不同反应条件对免疫沉淀分离膜蛋白的影响

　　【中图分类号】R684【文献标识码】A【文章编号】1672－3783(2011)08－0306－01 　　【摘要】目的：探讨不同条件对免疫沉淀方法分离纯化膜蛋白时的影响。方法：分别应用磷酸盐缓冲液（PBS）和溶膜缓冲液（含去垢剂）作为反应系统，单克隆抗体PD4与胃癌细胞系MGC803细胞膜溶液进行免疫沉淀反应以获得PD4相关抗原，用Western blot检测膜蛋白的得量。结果：分离纯化PD4相关抗原时，用CNBr-Sepharose 4B-PD4进行免疫沉淀效果优于Protein A Sepharose 4B；溶膜缓冲液作为反应系统效果优于磷酸盐缓冲液。结论：免疫沉淀纯化膜蛋白时，应用抗体直接交联于Sepharose 4B和溶膜缓冲液作为反应系统效果更佳。 　　【关键词】免疫沉淀 去垢剂 蛋白质 　　Effect of different reactive condition on purification of membrane protein with immunoprecipitation 　　【Abstract】aim, To explore the effect of different condition on isolation and purification of membrane protein using immunoprecipitation. Method, monoclonal antibody PD4 immunoprecipitated PD4 associated antigen from detergent lysates of cell membrane of gastric cancer cell line MGC803 in phosphate buffered saline（PBS）or lysis buffer. Quantity of protein was measured with Western blot. Results, during isolation and purification of PD4 antigen, CNBr-Sepharose 4B-PD4 immunoprecipitated better than Protein A Sepharose 4B, lysis buffer was as reactive system better than phosphate buffered saline（PBS）. Conclution, it was better that antibody-conjugeted Sepharose 4B and lysis buffer were as reactive systerm using immunoprecipitation for isolation and purification of PD4 antigen. 　　单克隆抗体PD4是用胃癌细胞系MGC803免疫BALB/c小鼠，经筛选而得到的。前期工作表明，此抗体诱导MGC803细胞凋亡，明显抑制转化细胞Rat3-3在体外的增殖及在软琼脂中的集落形成能力，并能使该转化细胞在裸鼠中的致瘤能力丧失，其相关抗原在ras转化细胞表面呈高表达（1，2，3）。这些结果提示，单克隆抗体PD4相关抗原与肿瘤密切相关。因此，克隆单克隆抗体PD4相关抗原的基因，了解其结构及功能，将有助于我们认识肿瘤的发生、发展及转归规律。 　　 抗体相关抗原的分子克隆，常用两种方法，一是用抗体直接筛选cDNA表达（或DNA）文库，以获得基因片段，二是纯化单克隆抗体相关抗原蛋白多肽，进行测序，根据氨基酸序列，合成兼并引物，通过PCR扩增获得基因片段，然后通过染色体步移或者RACE-PCR得到全长基因（4，5，6，7，8）。免疫学方法是分离纯化蛋白最常用，同时也是最为有效的方法。我们应用不同的反应体系，探讨用免疫沉淀方法分离纯化膜蛋白的优化方案，为得到可测序的膜蛋白，进一步得到全长基因奠定基础。� 　　1 材料与方法� 　　一 细胞膜溶液的制备 　　收取2×108细胞，PBS洗3次，加入PMSF，使其终浓度为100μg/mL，液氮和37℃反复冻融4-5次以破碎细胞，4000rpm离心15分钟，收集上清，于100000g4℃离心1小时，去上清，向沉淀加1-2mL溶膜缓冲液（20mmol/L Tris，0.15mol/L NaCl, 2mmol/L EDTA,1% NP-40, 0.5%脱氧胆酸钠, pH7.5, 终浓度为100μg/mL的PMSF和2μg/mL的Aprotinin用时现加）悬浮细胞膜碎片, 4℃摇动30分钟，4℃10000g离心1小时，上清为细胞膜溶液，分装，-80℃保存备用。� 　　二 ELISA 　　消化收集培养细胞加入96孔培养板，培养24小时至细胞在孔底长为一层，用4℃预冷的0.25%戊二醛固定15分钟，含0.05%Tween-20的PBS洗涤细胞，每孔用200μL1%牛血清白蛋白封闭，4℃过夜。弃封闭液，含0.05%Tween-20的PBS洗涤3次，加1%BSA适当稀释的单克隆抗体PD4，室温放置2小时，弃上清，含0.05%Tween-20的PBS洗涤3次，加1%BSA适当稀释的二抗，室温放置1小时，弃上清，含0.05%Tween-20的PBS洗涤3次，加底物200μL/孔（17mg邻苯二胺，25μLH2O2，50mLPBS），反应10-15分钟，加12.5%H2SO450μL/孔终止反应，置酶标仪，波长492nm读数。� 　　三 PD4与CNBr-Sepharose 4B交联 　　 取适量PD4抗体对0.1mol/L碳酸缓冲液（含0.5mol/LNaCl pH8.9）透析过夜；1gCNBr-Sepharose 4B用1mmol/lHCl浸泡，4℃过夜。用1mmol/lHCl流洗CNBr-Sepharose 4B，再用0.1mol/L碳酸缓冲液流洗，将CNBr-Sepharose 4B刮入PD4（OD280nm=1.326）6ml中，4℃摇动过夜，1000rpm离心10分钟，取上清测OD280nm（0.175），计算交联率（87%），向沉淀中加入11mL1mol/L乙醇胺（含0.5mol/LNaCl pH9.0），室温混合2小时，1000rpm离心10分钟，弃上清，加10mL0.1mol/L醋酸缓冲液（含0.5mol/LNaCl pH4.0）洗涤抽滤，加10mL碳酸缓冲液洗涤抽滤，然后用PBS洗涤，1000rpm离心10分钟，弃上清，加10mL0.1mol/L甘氨酸缓冲液（pH2.8），室温摇动20分钟，1000rpm离心10分钟，弃上清，PBS洗涤致pH为中性，加0.1%NaN3，4℃保存。� 　　四 Western blot 　　 取待测样品进行SDS-PAGE分析（7），电泳完毕，恒压100mV电转1.5小时，将蛋白转移至膜上（电转移缓冲液：10mmol/L Tris, 15mmol/L 甘氨酸, 10% 甲醇）。电转完毕，用0.5%丽春红染色，蒸馏水脱色至蛋白带清晰可见，做好标记，继续脱色至蛋白条带消失，用5%的脱脂奶粉/TBS（TBS缓冲液配制，20mmol/L Tris，0.8% NaCl，pH7.4）室温封闭2-3小时,0.05% Tween-20/TBS洗膜，加用5%的脱脂奶粉/TBS适当稀释的一抗4℃过夜，0.05% Tween-20/TBS洗膜，加用5%的脱脂奶粉/TBS适当稀释的辣根过氧化物酶标记的二抗，室温孵育1-2小时，0.05% Tween-20/TBS洗膜，加0.05% DAB(10mmol/L Tris-HCl，pH7.6配制，含0.1% H2O2)显色，待显色清楚时，用去离子水漂洗以终止反应（8）。�

　　五 免疫沉淀 　　 取5μLProtein A Sepharose 4B，用400μLPBS（或溶膜缓冲液）悬浮，4℃摇动10分钟，12000rpm离心5秒，弃上清，重复3次，加入1.3mg/mL的PD410μL，PBS（或溶膜缓冲液）稀释至100μL，4℃摇动3小时，12000rpm离心5秒，弃上清，200μLPBS（或溶膜缓冲液）悬浮，4℃摇动10分钟，12000rpm离心5秒，弃上清，重复3次。取10μLSepharose 4B-PD4，PBS（或溶膜缓冲液）洗涤3次，加MGC803细胞膜溶液10μL，用PBS（或溶膜缓冲液）稀释至100μL，4℃摇动过夜，12000rpm离心5秒，弃上清，用PBS（或溶膜缓冲液）400μL悬浮沉淀，4℃摇动10分钟，12000rpm离心5秒，弃上清，重复3次，加1XSDS-PAGE加样缓冲液20μL，100℃5分钟，12000rpm离心5分钟，取上清电泳。� 　　六 结果 　　单克隆抗体PD4相关抗原表达于胃癌细胞系MGC803和膀胱癌细胞系EJ单克隆抗体PD4与胃癌细胞系MGC803和膀胱癌细胞系EJ呈阳性反应，说明单克隆抗体PD4相关抗原不但表达于MGC803细胞，同时也表达于EJ细胞（表1）。进一步分离细胞膜，溶解后行Western blot检测，PD4与MGC803和EJ细胞膜溶液呈阳性反应，说明PD4相关抗原相关抗原具有较广泛的肿瘤特异性。并且此反应条带分子量为40kD，即单克隆抗体PD4相关抗原的分子量为40kD（图1）。� 　　1：marks；2：MGC803细胞膜溶液与PD4反应；3：EJ细胞膜溶液与PD4反应；4：MGC803细胞膜溶液与正鼠血清反应；5：EJ细胞膜溶液与正鼠血清反应用Protein A Sepharose 4B对MGC803细胞膜溶液进行免疫沉淀取2等份Protein A Sepharose 4B分别与等量的PD4反应后，再与10μLmgc803细胞膜溶液反应，其中一份用PBS稀释，另一份用溶膜缓冲液稀释，反应完毕，将所得物进行SDS-PAGE电泳（分离胶10%），然后用Western blot检测。用溶膜缓冲液稀释组免疫沉淀反应条带明显多于用PBS稀释组（图2）。 　　用Sepharose 4B-PD4对MGC803细胞膜溶液进行免疫沉淀 　　 取2等份Sepharose 4B-PD4与10μLMGC803细胞膜溶液反应，其中一份用PBS稀释，另一份用溶膜缓冲液稀释，反应完毕，将所得物进行SDS-PAGE电泳（分离胶10%），然后用Western blot检测。用溶膜缓冲液稀释组免疫沉淀反应条带明显多于用PBS稀释组（图2）。 　　� 　　图2 两种不同免疫沉淀方法分离纯化PD4相关抗原� 　　1：MGC803细胞膜溶液与PD4反应；2、4：用细胞膜溶解缓冲液进行免疫沉淀； 　　3、5：用PBS进行免疫沉淀；2、3：用Protein A Sepharose 4B进行免疫沉淀； 　　4、5：用CNSr Sepharose 4B-PD4进行免疫沉淀� 　　讨论 　　 蛋白质的分离纯化，首先要确定目的蛋白存在于何种组织，及亚细胞结构的定位情况，然后建立有效的检测方法。ELISA检测结果表明，单克隆抗体PD4相关抗原存在于胃癌细胞系MGC803和膀胱癌细胞系EJ。分离细胞膜，Western Blot证明该蛋白存在于肿瘤细胞膜，分子量为40kDa（p40）。因此，将MGC803细胞膜溶液作为样品，进行p40蛋白的分离纯化。 　　 免疫沉淀和免疫亲和层析是蛋白分离纯化最常用、也是最有效的方法（4，5）。在进行免疫反应过程中，反应体系的选择，对实验结果有较大影响。用PBS稀释的反应体系所得蛋白量明显低于用溶膜缓冲液作为稀释的反应体系。这与膜蛋白的疏水性相关。在PBS稀释的反应体系中，蛋白的疏水域倾向形成蛋白的核心，或是蛋白分子间疏水域相互作用，形成疏水核心，而外周则是亲水残基占据优势，这样，膜蛋白更易于以多聚体形式存在，这种存在方式影响抗原抗体的反应。膜蛋白在在去垢剂的存在下，具有更好的溶解性，这种溶解状态，有利于抗原抗体反应，因此，在免疫沉淀中能得到更多的蛋白质。 　　 单克隆抗体PD4相关抗原p40的多肽链分子量为40kD，与PD4重链分子量较接近。在用protein A-Sepharose 4B进行免疫沉淀时，欲得到足够进行氨基酸测序用的p40，PD4的用量就要相应加大，其重链含量就大，免疫沉淀后。电转移至PVDF膜上的p40和重链将会有部分重叠，要切下p40进行氨基酸测序，将是困难的。为了解决这个问题，将PD4与CNBr-Sephrose 4B交联（交联率为87%），然后进行免疫沉淀，以便得到了足够进行氨基酸测序的蛋白质。 　　 　　参考文献� 　　［1］ 董志伟,万文徽,李振甫,邱万荣,魏淑敏. 抗胃癌细胞系单克隆抗体PD4的初步研究'. 生物化学杂志,1985,1:52-58� 　　［2］ 肖海，寿成超，董志伟 单克隆抗体PD4诱导人胃癌细胞系MGC-803的凋亡。中华肿瘤杂志，1998，20（1）：31-33� 　　［3］ 殷卫宁，董志伟，邓国仁单克隆抗体PD4对Ha―ras转化细胞Rat3―3抑制效应的研究。中华肿瘤杂志，1991，13（2）：82-86� 　　［4］ Christian S, Ahorn H, Koehler A, Eisenhaber F, Rodi HP, Garin-Chesa P, Park JE, Rettig WJ, Lenter MC. Molecular cloning and characterization of endosialin, a C-type lectin-like cell surface receptor of tumor endothelium. J Biol Chem. 2001 9;276(10):7408-14. � 　　［5］ Isogai Z, Shinomura T, Yamakawa N, Takeuchi J, Tsuji T, Heineg?rd D, Kimata K. 2B1 antigen characteristically expressed on extracellular matrices of human m alignant tumors is a large chondroitin sulfate proteoglycan, PG-M/versican. Cancer Res. 1996 1;56(17):3902-3908.� 　　［6］ Blotta S, Tassone P, Prabhala RH, Tagliaferri P, Cervi D, Amin S, Jakubikova J, Tai YT, Podar K, Mitsiades CS, Zullo A, Franco B, Anderson KC, Munshi NC. Identification of novel antigens with induced immune response in monoclonal gammopathy of undetermined significance.Blood. 2009 8;114(15):3276-84. � 　　［7］ Powell F, Lawson M, Rothwell L, Kaiser P. Development of reagents to study the turkey's immune response: Identification and molecular cloning of turkey CD4, CD8alpha and CD28.Dev Comp Immunol. 2009 33(4):540-546. � 　　［8］ Tsai LC, Peng HJ, Lee CS, Chao PL, Tang RB, Tsai JJ, Shen HD, Hung MW, Han SH. Molecular cloning and characterization of full-length cDNAs encoding a novel high-molecular-weight Dermatophagoides pteronyssinus mite allergen, Der p 11. Allergy. 2005 Jul;60(7):927-937.� 　　 　　作者单位：150000 哈尔滨医科大学