脂肪干细胞的提取及鉴定

一、 脂肪干细胞（ASCs）的提取及鉴定

1、实验技术及原理：

运用细胞培养技术、流式细胞术（体外扩增后ACSs的表型会发生改变，主要体现在细胞表面蛋白和细胞因子表达的变化），差异离心术（可将基质血管细胞沉淀与悬浮的成熟脂肪细胞分离，沉淀中除ASCs，还包括血细胞、成纤维细胞和内皮细胞，基质血管细胞沉淀可以接种到孰料培养瓶中，基质细胞可贴壁，造血和其他杂质细胞不贴壁，在随后的传代过程中被出去，最终得到的ASCs可再很长时间内保持摸分化状态）。取C57BL／6 WT小鼠2只，常规麻醉消毒，取腹股沟脂肪组织剪碎至糊状，PBS液冲洗去麻药及血液，0.075%II型胶原酶消化（37℃，30分钟）以去除外基质，生理盐水终止胶原酶的消化，离心（1200g,10分钟），去上清液及未消化的脂肪，10%FBS的DMEM重悬细胞沉淀，0.16mol/L氯化氨溶解剩余红细胞，离心洗涤，过200目铜网，得到单个核细胞。镜下计数，按10⒋个细胞/ml种植在培养瓶中，37℃5%CO2孵箱培养，24小时后第一次换液，以后3天换液一次，80%融合后0.25% Trypsin,0.02%EDTA消化传代。细胞镜下作形态学观察及取第三代细胞用流式细胞仪作细胞周期及细胞免疫表型（CD29/CD44）的鉴定。

2、实验用品：

2.1 材料：C57BL／6 WT小鼠

2.2 试剂：PBS液，0.075%II型胶原酶消化，10%FBS，低糖DMEM

2.3 仪器设备：超净工作台、恒温培养箱、普通显微镜、倒置显微镜、离心机、离心管、解剖剪、眼科剪、镊子（尖头、平头和有沟镊）、小烧杯，200目铜网过滤器，低糖DMEM、血球计数板、橡皮瓶塞、酒精灯、换药碗

3、细胞培养的方法与步骤：

3.1无菌操作的要领和要求。

3.2细胞原代培养：

3.2.1操作步骤

a．培养用品消毒后，安放在超净工作台内，紫外线消毒，做好洗手等准备工作。

b. 取材：取C57BL／6 WT小鼠2只，常规麻醉消毒，取腹股沟脂肪组织剪碎至糊状，PBS液冲洗去麻药及血液。

c. 消化：将漂洗后的组织至于平皿中,加入胶原酶（0.075%II型胶原酶, PH），用量（0.1-0.3ug/ml或200U/ml），再用移液管移至烧瓶中，置于37℃水浴或恒温箱中30分钟），每隔5-10min振荡一次。30min后，生理盐水终止胶原酶的消化。

d. 离心和计数：将离心管做好标记，平衡后以（1200g,1200r/min 10分钟），去上清液及未消化的脂肪，10%FBS的DMEM重悬细胞沉淀，0.16mol/L氯化氨溶解剩余红细胞，将收集的细胞悬液经200目铜网过滤，1200r/min 离心10分钟（先后顺序），得到单个核细胞。加入培养液吹打混匀后取样计数。根据计数结果调整细胞浓度为10⒋个细胞/ml。

e．接种培养：每10cm2的培养瓶接种1ml的细胞悬液，再添加4ml的培养液，盖紧瓶塞。标上名称、组号和日期，在倒置相差显微镜下观察细胞分散情况后，置于37℃5%CO2孵箱培养。

3.2.2 观察

每天对接种培养的细胞做常规性检查。观察的主要内容：污染与否、细胞生长状态和pH（培养液颜色变化）等情况。如发现培养液变为柠檬黄色有浑浊，表明已被污染，细胞也就不易贴壁生长而逐渐死亡。如培养液颜色变为紫色，可能系培养瓶有裂口或瓶塞漏气，CO2逸出或由于细胞生长不良有大量死亡。如培养液为橘红色，一般说明细胞生长状态良好。

在没有发生污染，接种24h后，可见到许多细胞贴壁（由圆形悬浮状态的细胞延展成短梭状），24小时后第一次换液，以后3天换液一次。培养3-4天时，细胞生长繁殖，细胞数量增加，并可见细胞形成孤立小片（细胞岛），逐渐扩展，细胞透明，颗粒啥，界线清晰。7-10天细胞已基本铺满瓶壁形成致密单层，（80%融合后）可进行传代培养。

3.3细胞传代培养

3.3.1操作步骤

a．取一瓶脂肪干细胞在倒置相差显微镜下观察，培养细胞如长成致密的单层，即可进行传代。

b．将培养瓶带人超净工作台，倒去细胞培养液，吸取2ml-3ml PBS加入培养瓶中，轻轻振荡后倾去，可重复进行一次。

c．加入5-8滴0.25% Trypsin,0.02%EDTA，转动培养瓶，使其湿润整个细胞层，置于室温下笑话2-3min。翻转培养瓶，肉眼观察细胞单层，见细胞单层薄膜上出现针孔大小空隙时即可倒去消化液。如见消化程度不够时可再延长消化1-2min。如见细胞大片脱落，表明已消化过头，则不能倒去消化液而直接进行下一步操作。

d．加入3ml培养液于培养瓶中终止消化。吸取瓶中培养液反复冲瓶壁上的细胞层，直至瓶壁上的细胞全被冲下，再轻轻吹打混匀，制成单细胞悬液。取样计数，调整细胞浓度为10⒋个细胞/ml。吸取1ml细胞悬液加到另一培养瓶中，原瓶留下1ml细胞悬液，弃去多余悬液（可分别提取1ml接种分配到多个培养瓶中），并向每瓶中加4ml培养液。盖好瓶盖，标上名称、组号和日期，在倒置相差显微镜下观察细胞分散情况后，置于37℃5%CO2孵箱培养。

3.3.2观察

细胞传代后，每天对细胞进行观察，注意污染与否、细胞贴壁和生长状态等情况

消化传代。此过程中所做处理同原代培养。注意观察细胞五个时期的特点（游离期、吸附期、繁殖期、维持期、衰退期）。

细胞已基本铺满瓶壁形成致密单层，这时可进行再次传代培养。

4细胞镜下作形态学观察及取第三代细胞用流式细胞仪作细胞周期及细胞免疫表型（CD29/CD44）的鉴定

4.1在细胞镜下作形态学观察，与正常形态比较（原代培养后，传代2-3次，ACSs呈现单层，大而扁的细胞形态，其直径在25-30um，待细胞达到汇合时，它们形态上呈纺锤形，类似于成纤维细胞）

4.2细胞周期分析

分别取生长融合达30%-40%和90%以上的第三代细胞，以4°C预冷的70%冰乙醇固定，4°C放置24小时；用PBS洗涤2次；加入RNA酶10ug和碘化丙啶（PI）0.3ml重悬细胞（4°C，30分钟）。用流式细胞仪以FL2红色荧光条件检测。应用Modfit LT 2.0 软件分析细胞周期。

取第三代细胞用流式细胞仪作细胞周期及细胞免疫表型（CD29/CD44）的鉴定。

4.2细胞表面分子免疫标记的鉴定

a.方法：直接免疫荧光法

b．试剂及材料：单克隆抗体 CD29 PE，CD44 PE,及同型对照抗体；细胞洗液：含2%BSA、0.1%NaN3的PBS；固定液：1%多聚甲醛PBS液（pH7.2）；4、流式细胞仪。

c．操作方法：

6 每个样品取2只，分别标记同型抗体作为阴性对照、待测，分别加入10个

/100ul待测细胞。对同型对照管中加入荧光标记单克隆抗体 CD29 、CD44 对照抗体作为阴性对照，待测管加入荧光标记单克隆抗体 CD29 PE，CD44 PE为实验管，各20ul，混匀。置于于室温避光孵育 30分钟，加入2ml 的PBS，1200r/min 离心 10min，弃上清，控干，加入固定液0.5ml（染色缓冲剂）。先测同型对照，再测实验管。软件采集数据，分析阳性细胞比例。

二、携带PTN表达基因的脂肪干细胞的获取及鉴定

1、实验技术及原理：运用基因转染技术，将带PTN基因的反转录病毒载体转染到脂肪干细胞，抗生素G418和流式细胞仪筛选，得到PTN高表达的脂肪干细胞。

2、具体操作：

2.1材料及试剂：

2.2 脂肪干细胞的准备：被用于作靶基因转染的细胞，其生长状态如何，将直接决定了基因转染效率。如为贴壁生长的细胞，一般要求在转染前一日，必需应用胰酶处理成单细胞悬液，重新接种于培养皿或瓶，细胞密度以铺满培养器皿的60%为宜，转染当日，在转染前4小时换一将近新鲜培养液。对于悬浮细胞，也需在转染前4小时换一次新鲜培养液。

2.3将带PTN基因的反转录病毒载体转染到脂肪干细胞，带有PTN基因混合物应当逐滴加入，尽可能保持一致，从培养皿一边到另一边，边加入边轻摇培养皿，以确保均匀分布和避免局部高浓度。 2.4用抗生素G418和流式细胞仪筛选，得到PTN高表达的脂肪干细胞 G418筛选要做预试验确定最佳浓度，将细胞稀释至1000cell/ml，每孔100ul加入有培养基的24孔板，将每孔中的G418浓度稀释至0,100, 200,300, 400,500, 600,700, 800,900, 1000,1100ng/ml等１2个级别, 培养10-14天，以最低细胞全部死亡浓度为基准，一般400-800左右，筛选时比该浓度再高一个级别，维持使用筛选浓度的一半

流式细胞仪分析：SHG-44、SHG-44-vect、SHG-44-重组pcDNA3→单细胞悬液→70%酒精固定→裂解细胞→核糖核酸酶消化→碘化丙啶染色→上机分析G1期和G2/M、S期比例。