乳酸菌同源重组载体的构建与鉴定

７６８

武警医学院学报

ＡｃｔａＡｃａｄｅｍｉａｅＭｅｄｉｃｉｎａｅＣＰＡＦ

第１９卷第ｌｏ期２０１０年１０月

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乳酸茵同源重组载体的构建与鉴定

赵学峰，罗丽贞，区云枝（南方医科大学附属南海医院，广东佛山５２８２００）

摘要：【目的】构建乳酸菌同源重组载体，实现外源基因在乳酸菌中的整合型表达。【方法】根据乳酸菌Ｌ．１ａｃｔｉｓＭＧｌ３６３全基因组中ｎｙＡ基因序列设计引物，ＰｃＲ扩增乳酸菌基因组中ＴｈｙＡ基因起始密码上游及终止密码下游约１０００ｂｐ的基因序列，将

获得的目的基因依次克隆至载体ｐＭｕｌｌＮ４中，以琼脂糖凝胶电泳检测目的条带，以双酶切技术、ＤＮＡ测序予以确证。【结果】琼脂糖凝胶电泳结果显示，目的基因成功扩增，双酶切及ＤＮＡ测序结果证实，成功构建了同源重组载体—ｒｒＩｌｙＡ—ｕｐ—ｄｏｗｎ。【结

论】乳酸菌同源重组载体ｐ．１１１ｙＡ—ｕｐ—ｄｏ姗为实现外源基因在乳酸菌中的非抗性、整合型表达奠定了基础。

关键词：乳酸菌；同源重组；，Ｉ＇｝ｌｙＡ

【文章编号】ｌ００８—５０４１（２０１ｏ）ｌｏ一０７６８—０４【中图分类号】Ｒ１３９．６５【文献标识码】Ａ

ＣＯｎｓｔｒｕｃｔｉＯｎａｎｄｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉＯｎＯｆＩａｃｔｉｃ—ａｃｉｄｂａｃｔｅｒ．ａｈｏｍ０１０９０ｕｓｒｅｃＯｍｂｉｎａ“ＯｎＶｅｃｔＯｒ

ＺＨＡＯＸｕｅ—ｆｅｎｇ，ＬＵＯＬｉ—ｚｈｅｎ，ＱＵＹｕｎ—ｚｈｉ（ＮａｎＨａｉＨｏｓｐｉｔａｌ０ｆＳｏｕｔｈＭｅｄｉｃａｌＵｎｉＶｅｒｓｉｔｙ，Ｆｏｓｈａｎ５２８２００，ＣｈＩｎａ）

Ａｂｓｔ忸ｃｔ：【ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ】Ｔｏｃｏ璐ｔｎｌｃｔ

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ｂａｃｔｅｆｉａ；Ｈ砌ｏｌｏｇｏｕｓ

乳酸菌（１ａｃｔｉｃ—ａｃｉｄｂａｃｔｅｒｉａ）广泛存在于人、畜、禽的肠道，能够调节机体胃肠道正常菌群生态平衡，提高食物消化率和生物价，降低血清胆固醇，控制机体内毒素、肠道内腐败菌生长繁殖和腐败产物的产生，制造营养物质，刺激组织发育，从而对机体的营养状态、生理功能、细胞感染、药物效应、毒性反应、免疫反应、肿瘤发生、衰老过程和应急反应等产生作用。

目前，已有众多文献报道为保持一定的选择压力，大多带有１个或多个编码特定抗生素抗性的基因（如红霉素抗性基因等），存在潜在的抗生素耐药

［收稿日期］２００９一“一２３；［修回日期］２０ｌＯ－０３一１２

［作者简介］赵学峰（１９７５一），男，籍贯河南，硕士，主治医师，主要从事临床检验工作。

性播散的危险。细菌的营养缺陷型是指细菌的某些基因如管家基因编码的产物催化细菌的基本代谢反应，这些基因突变或缺失后，不能合成相应产物，导致细菌在外界环境中或基本培养基上不能生长，需要补充相应的底物。胸苷酸合成酶（ｔｈｙｍｉｄｙｌａｔｅｓｙｌｌｔｈａｓｅ，ＴｈｙＡ）基因编码胸苷酸合成酶，在ＤＮＡ合成中起关键作用，缺失ＴｈｖＡ基因的菌

株在基本培养基上不能生长；染色体整合是一种有

效的改造微生物的手段，插人序列、转座子和同源重组是染色体整合的通常形式，其中同源重组的特点是能够按人们所预期的基因位置进行染色体整合‘１埘。

因此，我们拟利用细菌营养缺陷型互补和同源

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重组的原理。构建一个可应用于乳酸菌的同源重组载体。利用该同源重组载体，可将目的基因整合于消化道共生乳酸菌染色体中，实现外源基因在乳酸菌中的整合型表达，为构建能高效、安全分泌表达外源目的基因的转基因乳酸菌奠定基础。

１１．１

海英俊公司合成。其余试剂均为国产分析纯。

方

法

１．２．１Ｌ．１ａｃｔｉｓ

ＭＧｌ３６３基因组ＤＮＡ的制备及质粒小

量提取：（１）参考革兰阳性菌基因组ＤＮＡ提取试剂盒说明书进行。主要操作如下：收集适量处于对数生长期的乳酸菌细菌沉淀，加入适量溶菌酶，充分酶解后加入适量无水乙醇混匀，将其全部转移至柱中。充分洗涤后用洗脱液将吸附在柱子膜上的ＤＮＡ洗脱，采用紫外分光光度法测定基因组ＤＮＡ浓度，一８０℃保存、备用。（２）参考质粒小量提取试剂盒

材料与方法材料

１．１．１菌株、质粒、培养基和生长条件：大肠杆菌

ＤＨ

５ｄ、乳酸乳球菌ＭＧｌ３６３（Ｉｍｔｏｃｏｃｃｕｓ

ｌａｃｔｉｓ

ＭＧｌ３６３）、质粒ｐＭｕｌｒＩＮ４¨１由本室保存。ＤＨ５ｄ常规培养用ＬＢ培养基，３７℃振荡培养；乳酸菌常规培

说明书提取质粒ＤＮＡ（碱裂解法）。采用紫外分光

光度法测定质粒ＤＮＡ浓度，一８０℃保存、备用。１．２．２引物设计及目的基因的ＰｃＲ扩增：（１）引物设计。根据己发表的乳酸菌Ｌ．１ａｃｔｉｓＭＧｌ３６３全基

养在ＧＭｌ７培养基（Ｍ１７培养基，ｏ．５％葡萄糖），３０℃

静止培养。氨苄青霉素在Ｅ．ｃｏ矗培养中的浓度为

１００州ｍｌ。

１．１．２主要试剂和材料：高保真ＤＮＡ聚合酶、Ｔ４ＤＮＡ连接酶、ＤＬ２０００Ｍａｒｋｅｒ、限制性内切酶均购自大连Ｔａｋａｒａ公司；Ｍ１７购自Ｏｘｏｉｄ公司；质粒抽提试

因组中Ｔ｝ｌｙＡ基因序列Ｈ】，用软件研ｍｅｒ５．０设计引物

并引入相应的酶切位点，用作重组质粒的多克隆位点（表１）。引物委托英俊公司合成。

剂盒、ＤＮＡ纯化试剂盒购自ｓｉ舯ａ公司；引物委托上

表１

引物序列及其引入的酶切位点

汪：引物加粗斜体郡分为酶切位点，Ｆ划线邵分为引入的酶切位点

１．２．２．１胸苷酸合成酶（Ｔｈｙｍｉｄｙｌａｔｅ

ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ，

泳检测。胶回收纯化目的片段，一８０℃保存、备用。１．２．２．３同源重组载体的构建策略与鉴定：纯化后的ＴｈｙＡ—ｕｐ基因片段与质粒ｐＭｕｌｒＩＮ４经ＥｃｏＲＩ和Ｂａｍ肌双酶切后连接，转化感受态ＤＨ５ａ，涂布于含氨苄青霉素的ＬＢ平板，３７℃培养。次日挑取单菌落增菌，提取质粒进行ＥｃｏＲＩ和踟ｍ丑Ｉ双酶切鉴定，构建的重组质粒命名为ｐｒｎｌｙＡ—ｕｐ。重组载体ｐ１．｝ｌｙＡ—ｕｐ和制备好的ＰｃＲ片断ＴｈｙＡ—ｄｏｗｎ经

卟ｙＡ）基因ＡＴＧ上游片段（１１１ｙＡ—ｕｐ）的ＰｃＲ扩增与

鉴定：ＰＣＲ扩增乳酸菌基因组中ＴｈｙＡ基因起始密码上游１

０５０

ｂｐ片断。ＰＣＲ反应体系如下：５×ＰｃＲ

Ｂｕ｛｛Ｉｆｌｅｒ（Ｍｇ＋ｐｌｕｓ）ｌＯ

Ｐｒｉｍｅ研ＡＲ

Ｐ０ｌｙｍｅｍｓｅ

ｍ，ｄＮＴＰ

Ｍｉｘｔｕｒｅ４ＨｓＤＮＡ

ｐｌ，模板２¨ｌ，引物各１斗ｌ，蹦ｍｅｒＳＴＡＲ

９８℃预变性３０

０．５“ｌ，补水至５０斗ｌ。反应条件如下：

ｓ；９８℃１０ｓ，６０℃１０ｓ，７２℃ｌ

ｍｉｎ，共

３０个循环；７２℃延伸５ｍｉｎ。扩增产物用１％琼脂糖凝胶电泳检测。胶回收纯化目的片段，一８０℃保存、备用。

１．２．２．２

勘ｍ胁和５ａⅡ双酶切后连接，转化感受态ＤＨ

５仅，

涂布于含氨苄青霉素的ＬＢ平板，３７℃培养。次日挑取单菌落增菌，提取质粒经舶ｍ脚和ｓａ且双酶切鉴

ＴｈｙＡ基因终止密码下游片段（１ＩｈｙＡ—ｄｏｗｎ）定，构建的重组质粒命名ｐＴｈｙＡ—ｕｐ—ｄｏｗｎ。见图１（见封三）。

２２．１

的ＰＣＲ扩增与鉴定：ＰｃＲ扩增乳酸菌基因组中ｒｒ｝ｌｙＡ基因起始密码下游１

０１０

ｂｐ片断。以

结果

ｒｎｌｙＡ—ｄｏｗｎ—Ｆ和ＴｈｙＡ—ｄｏｗｎ—Ｒ为引物，ＰＣＲ反应体系、反应条件同上。扩增产物用１％琼脂糖凝胶电

ＴｈｙＡ—ｕｐ基因的ＰｃＲ扩增与鉴定

以乳酸乳球菌基因组为模板，进行ＰｃＲ扩增，

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ｍａｒｋｅｒ）：来自乳酸菌的ＴｈｙＡ基因和能在乳酸菌中进行抗性筛选的红霉素基因（当整合完成的同时，红霉素抗性基因随之丢失）。此外，目的基因与染色体发生重组是个随机过程，重组效率很低，后期阳性克隆的获得需要大量的筛选工作。而报告基因Ｌａｃｚ的引入，可在培养基上直接挑取蓝色菌落进行鉴定，从而提高筛选效率，并大大简化阳性克隆筛选的过程。

同源重组的特点是能够按人们预期的基因位

乳酸菌中的整合型表达，而不引入抗药性基因和其

他外源基因，使得插入的外源ＤＮＡ片断最小化，并

且不会发生外源基因的水平转移，因此这种乳酸菌同源重组载体具有较高的生物安全性，可望安全有效的应用于相关疾病的防治。

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ＫＰ，Ｍｅｒｃｅｒ

置甚至碱基序列位置进行染色体整合。ｎｙＡ是一

种广泛存在于原核、真核细胞中的管家基因。ｒ１１ｌｙＡ基因编码胸苷酸合成酶，在体内ＤＮＡ合成中起关键作用，，１１ｌｙＡ基因缺失导致ｄＴＭＰ从头合成途径受阻，以至于ｒ１１ｌｙＡ缺失株不能在体外环境中生长哺Ｊ】。除非在培养基中添加胸腺嘧啶或胸苷，或导入含有完整ｒｎｌｙＡ基因野生型序列的互补质粒后，才能使其生存。ＴｈｙＡ基因的上述特点使其成为筛选标志基因。

研究证实，在同源重组的染色体整合中，同源片段越长，整合频率越高，通常情况下，只要达到

３００

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Ｖ，Ｄｅｎ，ｙｎ

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【４】Ｗｅｇｍ蚰ｎＵ，０’ＣｏｎｎｅⅡ一ＭｏｔｈｅｒｗａｙＭ，Ｚｏｍｅｒ凡ｅｆ吐

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Ｂａｃｔ耐ｏｌ，２００７，１８９（８）：３２５６＿３２７０．

【５】王海英，祁克宗，彭开松．乳酸菌食品级基因表达系统的

ｂｐ的同源片段的同源重组是完全可以成功

的‘８。。因此，我们扩增了Ｌ．１ａｃｔｉ８ＭＧｌ３６３染色体

研究进展叽上海畜牧兽医通讯，２００８，ｌ：８－９．

［６】Ｓ硒ａｋｉ

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ｎｙＡ基因起始密码上游和终止密码下游各约１

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ｂｐ的基因序列作为同源片断，从而提高外源基因在乳酸菌染色体中的整合效率。同时在引物序列中

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Ｍｉｃｍｂｉｏｌ，２００４，７０（３）：１８５８—１８６４．

引入６个酶切位点（ＫｐｎＩ、Ａｏｒ３ＨＩ、ＦｓｅＩ、Ｂ砌ＨＩ、

Ｓｓｅ８３８７Ｉ、ｘｈｏＩ），作为同源重组载体的多克隆位点，可根据研究需要插入不同目的基因在乳酸菌染色

【７】ＰｅｄｅｒｓｅｎＭＢ＇Ｊｅ璐ｅｎＰＲ，ＪａｎｚｅｎＴ，ｅｆ吐Ｂａｃｔｅｒｉ叩ｈａｇｅ

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Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，

体上进行同源重组。—ｎｙＡ—ｕｐ—ｄｏｗｎ也可携带目的

基因在含１ＩｌｌｙＡ基因的其他细菌中进行染色体整合。

在下一步研究中，我们拟利用携外源基因的同源重组载体ｐＴｈｙＡ—ｕｐ—ｄｏｗｎ，通过双交叉同源重组，替换乳酸菌基因组中的，１１ｌｖＡ基因，实现目的基因在

２００２，６８（６）：３０１０—３０２３．

【８】Ｂ诂Ｍ鹪Ｉ，ＧｎｌｓｓＡ，Ｅｈｄｉｃｈ

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（责任编辑：赵爱源）

（上接第７６７页）【５】Ｌｅｓｌｉｅ

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【７】马文丽，郑文岭，徐秋林，等【Ｐ】．一种通用引物联合标记

Ｆ，Ｋａｒ丑【ｐ肌ａｇｉｏｔｉｄｉｓ

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法．ＺＬ２００５ｌ００３３３９６．ｏ．２００８．１．２．

【８】赵雨杰．医学生物信息学【Ｍ】．北京：人民军医出版社，

２００２．６８—７２．

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（责任编辑：王奕飞）

梅毒螺旋体寡核苷酸芯片探针的设计及筛选

（正文见第７６４页）

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乳酸菌同源重组载体的构建与鉴定（正文见第７６８页）

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乳酸菌同源重组载体的构建与鉴定

作者：作者单位：刊名：英文刊名：年，卷(期)：

赵学峰， 罗丽贞， 区云枝， ZHAO Xue-feng， LUO Li-zhen， QU Yun-zhi南方医科大学附属南海医院,广东,佛山,528200武警医学院学报

ACTA ACADEMIAE MEDICINAE CPAF2010,19(10)

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10. 胡涛.崔保安.王岩.杨明凡.王学斌.张素梅 伪狂犬病病毒Min-A株TK基因的克隆与序列分析[期刊论文]-河南农业大学学报2004,38(1)

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