转基因技术在油菜育种中的应用

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CR OP RESEARCH 　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　2005(5)

转基因技术在油菜育种中的应用

黎　妮,

李　

(湖南农业大学油料作物研究所, 长沙, 410128)

摘　要:转基因油菜是近年来转基因研究很有成效的作物之一, 而且取得了重要进展。从转基因油菜在杂种优势利用、品质改良、抗除草剂、抗病虫害等方面, 综述了转基因油菜育种取得的重要进展, 并对转基因油菜育种中所存在的问题提出了一些看法。

关键词:油菜; 转基因; 遗传改良

中图分类号:S565. 403. 53　　文献标识码:A 　　文章编号:1001-5280(2005) 05-0336-06

　　在过去的近百年间, 人们已利用传统的育种方法培育出了许多农作物新品种, 并获得了巨大的经济效益。但由于传统育种方法所存在的不足及种内遗传资源枯竭等原因限制了其发展速度, 而植物基因工程则为解决这些问题提供了新的思路和方法。油菜是世界上重要的油料作物之一, 也是最早成功地进行基因转化的植物之一。自1986年M athew 等用农杆菌介导法首次把新霉素磷酸转移酶基因(N P T -Ⅱ) 转入芥菜型油菜中并获得转基因植株以来, 转基因油菜研究与发展在世界范围内取得了举世瞩目的进展, 它已成为与烟草相似的为数不多的基因工程模式植物[2, 3]。2003年, 在世界范围种植的良种油菜有31%是转基因品种[1]。目前运用于油菜品种改良的外源基因主要包括一些抗除草剂、抗虫、抗病、改良质量(脂肪酸和蛋白质) 以及雄性不育等方面的基因。

[2]

[1]

月桂树(Umbellular ia calif or nia ) 的种子中分离出酰基-ACP 硫激酶Cdna, 转入canola 油菜中, 结果使油菜

种子中脂肪酸合成到12碳时就从ACP 上释放下来, 最终得到了种子中含有40%月桂酸的转基因油菜。美国

[40]

Calgene 公司的研究人员将存在于加利福尼亚月桂树中阻止脂肪酸合成过程碳链(C12) 继续延长的硫脂酶基因(12∶0-ACPthioesfer ase) 导入油菜, 获得可以合成50%以上月桂酸的转基因油菜; 将可可(Coco nut ) 植物中能将月桂酸放在甘油三酯2号位置上的酰基转移酶(LPAAT ) 基因与12∶0-ACP 硫脂酶基因同时导入油菜, 获得了月桂酸含量高达70%的转基因油菜。1999年高月桂酸转基因油菜已经进入商业化生产。

陈锦清等[3, 7]报导, 将PE P 基因片段插入超级双元载体p I G 121的X ba I 位点, 使P EP 基因片段连接与CaM V 35S 启动子下、GUS 报告基因上游, 并与35S 启动子反向连接构建成反义PE P 植物表达载体p P EP A S , 并用电击法导入根癌农杆菌E H A 101, 然后与浙油758下胚轴共培养, 将反义PE P 转化到浙油758基因组中, 成功获得高油量转基因油菜品系超油1号。PCR 扩增检测证明, 外源基因已插入油菜基因组并得到表达, 转基因植株T 1代种子平均含油量比对照提高9. 4%。

石东乔等[8]报导, 采用农杆菌介导法, 将反义的油酸脱饱和酶基因(FA D 2基因) 导入甘蓝型油菜双低品种H 165, 获得了7株转基因植株。与所设对照植株比较, 有5株转基因油菜产生的种子中脂肪含量发生变化, 表现为油酸含量升高, 亚油酸、亚麻酸含量降低, 其中油酸最高含量为68. 72%, 比对照高20%以上。熊兴华等报导, 从甘蓝型油菜中克隆F AD 2基因cDNA 片段, 并构建种子特异型表达载体, 利用反义抑制技术, 将FA D 2反义基因转化双低油菜品种湘油[4, 9]

1　转基因与油菜品质改良

随着生活水平的提高, 人们对饮食质量的要求亦越来越高, 这就要求农业科研工作者在提高作物产量的同时, 要注重对品质的改良。油菜品质改良包括脂肪酸和蛋白质两个方面。

1. 1　油菜脂肪酸的遗传改良

油菜的脂肪酸除作为食用油以外, 在涂料、防腐剂、润滑剂、表面活性剂、医药、化妆品、胶粘剂等领域都有广泛的应用价值[11]。实践证明, 利用转基因技术改变油菜油脂的含量、芥酸的含量、油脂的结构等方面, 已经取得了一定的成果。月桂酸是制造表面活性剂的重要原料。油菜脂肪酸基因改造的典范是生产月桂酸的转基因油菜。Pollar d 等[5, 6]从富含月桂酸的加州

　　收稿日期:2005-11-15

,

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以湘油15号子叶柄为受体材料, 用基因枪法, 将反义油酸脱饱和酶F AD 2基因连在种子特异表达载体上后导入油菜, 获得8株再生植株。经PCR 与PCR-Southern 杂交检测, 其中有2株为转化株, 证明反义FA D 2基因已整合到湘油15号基因组中。

1. 2　蛋白质的遗传改良

油菜籽中不仅含有丰富的脂肪酸和多种维生素, 而且蛋白质含量也高。据分析, 白菜型和甘蓝型油菜饼粕中的蛋白质和赖氨酸含量较高, 可与大豆饼粕相媲美。与提高蛋白质有关的基因有菠菜的酰基载体蛋白因子与种子发育时的专一表达基因调节片段构建的嵌合基因、拟南芥和豌豆2S 蛋白质基因、巴西坚果富含甲硫氨酸种子蛋白基因等

[40]

[37]

2. 2　草丁膦

草丁膦是德国Hoechst 公司开发的另一个有机磷广谱、高效除草剂, 其杀草机理是抑制植物的氨基酸生物合成酶-谷氨酰胺合成酶(GS) 的合成。从潮湿链霉素(Strep tomyces hy groscop icus ) 中分离得到抗草丁膦的Bar 基因。Bar 基因编码乙酰转移酶PAT , 使乙酰辅酶A 与草丁膦游离氨基结合, 形成AC-PAT 复合物, 从而使草丁膦失去活性。应用生物技术将B ar 基

[22～24]

因导入油菜, 使油菜获得草丁膦抗性[22]。Mariani 将烟草花药绒毡层特异表达基因T A 29与解淀粉酶芽孢杆菌的核糖核酸水解酶基因bar nase 构建嵌合基因, 以抗草丁膦Bar 基因作为标志基因, 通过遗传转化导入烟草、油菜, 得到遗传工程雄性不育株。将barnase 基因的抑制蛋白bar star 基因接到TA 29基因上游区, 以抗草丁膦bar 基因作为筛选标志基因, 导入烟草、油菜, 获得雄性可育转化植株。

将臭鼻杆菌(K lebsiella p enmoniae ssp. o zaenae) 来源的B x n 基因导入油菜, 使进入油菜植株内的溴苯腈转化为3, 5-二溴-4-基苯甲酸和氨, 从而失去除草活性。钟容等把B x n 基因导入油菜的下胚轴和子叶, 获得了抗溴苯腈的转基因油菜。

[39]

[25]

。据Krebbeors,

Stay to n, Altenbach 等报导, 通过根癌农杆菌将拟南芥和豌豆2S 蛋白基因和巴西坚果富含甲硫氨酸种子蛋白基因导入油菜, 使转基因油菜蛋白质总量成倍增加, 甲硫氨酸和赖氨酸含量显著提高。浙江农科院陈锦清等育成的转基因超高含油量油菜新品种—“超油1号”和“超油2号”, 为油菜产业提供高含油量种质资源创造了良好的条件。这些事实都说明, 通过基因工程改良种子中油脂和蛋白质组成是可能的。

[7, 10]

[10]

2　转基因与抗除草剂

当前生产上应用较多的转基因抗除草剂油菜主要抗草甘膦(glyphosate ) 除草剂和抗草丁膦(glufosinate ) 除草剂, 此外还有抗溴苯腈(brom oxy ni) 、抗咪唑啉酮(imidazo linone) 和抗磺酰脲(sulfonylurea ) 等[22]。2. 1　草甘膦

草甘膦是1974年美国孟山都(Mo nsanto ) 公司注册登记的有机磷除草剂, 是一种非选择性的广谱、高效除草剂。它的作用机理是特异性地抑制植物和细菌中莽草酸羟基乙烯转移酶(EPSPS) 的活性, 因其杀草的广谱、高效、低毒、易分解、低残留和对环境相对安全等优点得到广泛应用。利用生物工程技术和方法对编码EPSPS 酶的基因进行克隆、测序和比较研究, 获得抗草甘膦的突变基因。主要有g ox , cp A -EP SP S 和ar oA 等, 将上述基因导入油菜, 可使油菜获得对草甘膦的抗性[38]。1985年, Co mai [41]将鼠伤寒沙门氏菌的ar oA 突变基因转移到烟草上, 首次获得抗草甘膦的转基因植物。目前, 加拿大等国家已登记发放了大批抗草甘膦油菜品种, 如RT 73(1995年) , Quest (1996年) , LG3295(1995年) , Hysyn101RR (1997年) , 45A 50(1998年) , 45A51(1998年) , SWArr ow (1998年) , 2[22]

3　转基因与抗虫

虫害严重影响作物的产量和质量, 制约农业经济的稳定发展。培育抗虫油菜是基因工程的一个重要应用领域。现在植物抗虫基因工程主要是利用苏云金杆菌(B acillus thuringensisi ) 的毒蛋白基因(简称Bt 毒蛋白基因) 。B t 毒蛋白基因所表达的晶体蛋白对鳞翅目和鞘翅目昆虫有毒杀作用。毒蛋白在昆虫消化道内经过蛋白酶启动后造成消化道损伤而导致昆虫死亡, 对其他生物则没有任何危害[26]。侯丙凯等[12]从苏云金芽孢杆菌克隆得到野生型杀虫晶体蛋白基因, 构建了用于油菜叶绿体定点转化的植株表达载体, 并用基因枪法将杀虫蛋白基因导入油菜, 在国际上首次实现了抗虫基因对油菜叶绿体基因组的定点整合, 并获得了具有抗虫性的油菜叶绿体工程植株。

湖南农业大学官春云院士领导的科研组运用子房注射法与农杆菌介导法成功地将Bt 杀虫蛋白基因导入甘蓝型油菜品种双低油菜“湘油13号”, 获得转基因植株。为选育高效抗虫油菜新品种, 采用酶联免疫吸附法检测了B t 杀虫蛋白基因在转基因油菜植株中的表达, 并对转基因抗虫油菜的植株性状、农艺性状和质量性状等进行了研究, 还通过喂虫实验对转基因抗虫油菜的菜青虫抗性进行了试验。结果表明, 导入基因在油

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通过进一步选择, 现已获得稳定、高效的转基因抗虫油菜新品系[13～19]。

华中师范大学李学宝等[20], 于20世纪90年代初开展油菜转Bt 杀虫蛋白基因的研究, 先后获得了芥菜型和甘蓝型油菜转基因植株。他们以转基因油菜后代(R 1和R 2代) 株系为材料, 系统地研究了苏云金杆菌杀虫蛋白基因Cr y I A 和选择标记基因np t Ⅱ导入油菜后的遗传规律, 表达强度和抗虫效应, 约一半的转化植株具有杀虫或抑虫效力, 幼虫校正死亡率最高可达78%。

Westar 的具柄子叶, 获得转基因植株。田间调查发现, 随后代中A c 阳性比例增加, 菌核病的病情指数下降, 二者为线性关系。

骞宇等以芥菜型油菜下胚轴为转化材料, 通过根癌农杆菌介导将水稻的几丁质酶基因(Rice 泸洲四陵”油菜品种中, 获得抗潮chitinase gene ) 导入“

霉素的再生转基因植株, 对部分经潮霉素筛选得到的再生植株进行了多次重复PCR 检测, 发现其中40%以上的潮霉素抗性植株均表现出较强的阳性反应, 初步证明几丁质酶基因已整合到油菜细胞核基因组中。另外, 甄伟等为研究冷诱导基因的转录因子CBF 1(C -repeat binding facto r ) 基因对植物抗寒的作用, 利用PCR 技术从拟南芥菜(A rabidop sis thaliana ) 中扩增并克隆该转录因子, 以农杆菌介导的叶盘法, 分别转化了油菜和烟草, 经PCR 程序的DNA 分析和Southern 杂交对具有卡那霉素抗性的再生植株进行了鉴定, 结果显示转基因油菜的抗寒性较未转基因油菜有明显提高, 转基因烟草抗寒性也有一定的提高。因此利用对转录因子的调控来提高植物的抗寒性可能有很好的应用前景。

[32]

[29]

4　转基因与抗病

菌核病(S clerotinia sclerotior um ) 是危害油菜的主要病害, 在我国常年发病率10%～30%, 严重年份80%以上, 一般导致减产5%～10%, 严重的50%以上。除影响产量外, 还导致种子含油量和蛋白质含量降低[27]。尤其是“双低”油菜品种由于降低了硫苷(一种十字花科植物体内先天存在的抗真菌物质) 的含量使其更易感染真菌病毒。目前通过传统育种方法在寻找抗源方面仍存在问题, 因此利用转基因技术以及已建立的油菜遗传转化体系, 在导入抗真菌病基因从而改良油菜抗病性方面具有其独特的意义。运用于抗病基因工程的目的基因有:抑制核糖体的蛋白基因、几丁质酶基因、葡聚糖酶基因、溶菌酶基因、抗菌肽基因等[2]。几丁质酶是现今研究得最多且应用最广泛的抗真菌蛋白之一, 它能催化真菌细胞壁的重要物质之一几丁质(聚乙酰胺基葡萄糖) 水解, 从而抑制真菌的生长和增殖。利用分子生物学手段将带有强启动子的几丁质酶基转入某些作物, 转化植株组成型超量表达几丁质酶, 可有效增强其抗病性。

Grison 等人利用组成型表达的几丁质酶基因转化油菜, 使其对一些真菌性病害的抗性增强。目前用几丁质酶和葡聚糖酶基因同时转化植物从而提高其抗病性的研究也已在烟草中取得成功。

蓝海燕等[28]利用农杆菌转化法, 将组成型表达B -1, 3-葡聚糖酶及几丁质酶基因的双价植物表达载体PBDGC 转化优质甘蓝型油菜品种H165, 并得到了抗卡那霉素(K annom ycm ) 的再生植株。对转基因植株进行了活体接种油菜菌核病菌, 试验表明, 部分转基因植株比对照显示较强抗病性。

朱常香等[30]以大白菜栽培品种“福山大包头”的子叶柄为供试材料, 将芜菁花叶病毒的CP 基因(T uM V -CP ) 导入大白菜中, 获得转化植株, 抗病性测定结果显示, 转基因植株具有明显的抗病毒侵染能力。[[28][29]

[28]

5　转基因油菜与杂种优势利用

国内外大量的研究证明, 油菜(包括白菜型、芥菜型、甘蓝型和埃塞俄比亚芥) 品种间杂种F 1存在着明显的种子产量杂种优势[33], 一般可增产20%～30%, 好的组合增产幅度可达50%。现在的油菜杂交组合主要是利用polim a CM S 及陕2A CM S 雄性不育三系杂种, 细胞核雄性不育(GM S ) 和化学杀雄。利用这些方法来选育不育系存在育种周期长, 不育基因单一, 对环境因素敏感, 组合选配局限性大, 费工费时, 育种、应用效果差等问题。近年来, 科学工作者利用基因工程技术, 成功地创造了全新的油菜雄性不育—恢复系[34]。

1990年, 比利时PGS 公司的Mariani

[23, 24, 34]

等利

用烟草花药绒毡层特异表达基因T A 29的启动子与解淀粉酶芽孢杆菌的核酸水解酶基因barnase 构建嵌合基因, 通过遗传转化导入烟草、油菜中, 得到遗传工程雄性不育株。研究表明, 该基因能在油菜的绒毡层或小孢子细胞质内表达, 表达期为小孢子液泡形成期, 使花药在小孢子体解体后提前凋萎。为了恢复barnase 基因导致的不育, M ariani 等又将该基因的抑制蛋白barstar 基因接到T A 29基因上游区, 以抗除草剂草丁膦(P P T ) bar 基因作筛选标志, 经农杆菌转化烟草和野生油菜, 获雄性可育转化植株。

金红等

[35]

用含有抗除草剂溴苯腈与雄性不育嵌

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油1号油菜下胚轴组织, 分化再生获得转基因雄性不育植株和育性恢复植株。对两种转基因植株花器解剖表明, 雄性不育植株的花丝明显比花柱短, 花粉少, 育性恢复植株与正常植株相同。云南省农业科学院生物技术研究所1999年报道, 将携带TA 29-bar nase 雄性

不育基因的农杆菌导入“双低”花培油菜, 获得了大量的转基因植株[26]。

何业华等利用李文彬等提供的含有T A 29-barnase 嵌合基因质粒p BI -T BS -bar 和含有

T A 29-barstar 嵌合基因的质粒p BT A BS BA R 23及根

表1　商品化转基因油菜

商品品系名称M S1, RF 1=>P GS1

启动子P ssuA r a P T a 29P -nos P ssuA r a P T a 29P -nos P ssuA r a P T a 29P ssuA r a P T a 29P ssuA r a P T a 29CaM V 35S

终止子NO S!

外源基因

B ar B amase B ar star N p t ⅡB ar B ar nase B ar star N p t ⅡB ar B ar nase B ar star B ar B ar nase B ar star

NO S

B ar B ar nase B astar P A T (bar )

改变性状

抗草丁膦标记基因雄性不育育性恢复基因标记基因

抗草丁膦标记基因雄性不育育性恢复基因标记基因抗草丁膦雄性不育育性恢复基因抗草丁膦雄性不育

育性恢复基因抗草丁膦雄性不育育性恢复基因抗草丁膦

批准食用时间加拿大, 1995欧盟, 1996日本, 1996加拿大, 1995欧盟, 1997日本, 1997美国, 1996加拿大, 1997日本, 1997日本, 1997

公司P ant G enetic Sy stems

M S1, RF 2=>P GS2

Oct ! NO S!

M S8×RF 3

Oct ! NO S!

PHY 14, P HY 35

NO S

PHY 36

日本, 1997加拿大, 1995日本, 1996欧盟, 1998

HCN 1035S !

HCN 92

CaM V 35S N O S CaM V 35S

35S ! Oct! 35S !

P A T (bar ) N p t ⅡP A T (bar )

抗草丁膦标记基因抗草丁膦

加拿大, 1995日本, 1996欧盟, 1998加拿大, 1997日本, 1997美国, 1998加拿大, 1996加拿大, 1996加拿大, 1995加拿大, 1997加拿大, 1994美国, 1995日本, 1996

澳大利亚, 2000加拿大, 1997加拿大, 1997日本, 1996美国, 1994加拿大, 1996

A g rEv o

T 45(HCN 28)

45A 37, 46A 4045A 12, 46A 16

N S 738, NS 1417, NS 1473GT 200GT 73, R T 73

F M V 35S F M V 35S

ZSR 500/502O XY -23523-18-17, 23-198

P -napin, CaM V 35S N O S

E93’E93’

F ad 2F ad 2A ls CP 4EP SP S GO X v 247

增加十八烯酸含量增加十八烯酸含量抗咪唑啉酮类抗草甘膦

加速草甘膦降解

P io neer Hi-Br ed

S y nthetic 抗草丁膦CP 4EP SP S +CT P 2S y nthetic

GO X v 247+CT P 1E PS PS GO X v 247B x n

(nitr ilase )

加速草甘膦降解抗草甘膦

加速草甘膦降解抗苯腈类(溴丙腈、二碘苯甲腈等) 改变油脂成分(提高月桂酸和豆蔻酸含量)

R hone P oulenc Calgene

T m 13’oct

B ay T E N p t Ⅱ

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[34]

。

6　展　望

自1986年人类首次获得转基因植物以来, 转基因油菜研究及应用已获得显著成效, 并有品种得到大面积应用。未来生物技术将广泛应用于油菜品种培育, 但无论什么时候, 常规育种都不能被取代, 它是育种工作的基础。基因工程技术与传统的育种技术的有机结合, 新的油菜品种将组合更多的优良基因, 其产量潜力、品质状况、种植效益都将大大改善。据统计, 截止2003年, 已有16个商品化的品系。表1为转基因油菜各品系所有外源基因以及各国批准食用的时间

[36]

。但是, 在

转基因油菜商业化进程中仍然存在一些问题, 主要有以下几个方面:

(1) 安全问题。转入油菜的目的基因(如抗虫基因) 对人体是否具有不良影响, 是否会改变与之相关的物种(如昆虫) 的进化速度。

(2) 目的基因是否会转移到其它作物或杂草中去, 是否会带来生物“入侵”问题。

相信不久的将来, 随着基因工程技术的进一步完善, 转基因植物将为世界农业带来一场新的绿色革命。参考文献:

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