乳酸菌发酵剂高密度培养的研究
第5期 2004年5月
CHINACONDIMENT
中国调味品
No.5May.2004
文章编号:1000-9973(2004)05-0017-05
乳酸菌发酵剂高密度培养的研究
熊晓辉,于修
,熊强,陆利霞
(南京工业大学制药与生命科学学院,江苏南京 210009)
摘要:研究了乳酸菌生长繁殖的环境条件(温度、接种量、起始pH等)和培养基组成(氮源、碳源、缓冲盐等),优化确定了乳酸菌发酵剂的适宜培养条件为:起始pH值为6.5,培养温度为37 ,培养基配比为麦芽糖 乳糖(1 1)2%、牛肉膏1.0%、缓冲盐A0.5%、NaCl0.25%、MgSO40.1%,接种量4%,进一步探索了半连续法进行高密度培养,结合优化的培养条件,可使乳酸菌的液体发酵活菌密度至1.1 1012CFU/mL。
关键词:乳酸菌;发酵剂;高密度培养中图分类号:TS201.5 文献标识码:A
Highcelldensitycultureoflacticacidbacteriastarter
XIONGXiao hui,YUXiu jian,XIONGQiang,LULi Xia
(CollegeofLifeScienceandPharmaceuticalEngineering,NanjingUniversityofTechnology,Nanjing210009,China)
Abstract:ThispaperstudiedonthehighcelldensitycultureofLactobacillusspp.,anddiscussedtheeffectsofculturalcondition(temperature,inoculationcapacityandinitialpH)andmediacomposition.Theoptimalculturingconditionsweredeveloped,following:1%maltose,1%lactose,1.0%beefex tract,0.5%buffersaltA,0.25%sodiumchloride,0.1%magnesiumsulfate,pH6.5,4%inoculationcapacity.Thenhighcelldensityculturewasexploredwithonesemi-continuouswayandobtainedthecellspopulationover1.1 1012CFU/mLfor16hoursbasedontheoptimalcondition.Keywords:Lacticacidbacteria;starter;highcelldensityculture
乳酸菌是生产发酵乳制品、泡菜、干酪、发酵香肠等传统发酵食品,赋予其特殊质地、风味和口感的重要微生物菌群,而这些传统食品的专用发酵剂的生产和研制将对实现其工业化生产、缩短产品成熟期、使产品特征标准化和安全化起重要作用,也是传统食品的发展方向[1,2]。浓缩发酵剂[1,3,4](特别是冻
收稿日期:2004-02-25
干发酵剂)具有活力高、体积小、携带使用方便的特点,可直接用于发酵制品生产,省去扩大培养的复杂操作过程,从而简化产品生产工艺,有利于保持产品质量的稳定,防止菌种的退化和污染。
乳酸菌浓缩发酵剂制备的关键是要实现对其进行高活性、高密度的培养[1,4]。高密
基金项目:国家862自然科学基金资助项目(2002AA8041)
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度培养技术(HighCellDensityCulture,HCDC),即高密度发酵技术,一般指在液体培养中的细胞密度超过常规培养10倍以上的生长状态或培养技术,达到提高菌体发酵密度的目的。不仅可减少培养体积,还可以缩短生产周期、减少设备投资从而降低生产成本,能极大地提高产品市场竞争力[4]。不同菌种(株)在达到高密度的水平上有极大差别。
本文在研究环境因素(温度、起始pH值、接种量)和培养基组成及缓冲盐对乳酸菌生长繁殖影响的基础上,采用半连续高密度培养技术,对乳酸菌高密度培养进行了初步的探索,为进一步制备乳酸菌发酵剂奠定基础。
1.3 方法
1.3.1 种子的制备:接种活化的斜面菌种于种子培养基,于37 厌氧培养箱培养6h。1.3.2 发酵培养:将制备的种子接种(3%接种量)于发酵培养基(根据实验设计进行),于厌氧培养箱培养16h,即为制备的发酵液用于各指标的测定。其中接种量因素依实验设计进行。
1.3.3 半连续高密度培养:于厌氧培养箱培养一定时间后,无菌低温离心(10000r/min)10min,再用等量新鲜培养基替换原发酵液,继续培养1.5~2.0h,测定各指标。1.3.4 酸度
[5]
:以吉尔涅尔度( T)表示,即
每100mL发酵液消耗1mL0.1MNaOH溶液记为1 T的酸度。
1.3.5 活菌计数方法:将发酸液按10倍梯度进行系列稀释,取0.1mL以计数培养基于37 培养48h,每一稀释度重复3皿,计数发酵液活菌数(CFU/mL)。
1.3.6 pH值的测定:采用PHS-3C精密酸度计直接测定发酵液pH值。
1.3.7 还原糖的测定[6]:苯酚硫酸法。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 菌种:乳酸杆菌(Lactobacillusspp.),本实验室分离和保藏。1.1.2 培养基
种子培养基:葡萄糖1%、胰蛋白胨1%、牛肉膏0.5%、酵母膏0.5%
基础发酵培养基:葡萄糖2%、胰蛋白胨1%、吐温80 0.05%、NaCl0.25%、MgSO40.1%
计数培养基(MRS):葡萄糖2%、蛋白胨1%、牛肉膏1%、酵母膏1%、K2HPO40.2%、NaAc0.5%、MgSO40.058%、MnSO40.025%、吐温80 0.1mL、柠檬酸二胺0.2%、琼脂1.5%、pH6.2~6.4。1.2 仪器与设备
厌氧培养箱:YQX型 上海跃进医疗器械厂。
pHS-3C精密酸度计:上海雷磁仪器2 结果与分析
2.1 温度对乳酸菌培养的影响
对不同的乳酸菌最适生长的温度范围有一定的差异。对本实验室筛选的乳酸菌最适温度进行实验,结果如图1。从图1中可以看出,该乳酸菌的最适培养温度为37 ,可使发酵液中的比生长速率处于较高水平,活菌数达到最高。
2.2 接种量对乳酸菌生长的影响
将培养的种子分别以1%、3%、5%、7%接种量接种到基础发酵培养基中,测定活菌数,结果如图2。从图2可知,不同接种量对乳酸菌的高密度培养有一定的影响,乳酸菌
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种量时,活菌量降低,可能因接种量大,乳酸菌生长量多,后期由于营养的缺乏而导致部分菌体死亡。这一点可从培养液的浊度较大上来反映。因而考虑到种子的培养量,选择5%
接种量为宜。
从中可以看出牛肉膏对乳酸菌影响最为显著,选择其作为最适氮源。
图3 起始pH值对乳酸菌培养的影响
图1 温度对乳酸菌培养的影响
图4 不同氮源对乳酸菌生长的影响
2.4.2 不同碳源对乳酸菌生长的影响:选择乳糖、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖和乳糖组成的复
图2 接种量对乳酸菌培养的影响
合糖,含量均为2%,测定培养16h后发酵液的滴定酸度( T)及活菌数,结果见图5。试验结果表明,添加不同碳源对滴定酸度和活菌数均有明显影响。分析活菌数量,添加复合碳源麦芽糖 乳糖(1 1)时最高,葡萄糖最低。而滴定酸度麦芽糖最低,蔗糖最高,说明乳酸菌对不同碳源的代谢产物不同;麦芽糖时产生的乳酸较少,蔗糖代谢产酸较多,不利于乳酸菌的生长。而麦芽糖与乳糖的结合可保证生长和一定pH值,缓解较低pH的抑制作用。
2.4.3 不同缓冲盐对乳酸菌生长的影响:乳酸菌在生长过程中代谢糖类产生乳酸,使得培养液的pH值不断降低,抑制乳酸菌的繁2.3 起始pH值对乳酸菌生长的影响
调节基础培养基的起始pH值5.5~7.0。培养过程中不调酸,培养16h后,测得不同起始pH值的培养基的活菌数,结果见图3。从图3试验结果看,起始pH值为6.0和6.5时,活菌数量高。起始pH值过低或过高,都不利于乳酸菌生长。因基础培养基的自然pH值为6.5左右,因此可以在试验中不调节培养基起始pH值,而且略高,避免pH值迅速降低。2.4 培养基的优化
2.4.1 不同氮源对乳酸菌生长的影响:用于乳酸菌培养的氮源种类较多,比较不同氮源(
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图5 不同碳源对乳酸菌培养和滴定酸度的影响
盐来缓解pH值。选择的缓冲盐有:A、B、C等,添加量均为0.5%。以不加任何缓冲盐基础发酵培养基为空白,对乳酸菌生长影响结果如图6。每种缓冲盐发酵前后的pH值变化见图7。分析结果表明,加入A缓冲盐能更好的缓解pH值的降低,且其活菌量也最高。这与其他的报道[7],通过缓解pH值方式来实现高密度培养的结果一致。不同的乳酸菌对酸性条件的耐性有较大的差异[8],因而维持一定的pH值可以保证其生长。2.4.4 乳酸菌发酵培养基正交优化:在单因素实验的基础上,进一步通过正交实验优化培养基,确定最终的乳酸菌高密度发酵培养基为麦芽糖 乳糖(1 1)2%、牛肉膏1.0%、缓冲盐A0.5%、NaCl0.25%、MgSO40.1%,起始pH值自然,接种量为4%。在此优化培养基及合适环境条件下,乳酸菌的活菌浓度为2 10CFU/mL,比最初的活菌数提高了一个数量级以上。
2.5 半连续高密度培养探索
在优化培养基的基础上,进一步探索了该菌的半连续高密度培养工艺。采用培养至对数后期的培养液进行补充新鲜培养基的方式,换液后培养1.5~2.0h,重复进行3次操作。每次测定发酵液中的pH、还原糖含量以及活菌量。连续3次操作培养液的pH变
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残留如图8所示。
图6 缓冲盐对乳酸菌生长的影响
图7 缓冲盐对发酵前后pH值的影响
分析图8可知,对于还原糖含量,由于活菌浓度增加,即使培养时间较短,仍有大量的糖被消耗,同时表现为pH的下降,补充新鲜的培养基可使菌体进一步生长。第2次时菌体浓度最高为1.1 10CFU/mL,浓度显著提高。而比较3次的活菌数,第3次时活菌量明显下降,光密度(OD600)却明显增加,说明这时仍有菌体生长,但其中大量死亡,有其自溶产生的抑制物可能对菌体生长起主要抑制作用,可能反映为周期内乳酸菌不能无限制的进行连续培养。有待进一步的研究。
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第5期 试验报告 乳酸菌发酵剂高密度培养的研究21
图8 半连续培养过程中pH、还原糖和活菌数变化
进行乳酸菌的高密度培养必须克服许多困难,其中主要包括有机酸类的代谢物积累对菌体自身生长的抑制作用。采用这种半连续的培养方式,如果结合膜的分离去除代谢物的抑制作用将利于乳酸菌的高密度培养,进一步实现高质量发酵剂的制备和生产。该部分试验正在进行之中。
级,为1.1 10CFU/mL。
参考文献:
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3 结论
3.1 该乳酸菌生长适宜温度为37 ,适宜初始pH值为6.5,接种量为4%。
3.2 该乳酸菌的适宜氮源为牛肉膏,结合麦芽糖与乳糖的可保证生长和一定pH值,缓解较低pH的抑制作用。
3.3 发酵过程中pH值降低,因而在发酵液中加入一定的缓冲盐,0.5%缓冲盐A,可缓解pH值降低,达到延长生长、实现高密度培养的目的。
3.4 正交实验优化得到乳酸菌发酵高密度培养基为 葡萄糖 乳糖(1 1)2%、牛肉膏1.0%、缓冲盐A0.5%、氯化钠0.25%、硫酸镁0.1%,pH值自然。
3.5 探索乳酸菌半连续高密度培养,补充新鲜培养基,可使活菌数进一步提高一个数量