遗传标记和遗传图谱构建
1997年第3期作物品种资源29
遗传标记和遗传图谱构建
刘 旭
(中国农业科学院作物品种资源研究所, 北京 100081)
摘要 遗传标记是遗传物质的特殊的易于识别的表现形式, 它包括形态标记、细胞学标记、生化标记和分子标记。遗传图谱构建是遗传标记最主要的用途之一, 但是由于高等动植物基因组的高度复杂性和有性世代太长以及遗传标记有限, 慢。目前各主要作物的R FL P , 性, 发现了禾本科不同作物的部分同源关系较慢, 但1989年英、美, 至今已取得很大进展。
R FL P 的表现形式, 可以用来研究基因遗传和变异的规律。而基因组DNA 的变异(多态性) 是遗传多样性形成的分子基础, 然而由于直接检测多态性的方法上的限制, 将DNA 多态性用作遗传标记直到近几十年才成为可能。
遗传图谱的构建是遗传标记最主要的用途之一。然而, 在高等动、植物遗传图谱的构建中却遇到了基因组高度复杂和有性世代太长的困难, 而最困难的问题还在于可供利用的遗传标记数量十分有限。直到80年代以来, 由于各种分子标记的应用, 使遗传图谱的构建工作取得较大进展, 特别是自H . Do 2n is , Keller 等人在1987年成功地构建了第一张人的R FL P 图谱以来如雨后春笋般地在全世界范围内蓬勃开展起来。1 遗传标记
在遗传学的研究中所采用的遗传标记是随着遗传学特别是基因概念的发展而发展的。目前, 遗传标记主要分4大类:即形态学标记、细胞学标记、生化标记和分子标记。形态学标记主要指可以观察到的一些性状, 如种皮颜
收稿日期:1996209226
色、抗病性反应、株高等; 细胞学标记主要包括核型分析、染色体分带和原位杂交技术、利用非整体进行遗传操作进而基因定位等; 生化标记主要是同工酶及种子贮藏蛋白, 有时又称做蛋白质标记或当做一种分子标记; 分子标记主要指在DNA 水平上的标记, 本文将重点介绍几种分子标记。
111 RF L P 标记 即限制性片段长度多态性(restricti on fragm en t length po lym o rph is m ) 标记(简称R FL P ) 。这是一种利用放射性同位素或某些非放射物质标记探针与转移于支持膜上的基因组总DNA (经限制性内切酶消化) 杂交, 通过显示限制性酶切片段的大小来检测不同遗传位点等位变异(多态性) 的一种技术。用作R FL P 的探针(只有单拷贝或少数拷贝的序列才能作探针, 在杂交显影后显示清晰可辨的带型) 主要来源是随机的基因组克隆(R G 克隆) 和c DNA 克隆。
与传统的遗传标记相比, R FL P 标记具有下列优点:①无表型效应, R FL P 标记的检测不受环境条件和发育阶段的影响; ②R FL P 标记在等位基因之间一般表现为共显性, 因此在配制组合时不受杂交方式的影响; ③在非等位基因之间不存在上位效应, 因而
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互不干扰; ④R FL P 标记源于基因组DNA 的自身变异, 在数量上几乎不受限制。这些优点使得R FL P 标记特别适合于构建遗传图谱。
112 RAPD 标记 即随机扩增多态性DNA (random am p lified po lym o rph ic DNA ) 标记(简称RA PD ) 。在PCR 技术基础上, W illiam s 等(1990) 采用随机核苷酸序列为引物扩增基因组DNA 的随机片段, 获得了一种新的分子标记。实际上RA PD 是一种特殊形式的A FL P , 它与一般A FL P 的最大区别在于用于扩增多态性DNA 的而随机的。
与3个特点(W er ) :①合成一套引物, , 而不像R FL P 探针有种族特异性; ②大大减少了多态性分析的预备性工作, 如制备克隆、同位素标记、Sou thern 吸引、分子杂交等。但RA PD 也有不足的一面, 如显性标记即每个标记提供的信息量少, RA PD 检测受反应条件影响大, 重复性和稳定性差等等。
113 AF L P 标记 即扩增片段长度多态性(am p lified fragm en t length po lym o rp h is m ) 标记(简称A FL P 标记) 。这是由Zabean 等人发明的一项技术, 即利用PCR 检测DNA 多态性的一种方法, 其原理是选择性扩增基因组DNA 酶切片段。可见A FL P 实际上是R FL P 与PCR 相结合的一种产物, 它具有多态性强、稳定性好和重复性高的特点。因此, 它特别适用于进行种质资源(品种) 的指纹图谱绘制。
除上述几种主要的分子标记外, 还有SSR (si m p le sequence rep eat ) , 小卫星DNA (m in isatellte DNA ) , 微卫星DNA (m i 2cro satellite DNA ) 等标记技术。2 遗传图谱
料的多态性确定作图群体的亲本和组合; 培育具有大量遗传标记处于分离状态的群体或衍生系; 作图群体中不同个体和品系标记基因型确定; 标记之间的连锁群的构建。211 经典遗传图谱
经典遗传图谱构建理论基础是染色体的交换和重组。在细胞减数分裂时, 非同源染色体上的基因相互独立, 同源染色体上的连锁基因产生交换与重组, , , (cen ti 2c M 1个c M 的大小大致符。
经典遗传图谱构建一般采用形态标记、细胞学标记和生化标记。数十年来, 许多遗传学家为构建各种作物的遗传图谱进行了大量工作, 并取得了一定进展, 但由于这些标记数量少、特殊遗传材料培育困难及细胞学工作量大, 因此尽管进行了100余种作物经典图谱的构建, 但事实上除少数作物(如玉米) 外, 在80年代前大多数作物并没有一个完全的遗传连锁图。212 分子遗传图谱
进入80年代, 分子标记的迅速发展大大促进了遗传连锁图的构建, 目前各主要作物的R FL P 遗传图谱构建已基本完成。水稻的连锁图上标记数量最多, 饱和度最高。日本绘制的12条水稻染色体上多达1100多个(Sasak i 等, 1995) , 即不到2c M 就有1个标记。小麦的R FL P 连锁图目前主要有两套:①英国构建的有520多个标记; ②美、法构建的有850个标记(N elson , 1995) , 已较为饱和。玉米连锁图进展很快, 美国密苏里大学绘制的标记数已超过600个。目前甚至许多小作物, 如谷子、高粱、甘薯等连锁图也即将完成。目前在分子遗传图谱的构建上主要工作有两项:①尽快填补图谱上的较大的间隙, 使其更加“饱和”; ②使用更易为育种家接受的经济、实用的分子标记(如SSR 、
利用遗传标记构建遗传图谱的一般步骤包括:选择用于作图的遗传标记; 根据遗传材
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RA PD 等) 来构建新的图谱, 或将R FL P 图
谱中的R FL P 标记转换成PCR 标记。
目前, R FL P 图谱揭示出两个重大遗传现象:①小麦的R FL P 图谱向人们揭示了小麦进化过程中, 有多条染色体发生非部分同源染色体易位或称染色体重排; ②禾本科植物基因组的保守性, 发现禾本科不同作物染色体间的部分同源关系。
213 经典遗传图谱与分子遗传图谱的综合
目前具有重要经济价值的栽培植物几乎全部都已构建了以R FL P 等分子标记为主的遗传图谱。息, 合起来, 图谱。, 二, 而且采用的样本、统计方法也不相同。另一方面经典遗传图谱构建时采用了不同实验室、不同群体、不同科学家多次来完成的, 这就更增加了综合的难度。但二者综合不仅是重要的经济性状准确定位的需要, 也是选择适当探针分离目地基因的需要。在栽培植物中番茄和水稻的经典遗传图谱和分子遗传图谱的综合进展较快。W eide 等(1993) 构建了番茄第6条染色体的综合图谱, 目前已将水稻47个表型标记和11个同工酶标记定位于分子遗传图谱上(Cau sse 等1994) 。
3 小麦族RF L P 遗传图谱构建进展
色体的每一个臂上(Gale and Sharp 1988) , 这就为经典遗传图谱与分子遗传图谱的综合提供了便利。
由于上述原因加上小麦族对人类的重要作用, 英国M . D . Gale 在1988年第7届国际小麦遗传学会议上, 首次报道了麦类
英、澳科学家R FL P 工作的进展, 1989年美、
联合倡导并制定小麦族R FL P 作图计划(In 2ternati onal T riticeacM app ing itiative ) , 简称I ) , 至亲本筛选是非常重要的, 由于小麦品种间多态性较差, 因此在小麦品种间筛选多态性好的亲本至关重要(Chao et al . 1989) 。一般地讲利用近缘种及合成品种将会使多态性水平明显增高(Q ualset et al 1994) 。
组合配制中一般采用单交组合的F 2分离群体或衍生的F 3家系(Chao et al 1989) 。此类组合易配制, 但F 2提供种子、叶片有限, 对合作或连续研究不利。虽然F 3可补救不足, 但往往出现误差及加大工作量。为了弥补以上不足, 往往采取重组近交子和双单倍体群。
作图群体大小:一般F 2分离群体应有100～150株为好。312 D NA 探针制备
限制性长度多态性的显示和检测是用克隆的DNA 片段作探针(即R FL P 分子标记) 进行分子杂交来实现的。一般只有单拷贝或低拷贝序列才能用R FL P 标记。麦类作物R FL P 分子标记中常有基因组随机克隆(称为gDNA 克隆) 和c DNA 克隆。gDNA 克隆来自基因组文库。这类文库构建简单, 并不要求分离基因所必需的基因对高度覆盖率。313 小麦族遗传图谱的构建
在作图群体确立后, 即可着手于对群体内每一植株进行R FL P 测定, 获得大量资料
在重要作物的分子遗传图谱的构建中, 玉米、番茄进展较快。相对而言小麦族的R FL P 遗传图谱构建进展较慢。其限制因素
普遍认为有:①小麦连锁群多, 且具有较多的补偿性; ②由第一原因导致小麦品种间多态性差。Chao 等(1989) 用13种酶18个探针检测小麦第7部分同源染色体群时, 只有1个探针显示出多态性, 这种情况与莴苣、玉
米、水稻的多态性则无法相比。但另一方面, 正由于小麦是异源六倍体, 有一整套非整倍体材料, 可以将每一个DNA 标记定位到染
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后, 下一步工作是制定有关分子标记的R FL P 连锁图。
在进行麦类作物及其近缘种R FL P 分析的同时, 有一项工作往往也要同步进行, 即将所有DNA 克隆及R FL P 连锁群体定到相位的染色体上, 建立R FL P 位点与其它标记(如形态、细胞学、抗病性、生理生化等) 之间的联系。在所有R FL P 位点中都使用了“中国春”的缺体2四体(N T ) 系、双端体系(D T ) 进行染色体定位, 先用N T 系定位到染色体上, 再用D T 系定位到特定的臂上, 从而在R FL P 连锁图上确定着丝点的位置P 体定位。R 。
目前L (1990) 以CS T . sp elta 等F 2群体, 以gDNA 为探针公布了小麦21条染
势
目前尽管已建成了许多小麦族R FL P
连锁图, 但仍存在着许多间隙, 如目前D 基因组上R FL P 标记数明显少于A 、B 组上标记(Chao , et al . 1989, ……) ; 其次连锁图中功能基因偏少, 特别是具有重大经济价值的数量性状的标记更少; 小麦族的近缘野生种除粗山羊草外研究较少。由于存在着上述问题, , 以其为研究小麦族植物的起源、演化和系统发育提供理论依据, 并为建立禾本科基因组骨架图谱提供更多的信息。②继续采用R FL P 标记填补其空隙, 促其饱和, 并着重进行具有重大经济价值的农艺性状(如高产、抗逆、抗病虫等) 基因的标记与作图; 同时努力探索采用其它分子标记来构建遗传图谱, 使经典遗传图谱与分子遗传图谱合并, 形成综合遗传图谱; 达到多态性更高、实用性更强、快速、准确、廉价的目的。
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色体的R FL P 连锁图, 图的总长为1800c M ,
平均每1117c M 就有1个R FL P 标记。Gale 等(1993) 分布的R FL P 连锁图有520个标记, N elson 等(1995) 公布连锁图有850个标记。当然比起番茄、水稻还是有较大差距的。314 比较基因组的研究
相关物种的基因组均起源于相同的祖先, 因此在进化上相近的物种在彼此的染色体上存在着同源区段。据此绘制出的连锁图称为一致性连锁图, 至今小麦中的7个部分同源染色体群的一致性连锁图都已绘制完成(Gale 等1993) 。
由于一致性连锁图和比较基因的发展, 禾本科的不同作物可以共用相同的探针, 并由此可以指示相近物种基因组的共同基础和基因组特征。So rrells 等(1995) 在禾本科不同作物间已确定150个通用“锚”探针(ancho r p robes ) , 用于水稻、玉米、小麦、高粱等作
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