蛋白水解液中多肽含量的测定方法(1)

蛋白水解液中多肽含量的测定方法

鲁 伟1，任国谱2，宋俊梅1

(1.山东轻工业学院 食品与生物工程学院，山东 济南， 250100；

2. 湖南亚华乳业博士后工作站，湖南 长沙， 410116)

摘　　要：用10%(W/V)的三氯乙酸沉淀蛋白水解液中的大分子蛋白质，经离心过滤后，在上清液中加入双缩脲试剂，于540nm 下测定其OD 值，继而在Gly-Gly-Tyr-Arg 四肽标准曲线上查出样品中的多肽含量。关键词：双缩脲反应；三氯乙酸；多肽含量

Determination of Content of Peptides in Protein Hydrolysates

LU Wei1，REN Guo-pu2，SONG Jun-mei1

(1.College of Food and Bioengineering, Shandong Institute of Light Industry, Jinan 250100,China;

2.Hunan Yahua Corp. Ltd.& East China Normal University，Changsha 410116,China)

Abstract ：Macromolecule protein in protein hydrolysate was deposited by using 10% trichloroacetic acid. After centrifugal-ization and filtration, biuret reagent was added to the clear solution. The OD value was mensurated under 540nm. Then thecontent of peptides of the sample was obtained through contrasted on the standard curve of Gly-Gly-Tyr-Arg tetrapeptide.Key words：biuret reaction；trichloroacetic acid；content of peptides

中图分类号：Q51 文献标识码：A 文章编号：1002-6630(2005)07-0169-03

蛋白质是人体必不可少的营养素之一，但不同蛋白

质由于其氨基酸组成和空间结构不同，在人体内的消化吸收率也大不相同[1]。将蛋白质水解为多肽，可以大大提高其消化吸收率。近代研究表明，蛋白质在体内消化后并不完全以氨基酸的形式吸收，而大都是以寡肽的形式吸收[2]。因此，水解蛋白质生产多肽产品正成为当今研究的热门课题之一。在水解蛋白质的过程中，控制蛋白质的水解程度，尽可能少的产生氨基酸，尽可能多的得到目标产物多肽，是水解的根本目的。这就要求建立一种能快速测定水解液中多肽含量的有效方法。

对蛋白质水解程度的测定有多种方法，三氯乙酸法

是其中常用的一种，它是利用三氯乙酸沉淀水解液中的大分子蛋白质，继而以微量凯氏定氮法测定上清液中

[3]

可溶性氮的含量，然后减去水解之前样品溶液中可溶性氮的含量，再与样品中的总氮量相比，从而确定其水解程度。此法中微量凯氏定氮法测定的是水解液中可溶性总氮的含量，若改用双缩脲法[4]，便可测定其中含二个(包括二个) 以上肽键的多肽的含量[4～6]。

本文利用10%的三氯乙酸沉淀样品水解液中的大分子蛋白质，经离心过滤后，在上清液中加入双缩脲试剂，于540nm 测定其OD 值，继而在Gly-Gly-Tyr-Arg 四肽标准曲线上查出样品中的多肽含量。从而建立了一

收稿日期：2004-06-02

作者简介：鲁伟(1979-) ，男，硕士研究生，研究方向为微生物酶技术。

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[6]

种快速测定蛋白水解液中多肽含量的有效方法。１1.11.1.1

材料与方法材料

主要试剂

(1) Gly-Gly-Tyr-Arg，Sigma 公司。

(2) CuSO 4・5H 2O ；NaOH ；氨水；三氯乙酸，分析纯。

(3) 胰蛋白酶，杭州三叶生物化工厂 2000U/g。(4) Protamex， Novozyme，1.5AU/g。

图１　　 Gly-Gly-Tyr-Arg四肽标准曲线Fig.1 Standard curve of Gly-Gly-Tyr-Arg

冷却至室温，冷藏保存备用。准确量取50.0ml 水解液，于250ml 容量瓶中定容。

反应温度的影响

取六支试管，于每一支试管中均加入4.0ml 上述溶液，再加入4.0ml 10%的TCA 。将1-5号试管分别于60、70、80、90和100℃加热处理15min ，0号试管不进行加热处理，于室温下放置15m in ，继而按标准程序测定O D 值，平行测定一次，实验结果见表1。

表１　　　　反应温度对测定结果的影响

Table 1 Influence of reaction temperature on OD

反应温度(℃) OD 值

600.450

700.449

800.446

900.440

1000.445

室温0.442

主要仪器和设备

(1) 紫外可见分光光度计，UV-9100型，北京瑞利分析仪器公司。

(2) 低速离心机，LD5-2A 型，北京医用离心机厂(3) 超级恒温水浴锅，BO220型，上海实验仪器厂有限公司。

(4) 电子分析天平，AL204型；PH 计，DELTA 320型，METTLER TOLEDO 公司。1.2

方法

多肽含量的测定程序：取2. 5m l 样品溶液，加入2.5ml 10%(W/V)的三氯乙酸(TCA)水溶液，于漩涡混合仪上混合均匀，静置10m in ，然后在4000r/min下离心15min ，将上清液全部转移到50m l 容量瓶中，并用5%的TCA 定容至刻度，摇匀。然后取6.0m l 上述溶液置另一试管中，加入双缩脲试剂4.0m l(样液:双缩脲试剂=3:2，V/V)，于漩涡混合仪上混合均匀，静置10m in ，2000r/min离心10min ，取上清液于540nm 下测定OD 值，对照标准曲线求得样品溶液中的多肽浓度C(mg/ml)，进而可求得样品中多肽含量。２2.1

结果与讨论

1.1.2

2.2.1

由上表可以看出，虽然经过不同温度处理，但各组所测得的OD 值大体一致，也就是说，反应温度对测定结果的影响不是很明显，故不进行加热处理，而让其在室温下反应。2.2.2

反应时间的影响

取六支试管，分别加入上述溶液4.0ml ，10%的TCA 溶液4.0m l ，于振荡器上混合均匀，分别于室温下放置0、30、60、90、120和150m i n ，继而按标准程序测定O D 值，平行测定一次，结果见表2。

表２　　　反应时间对测定结果的影响

Table 2 Influence of reaction time on determine results 反应时间(min)OD

00.443

300.442

600.442

900.442

1200.441

1500.441

标准曲线的制作

取十个10ml 的容量瓶，用5%的TCA 依次配制0.0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6和1.8m g/ml 的Gly-Gly-Tyr-Arg 四肽标准溶液，然后分别取6.0ml 标准溶液，加入4.0ml 双缩脲试剂，于漩涡混合仪上混合均匀，静置10min ，2000r/min 离心10m in ，取上清液于540nm 下测定OD 值(以第一管做空白对照) 。以肽的浓度为横坐标X(mg/ml)，OD 值为纵坐标Y ，制作标准曲线(图1) ，得到回归方程y=0.3681x+0.0013，R 2=1。2.2

沉淀反应的温度和时间对测定结果的影响

称取30.00g 全脂奶粉，溶于200m l 蒸馏水中，加入胰酶0.6000g(E/S=2%，W/W)，于温度38℃，pH8. 5(以30%NaOH溶液维持pH) 的条件下进行水解。水解30min 后，立即将水解液于90℃灭酶处理10min ，然后

由上表可以看出，反应时间对测定结果几乎没有影响，这就是说TC A 能迅速使蛋白质沉淀下来，反应速度很快。故在混合均匀后即可进行下面的实验，而无需等待。2.3

回收率实验

配制4.0mg/ml的Gly-Gly-Tyr-Arg 四肽水溶液，按

标准程序测定其中多肽含量。实验重复6

次，结果见表

表３　　　　标准肽的回收率

Table 3 Yield of standard peptide

测定值(mg/ml)

Gly-Gly-Tyr-Arg 3.98±0.03Gly-Gly-Tyr-Arg+全脂奶粉3.75±0.05

理论值(mg/ml)回收率(%)

4.099.5±0.754.093.8±1.3

3，与理论值几乎完全吻合，回收率为99.5%±0.75%。

用10%的全脂奶粉水溶液配制4.0mg/ml的Gly-Gly-Tyr-Arg 四肽溶液，按标准程序测定其中多肽含量。实验重复六次，结果见表3，回收率为93.8%±1.3%。全脂奶粉中的矿物质影响体系的OD 值，这在后续试验中将有所涉及。2.4

精密度测试

配制4.0mg/ml的Gly-Gly-Tyr-Arg 四肽水溶液，按相同程序进行6轮平行测定，以检验测定程序的精密度，结果见表4。

表４　　　　　精密度实验

Table 4 Precision experiment

测定轮数x i1

13.9523.9534.0044.0553.9564.00

∑ 47.85

x i24.003.954.103.954.003.95

d i = xi1- xi2

-0.050.00-0.100.10-0.050.05-0.05

d i20.00250.00000.01000.01000.00250.00250.0275

S i2

0.0012500.0050.0050.001250.001250.01375

表６　　　不同水解时间的大豆蛋白水解液中的多肽含量

Table 6 Peptides content of soybean protein hydrolysate at

different time 水解时间(min)OD 值

150.479

300.510

450.535

600.550

750.561

900.568

2.6钙铁锌的干扰试验

按钙铁锌在奶粉中的一般用量：乳钙(50～100mg/kg) 、葡萄糖酸锌(230～470mg/kg)、焦磷酸铁(300～500mg/kg)，分别配制含相应浓度钙铁锌离子的Gly-Gly-Tyr-Arg 四肽溶液(四肽浓度的理论值为4.0mg/ml)。结果见表7。

表７　　　　钙铁锌对测定结果的影响（ｍｇ／ｍｌ）

Table 7 Influence of calcium, iron and zinc on determine results

(mg/ml)

钙3.85

铁3.79

锌3.85

注: xi1和x i2为平行测定值, S i 2为方差。

由表7可见，钙铁锌离子的存在对样品溶液中多肽含量的测定是有影响的；铁离子的影响比钙和锌稍显著。这就可以解释为什么不同奶粉溶液的OD 值有差异了。３3.1

结　　论

本文成功建立了测定蛋白水解液中多肽含量的方

精密度S w =(∑S i 2/n)1/2为0.0479(n为测定轮数) ，标准偏差Cv=[(Sw /x)×100](x为测定平均值) 为1.2%，平均值为3.99mg/ml。2.52.5.1量

将10%的全脂奶粉，10%的脱脂奶粉，10%的大豆分离蛋白，10%的脱脂大豆蛋白粉和2.0mg/ml的大豆肽样按标准程序测定O D 值，结果见表5。

表５　　全脂奶粉、大豆蛋白粉和大豆肽样中的多肽含量

Table 5 Peptides content of whole milk powder, soybean protein

powder and soy bean peptides 样品OD 值

脱脂奶粉-0.060

全脂奶粉-0.060

大豆分离蛋白0.080

脱脂大豆蛋白粉0.048

大豆肽样0.446

应用研究

全脂奶粉、大豆蛋白粉和大豆肽样中的多肽含

法，标样回收率99.5%±0.75%～93.8%±1.3%，精密度0.0479，标准偏差1.2%，适用范围0.2～1.8mg/ml。3.2

在实际应用时，不同蛋白质原料未水解时的水溶液，用本法所测O D 值虽不为零，但数据较小，对结果影响不大；原料中含有钙铁锌离子时，会使测定结果偏小，并且铁离子的影响比钙和锌离子稍显著。

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由表5可以看出，奶粉溶液能使体系的OD 值偏低；大豆蛋白粉溶液则使得体系OD 值偏高。在预备实验中也发现，不同厂家的产品之间也有差异。2.5.2

不同水解时间的大豆蛋白粉水解液中的多肽含量称取20.00g 大豆蛋白粉，溶于200ml 蒸馏水中，然后加入Protamex 酶0.4000g(E/S=2%)，于温度50℃，pH7.00下进行水解。每隔15min 取样一次，经灭酶后按规定程序测定O D 值，结果见表6。