特殊显微镜--荧光显微镜

实验2.2荧光显微镜的使用

一、实验目的

掌握荧光显微镜的原理、构造及其使用方法。

二、实验原理

荧光显微镜是免疫荧光细胞化学的基本工具。它由光源、滤色镜系统和光学系统等主要部件组成。荧光显微术是利用一定波长的光（通常是波长短的紫外光或蓝紫光）照射被检样品，激发荧光物质发射可见的荧光，通过物镜和目镜系统的成像、放大以观察标本的荧光图像，分析样品中产生荧光的成份和结构、位置。

某些物质经波长较短的光线照射后，分子被激活，吸收能量后呈激发态。其能量部分除转化为热量或用于光化学反应外，相当一部分以波长较长的光能形式辐射出来，这种波长长于激发光的可见光称作荧光。

任何一种荧光物质都有其特有的激发光谱和发射光谱，荧光发射光谱波长比激发光谱的波长更偏于长波方向，但两者有部分重叠。因此荧光显微镜的光路设计必须分离开激发光和荧光，使观察者能够看到纯的荧光。根据光的常识，用一定波长的光（如紫外光）照射某些物质，一定量的光能被物质的分子或原子所吸收，物质吸收光能后，激发出一种高能量电子（称为跃迁电子），进入激发态。随后，由于其与其他分子碰撞，引起能量衰减，并进入激发态的最低振动能级。当物质从激发态恢复到它原来的基态时，可以电磁辐射的形式放出所吸收的光能，然而放出的光波比原来激发光的光波长（如可见光）。如果这种光仅在激发的瞬间或在激发后的一个很短时间能放出，就称为荧光；如将激发光切断仍能持续发光（如残光，既光源停止后的续发光），且所发的光比荧光的波长更长，则称为磷光。

观察的主要荧光有自发荧光、染色荧光、诱发荧光、免疫荧光和酶诱发荧光等。原发荧光，或称一次荧光，是标本不经任何处理，在激发光照射下发出的荧光；染色荧光，或称二次荧光，是标本经荧光染料处理后哪些对荧光染料具有选择性吸收的部分经激发后发出的荧光。

细胞内大部分物质经短光波照射后，可发出较弱的自发性荧光。有些细胞成分与能发出荧光的有机化合物——荧光染料结合，激发后呈现一定颜色的荧光，借以对组织进行细胞化学的观察和研究。

由于荧光显微镜灵敏度高，用极低浓度（ppm级）荧光染料就可清楚地显示细胞内的特定成分，它不仅可以观察固定的切片标本，而且还可以进行活体观察，如可以对活细胞内物质的吸收和运输、化学物质的分布与定位等进行观察和分析；因为一定结构的物质分子只吸收一定能量的激发光，并且大多数的荧光光谱只有一个荧光带，故荧光的特异性强；此外荧光显微镜还可以和分光光度计结合成为显微分光光度计，对细胞内物质进行定量分析，其精确度高，可测得10-15g的DNA含量。

三、荧光显微镜的结构和主要部件

荧光显微镜因制造厂家、型号不同，结构各异，但主要构件基本相同。

1．光源

现在多采用200W的超高压汞灯作光源，它是用石英玻璃制作，中间呈球形，内充一定数量的汞，工作时由两个电极间放电，引起水银蒸发，球内气压迅速升高，当水银完全蒸发时，可达50~70个标准大气压力，这一过程一般约需5~15min。超高压汞灯的发光是电极间放电使水银分子不断解离和还原过程中发射光量子的结果。它能以最小的表面发射最强数量的紫外光和蓝紫光，且光亮度大，光度稳定，足以激发各类荧光物质，因此为荧光显微镜普遍采用。

汞灯装在牢固的灯室中，有调中、聚焦和集光装置。超高压汞灯散发大量热能，因此灯室必须有良好的散热条件，工作环境温度不宜太高。

新型超高压汞灯在使用初期不需高电压即可点亮，使用一些时间后，则需要高压启动（约为15000V），启动后，维持工作电压一般为50~60V，工作电流约4A左右。200W超高压汞灯的平均寿命，在每次使用2h的情况下约为200h，开动一次工作时间愈短，则寿命愈短，如开一次只工作20min，则寿命降低50%。因此，使用时尽量减少启动次数。灯泡在使用过程中，其光效是逐渐降低的。灯熄灭后要等待冷却（经5~10min）才能重新启动。点亮灯泡后不可立即关闭，以免水银蒸发不完全而损坏电极，一般需要等15min。点亮后如欲暂停使用时，可用光阀阻断光路。由于超高压汞灯压力很高，紫外线强烈，因此灯泡必须置灯室中方可点亮，以免伤害眼睛和发生爆炸时造成操作。

2．滤色镜系统

荧光显微镜的主要特点是它的光源能供给大量特定波长范围的激发光，使受检标本内的荧光物质获得必要强度的激发光，为了只让某一波长的激发光照射在样品上，必须在激发光源和显微镜之间的光路中安装滤色镜，让激发光源的特定波长的光通过，作为激发光。样品吸收这一激发光后，就会产生和发射荧光。为了得到专一的荧光，还需要在物镜和目镜之间光路中安装一的阻断滤色镜，它能将样品吸收后剩余的激发光吸收掉，并且它能有选择地让某一特定波长的荧光通过，而把其他非专一性的可见光挡住不让通过。

滤色镜系统是荧光显微镜的重要部位，由激发滤色镜和阻断滤色镜组成。

（1）激发滤色镜（exciter filter）

激发滤色镜的作用，在于为被检样品的荧光染料提供最佳波段的激发光。荧光染料均有一定的吸收光谱（激发峰值），利用滤色镜对光线选择吸收的能力，选用其透射光谱，恰为荧光染料的最大吸收光谱（激发高峰）的激发滤色镜，以便从汞灯发出的光谱光波中选择透过最宜波段的光线。激发滤色镜加放于汞灯和二向色镜（dichroic mirror）之间，物镜之前。

激发滤色镜分薄厚两种，一般暗视野选用薄滤色镜，亮视野荧光显微镜可选用厚一些。基本要求是以获得最明亮的荧光和最好的背景为准。

（2）阻断滤色镜（barrier filter）

阻断滤色镜位于物镜之上，二向色镜和目镜之间，用于阻断或吸收光路中的激发光或某些波长较短的光线，使荧光通过，并以防伤害眼睛。选用的原则，以能完全阻断或吸收波长长于所需荧光的光线，并透过样品发出的荧光。所以，阻断滤色镜的选用，应视荧光染料的荧光光谱而定，以能最大限度的透过荧光和阻断短波光。

（3）二向色镜：荧光显微镜中，除上述两类滤色镜外，尚有一种要的分色镜（chromatic beam splitter）系统——二向色镜位于汞灯和激发滤色镜构成平行光轴与目镜和物镜构成的竖直光轴的两轴垂直相交处，斜向安装于光路之中。二向色镜由镀膜的光学玻璃制成，其镜面方位与上述两光轴交角均呈45°，兼有透射长波光线和反射短波光线的功能，在荧光显微镜中承当色光的“分流”作用。

3．反光镜

反光镜的反光层一般是镀铝的，因为铝对紫外光和可见光的蓝紫区吸收少，反射达90%以上，而银的反射只有70%；一般使用平面反光镜。

4．聚光器

专为荧光显微镜设计制作的聚光器是用石英玻璃或其他透紫外光的玻璃制成。分明视野聚光器和视野聚光器两种，另外还有相差荧光聚光器。

（1）明视野聚光器 在一般荧光显微镜上多用明视野聚光器，它具有聚光力强，使用方便，特别适于低、中倍放大的标本观察。

（2）暗视野聚光器 暗视野聚光器在荧光显微镜中的应用日益广泛。因为激发光不直接进入物镜，因而除散射光外，激发光也不进入目镜，可以使用薄的激发滤色镜，增强激发光的强度，阻断滤色镜也可以很薄，因紫外光激发时，可用无色滤色镜（不透过紫外）而仍然产生黑暗的背景。从而增强了荧光图像的亮度和反衬度，提高了图像的质量，观察舒适，可能发现亮视野难以分辨的细微荧光颗粒。

（3）相差荧光聚光器 相差聚光器与相差物镜配合使用，可同时进行相差和荧光联合观察，既能看到荧光图像，又能看到相差图像，有助于荧光的定位准确。一般荧光观察很少需要这种聚光器。

5．物镜

各种物镜均可应用，但最好用消色差的物镜，因其自体荧光极微且透光性能（波长范围）适合于荧光。由于标本被激发和荧光的收集都是由同一物镜实现的，荧光效率与所用物镜数值孔径的四次方成正比，而与目镜放大倍数的平方成反比，所以为了提高荧光图像的亮度，应使用数值孔径大的物镜。尤其在高倍放大时其影响非常明显。对荧光不够强的标本，应使用数值孔径大的物镜，配合以尽可能低的目镜（4×，5×，6.3×等）。

6．目镜

在荧光显微镜中多用低倍目镜，如5×和6.3×。过去多用单筒目镜，因为其亮度比双筒目镜高一倍以上，但目前研究型荧光显微镜多用双筒目镜，观察很方便。

7．荧光显微镜的光路

荧光显微镜的光路，因荧光激发的方式不同，可分为两种：

（1）透射荧光显微镜光路

透射荧光显微术是激发光束通过聚光器自下而上的透射样品，诱发的荧光从物镜前方进入物镜。其具体光路如下：

汞灯发出的强光经集光镜、吸热滤色镜、镜臂反光镜、激发滤色镜、光路转换反光镜后光线转射向上，进入视场光阑、暗视场聚光器，再进入样品，激发出的荧光射入物镜，经阻断滤色镜后进入目镜。

（2）反射荧光显微镜光路

反射荧光又称落射荧光，因其激发光由物镜后部进入物镜，向下落射样品，激发出荧光，荧光反射向上再进入物镜。其具体光路如下：

汞灯发出高强的激发光，经集光镜、吸热玻璃、孔径光阑、激发滤色镜、视场光阑，通过二向色镜，在此处一定波长以上的长波光线透过二向色镜，脱离光路，一定波长以下的短波光线反射向下进入物镜，透过物镜射向样品，激发荧光物质发出可见的荧光，荧光反射向上再此进入物镜，复经二向色镜，其中波长较短的光线反射至光源方向，荧光和长波光线透射向上经阻断滤色镜后进入目镜。荧光图像的亮度随着放大倍数增大而提高，在高放大时比透射光源强。反射（落射）荧光显微术是目前广泛使用的荧光激发方式，它除具有透射式光源的功能外，更适用于不透明及半透明标本，如厚片、滤膜、菌落、组织培养标本等的直接观察。

四、荧光显微镜标本制作要求

1．载玻片

载玻片厚度应在0.8~1.2mm之间，如太厚，一方面光吸收多，另一方面不能使激发光在标本上聚集。载玻片必须光洁，厚度均匀，无明显自发荧光。有时需用石英玻璃载玻片。

2．盖玻片

盖玻片厚度在0.17mm左右，光洁。为了加强激发光，也可用干涉盖玻片，这是一种特制的表面镀有若干层对不同波长的光起不同干涉作用的物质（如氟化镁）的盖玻片，它可以使荧光顺利通过，而反射激发光。

3．标本

组织切片或其他标本不能太厚（冰冻切片15~20μm；石蜡切片小于10μm），如太厚会使激发光大部分消耗在标本下部，而物镜直接观察到的上部不能被充分激发。另外，细胞重叠或杂质掩盖，影响判断。

4．封固剂

封固剂必须无自发荧光，不抑制荧光，无色透明。最好用冰冻切片蒸馏水封片。长期保存得永久性标本，可用二甲苯混合封固剂（酞酸二丁酯10ml，聚苯乙烯25g，二甲苯70ml）。

5．镜油

一般暗视野荧光显微镜和用油镜观察标本时，必须使用镜油，最好使用特制的无荧光镜油，也可用纯甘油盐水缓冲液（分析纯甘油9份+pH7.1~8.6磷酸缓冲液1份）代替，液体石蜡也可用，只是折光率较低，对图像质量略有影响。

五、实验步骤

1．接通电源

开启荧光显微镜的起动装置，点亮高压汞灯，预热几分钟进入稳定工作状态。如使用外接电源，则要调节光源的聚光透镜，使光线平行透射到平面反光镜上，并调节反光镜使光线均匀射入聚光器。

2．选择激发和吸收滤光片

先根据观察的需要，选择一定的激发滤片，使之进入光路，允许一定波长的光波通过，作为激发光源。然后选择相应的吸收滤片，使之进入光路，让一定波长的荧光通过。

3．调焦

先用低倍镜观察标本，并调节其亮区在视野中央，对焦后即可观察，或进行高倍镜观察。如用油镜观察，应选用无荧光的镜油。

六、荧光图像的记录方法

荧光显微镜所看到的荧光图像，一是具有形态学特征，二是具有荧光的颜色和亮度，在判断结果时，必须将二者结合起来综合判断。结果记录如根据工作者目力观察。作为一般定性观察基本上可靠的。随着技术科学的发展，在不同程度上采用客观指标记录判断结果，如用细胞分光光度计，图像分析仪等仪器。但这些仪器记录的结果，也必须结合主观的判断。

荧光显微镜摄影技术对于记录荧光图像十分必要，由于荧光很易褪色减弱，要即时拍摄记录结果。方法与普通显微摄影技术基本相同。只是需要采用高速感光胶片如ASA200以上。因紫外光对荧光猝灭作用大，如FITC的标记物在紫外光下照射30s，荧光亮度降低50%。所以，曝光速度太慢，就不能将荧光图像拍摄下来。一般研究型荧光显微镜都配有半自动或全自动显微摄影系统装置。

七、注意事项

1．荧光标本一般不能长久保存，若持续长时间照射（尤其是紫外线）易很快褪色。因此，如有条件应先照像存档，在仔细观察标本。

2。应在暗室中进行检查。进入暗室后，接上电源，点亮超高压汞灯5~15min，待光源发出强光稳定后，眼睛完全适应暗室，再开始观察标本。

3。为防止紫外线对眼睛的损害，注意肉眼不能直接看到照明光；同时未装入吸收滤片不要进行观察，在调整光源时应戴上防护眼镜。

4。检查时间每次以1~2h为宜。超过90min，超高压汞灯发光强度逐渐下降，荧光减弱；标本受紫外线照射3~5min后，荧光也明显减弱；

5。荧光显微镜光源寿命有限，标本应集中检查，以节省时间，保护光源。暂时不观察时，及时用挡板阻挡激发光源照射标本。

6．电源应装置稳压器，否则电压不稳不仅会降低高压汞灯的使用时间，而且也影响镜检效果。关掉荧光灯电源后，徐冷却15min后再重新启动。严禁频繁开闭。

八、作业

1．物质在紫外光照射下发出的荧光有哪两种？。

2．荧光法的优点是什么？

九、思考题

1．荧光显微镜有哪些特有的装置？

2．荧光显微镜使用时的操作要点和注意事项有哪些方面？

十、附录1：吖啶橙荧光染色法

1．实验目的

1．了解荧光显微镜的基本结构、原理和使用方法；

2．观察荧光染料染色后结合物发出的荧光。

2．实验原理

吖啶橙（acridine orange，AO）荧光染料可与细胞内的DNA和RNA结合。其吸收光谱405nm，发射的荧光光谱是530~640nm，因此，吖啶橙和不同的细胞成分结合后，可发射红橙黄绿蓝各色荧光。

3．实验材料

（1）材料

口腔黏膜上皮细胞临时制片

（2）试剂

0.1mol/L pH7.0 PBS：A液 NaH2PO4.H2O 2.76g加蒸馏水至100ml；B液 Na2HPO4.7H2O 5.36g加蒸馏水至100ml；取A液16.5ml和B液33.5ml+NaCl8.5g用蒸馏水稀释至100ml。

0.1%吖啶橙原液：用0.1g吖啶橙加蒸馏水至100ml。

临用前配制0.01%吖啶橙染液：将0.1%吖啶橙原液用pH7.0 PBS溶液稀释10倍。

（3）仪器

荧光显微镜、载玻片、盖玻片、染色缸、牙签

4．实验步骤

1．取口腔上皮细胞涂在干净载玻片上。

2．95%乙醇溶液固定5min。

3．滴加0.01%吖啶橙染液染5min。

4．PBS溶液临时封片镜检。

5．实验结果

荧光显微镜下（选用紫蓝光激发滤片），可见含DNA

的细胞核显示黄绿色荧光，含RNA的细胞质机核仁显

图1-12 倒置显微镜

示橘红色荧光。