm的光放出530nm的光。藻红蛋白吸收488nm的光放出580nm的光。因此，如果一个细胞已经被一些特殊的特异性的抗体结合的荧光染料和一些与不同特异性的抗体结合的枣红蛋白着色，之后细胞经过了一个488nm的激光照射区。将会放出530nm和580nm的光。

一些细胞可能也包含内在的荧光分子（像叶绿素，吡啶，黄素核苷酸）。另外，细胞可以被其他的探针着色，发出的荧光量取决于细胞的DNA含量或者钙离子含量，例如，在所有的这些情况中，来自细胞的荧光强度，到一个可以认证的范围，与细胞的抗体是否足够或者DNA或者内在的分子小或者钙离子浓度相关。测量的荧光强度会提供一些信息，一些细胞的表型或者功能将会在流经激光束时显示出。

3.2.光电检测系统

探测荧光与探测侧向散射光类似，但是要外加特定波长的镜子和滤波器。这些镜子和滤波器设计用来传播和反射一些确定的波长。从分析区发射到侧向的光被透镜聚焦到一系列的分光镜和帯通滤光片上，区分这些色光后，根据它们的颜色，到达一系列的分隔开的光电倍增管上。

举一个简单的例子，侧向光（488nm）被指向一个光电倍增管，530nm的光被指向另一个倍增管；580nm的光被指向另一个倍增管；而>640nm的光则指向另一个倍增管，在这个例子中，系统在一侧会有4个光电倍增管，单独分别为绿松色，绿色，橙色。或者红色光准备。加上额外的前向光探测器，这个设备可以乘坐5参数流式细胞仪。当今典型的流式细胞仪，一般在任何位置都有3-15个光电探测器因此可以探测并且记录前向散射光的强度，侧向散射光的强度，和1-13种不同颜色的荧光前度。因为多重激发波长需要激励一个大范围的荧光染料（区分它们荧光激发的波长），高参数的细胞仪一般会有几个激光器。细胞会轮流的经过每个激光束并且光电探测器会在空间中分布因此一些探测器会测量被第一个激光器激发出的光，有些将会测量被第二个激光器激发出的光，以此类推。

如图2-2-2即为一个完整的激光以及光学检测系统。激光经过透镜聚焦后照射液流产生的前向散射光以及侧向散射光的收集。

第四章．计算机分析系统

4.1.信号的转换

在传统的细胞计数器中，光电管中的电流会被转换成电压信号，然后按比例处理后放大，做一些修

正之后最后将被模拟-数字转换器（ADC）将电压信号数字化，因此最后输出的数字就是与之前的模拟信号相关的并且经过放大处理后的信号然后再把这个信号值送入数字通道中。放大器即可以是线性的放大器也可以是对数的放大器。如果是使用线性放大器，强度值被数字化后将被以10为单位或者1024的范围的形式被记录，横轴上的值是线性变化的，纵轴与光强相关。相对来说，如果使用对数放大器，放大器输出的电压与原始光强的对数相关。信号被数字化之后，数字化后的数值将会与原始光强的对数值相关。当使用对数放大器是，坐标轴的划分将是以十为底的对数方式划分，横轴将是以10的倍数增加，一般情况下会以104为最大值。

4.2．数据处理方式

4.3.从数据中获取信息的方式

第五章．分选系统

5.1.流式细胞仪分选的发展

一般的流式细胞仪都有流动室与液流系统，激光器与激光系统，光电探测系统，计算机分析系统4个部分但有些流式细胞仪还有细胞分选系统。 流式细胞仪相较于以前，第一项发展就是可以检测细胞或者粒子上的多种颜色的荧光，然后就想到了那对根据不同荧光或者散射光属性将细胞分开收集到不同的试管中进行进一步分类很有帮助。比如对DNA和RNA的分隔，物理性的分析等。历史上，正好处于相反的方向。早期的流式细胞仪可以把每个细胞彼此分开，1965年，Mack Fulwyler 研发出了一款血细胞计数器可以通过不同的散射光信号将红细胞分开，前提是，被分开的细胞必须是两种不同种类的血红细胞。后来这个仪器就被用来分选人类与老鼠的血红细胞还有大组织细胞与老鼠的淋巴群细胞。几年以后，流式细胞仪被当做一种分选细胞的仪器。再后来，这些仪器少量的开始用于分析而不是分选细胞了。而现在的大多数细胞仪

常常没有分选细胞的功能了。

尽管有许多用来从混合细胞群分选出子群落的可行措施（如离心分离，磁珠捆绑，剩余物消耗等），这些方法比流式分选更有效率，但是，流式分选可能是用于通过他们的散射光，抗原的光强不同，或者多参数条件将细胞彼此区分时最好分选技术。流式细胞仪分选细胞依旧是通过功能性分析，特殊DNA序列的聚合酶链反应（PCR），人工受精的镜子上承载的X或者Y染色体，还有克隆转染细胞的显性表达。另外，分选染色体是依据DNA信息库的增殖。

5.2.流式细胞仪分选规律

电子式流式分选分为三步如图5-2-1： 1.将鞘液流振散成单独的小液滴。 2.液滴流经两个高压充电板之间。

3.对细胞液滴进行充电，充电的情况依据前面细胞流经分析区得到的数据决定，然后进行偏转。

需要注意的是，如果细胞振散成液滴之后分开的足够开，那么一般情况下每个

液滴中含有的细胞不多于一个；还有可能就是，依据操作的选择，细胞平均在每第三滴或者第五滴或者第十滴液滴就中存在，在两个含有细胞的液滴之间都是空液滴。含有细胞的液滴数目（以及空液滴的数量）由每秒细胞流过的个数与振散液流的震动频率还有数学上泊松分布的影响决定。细胞不可能沿着液流完美的符合分布，但可能按照概率丛聚。 细胞被振散成液滴的规律符合方程：

 v = fλ （5-1）

其中v为液流的速度，f为震动的频率，λ为液滴之间的距离。当液滴之间的距离保持在液流直径的4.5倍时，液滴形成就稳定了。所以一个给定直径的液流就会决定液滴之间的距离。液滴的形成频率过高时不可取的，液滴的形成频率过高会直接导致液滴的流速变高。假设平均每第三滴液滴包含有细胞，如果震动频率达到30KHZ，意味着细胞的流速要达到每秒10000个。如果震动频率达到90KHZ，意味着细胞的流速达到了每秒30000个。那么不得不提高液流的速度以达到这个流速。但是液滴之间的距离需要保持在4.5倍时，液滴流下才是稳定的，而频率如果太高就需要把液流变得更窄，而液流流速越高时，液流直径是越宽的。因此这样会存在矛盾。所以频率过高导致流速过高从而导致液滴形成不稳定。

5.3．分选出“感兴趣”的细胞

在细胞分选后，操作员会根据流式分析后的参数选出收集“感兴趣”的细胞的那部分区域。细胞在分析区是否被定义为为感兴趣的细胞要取决于分选条件，含有那些细胞的液滴会被充正电或者负电，当它经过偏转板时就会相应的偏转。现代的流式细胞仪有四种方式给液滴充电（强正电，弱正电，强负电，弱负电）。因此就有四种类型的细胞可以分选出来。在左右均有收集管，而那些含有感兴趣细胞的液滴被偏转后到相应的收集管中。不感兴趣的细胞会不会被充电，所以直接落入中间的容器当中。

收集的细胞会比较纯净，因为只有那些感兴趣的细胞会相应的被充电。这会发生是因为收集操作决定了细胞从分析区到震动位置的时间；液流在一段极端的时间内充电实际上当感兴趣的细胞被探测到时，这段时间会被延时。液滴的延时时间主要依据经验决定。通过测量收集的液串上不同液滴的延时。或者，它可以使用液滴分选单元测量（知道液滴的产生频率，它的倒数就是每滴液滴的时间，因此，没两滴液滴之间就有一个等值的时间单元）。给定了细胞从分析区到振动区之间到它自身收集器的时间，流式细胞仪可以被编程在一段短间隔内对液流充电，开始的时间在感兴趣的细胞刚刚从主液流中分离出来之前。如果仅仅在一段短的间隔内进行充电，仅仅只能对一个液滴进行充电。如果是在一段长的间隔内充电，那么在选定细胞两旁的细胞也会被充电。液流可以被充正电或者负电因此液滴串中会包含2-4个相互排斥的子群偏转到份分隔的收集容器中。

总结

关于实践的部分，着重做了流动室方面的原理理解，在熟悉学习了COMSOL的层流模块与稀物质

传递模块一段时间后进行了相关的几何结构模拟，层流状况的速度分析，浓度场分析，最后在熟悉使用COMSOL粒子追踪模块后采用了粒子追踪模块对颗粒在流动室中的相应条件下的流动情况进行了动态模拟与分析。对流式细胞仪的运作模式有了更清晰的认识，其次对流式细胞仪的其它模块，在原理上和应用上做了一些基本的分析与学习工作。关于流式细胞仪的制备与设计，这片文章仅仅做了一个前期的相关模拟和理论总结与学习的内容。后续还有相当大一部分的内容更需要结合模拟与实验去完成。因为流式细胞仪如今在生物学与化学领域应用的越来越多，相信以后其应用面也不仅仅只是限于此。随着流式细胞仪的发展，可以做到更快速的探测，更多的参数，更优化的数据处理模式，在尺寸上的改进也会带来气应用领域的拓宽。而其给人类生物学，医学，病理学等带来的贡献是不可估量的，随着其应用领域的拓宽，会令人类事物的观察方式与分选方式带来更多元的视角。

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21.Givan, A. L. [2001] Flow Cytometry: First Principles, 2nd edition. Wiley-Liss, New York, NY;

致谢

流式细胞仪的设计与制备

历时将近三个月，终于将论文完成，期间遇到了诸多困难与障碍，在与实验室同学交流讨论

下以及老师的指导下都一一克服了。特别感谢指导老师---杨奕老师，对我进行了无私的指导与督促，提供了良好的实验室平台供使用，耐心细致的对我的论文提出了诸多修改意见。同时，在软件的学习与相关知识的熟悉中，感谢实验室的同学以及室友们的帮助，耐心指导关于软件的使用，论文相关知识的利用方式等。

感谢这篇论文中所涉及的专家以及学者，本文引用了多位作者的论著，没有他们之前的研究成果的帮助与启发，我将很难完成这片论文。

感谢实验室学姐以及其它实验室的同学与朋友，感谢他们为我提供了相关的素材以及在排版等方面的热情帮助。

最后，由于自身的学术水平有限，论文中难免有不足与错误之处，恳请各位老师与同学指证。