细胞融合实验报告

细胞融合Cell Fusion

xx [1**********]0 同组者：xx 2013年3月14号

【实验目的】

1、了解动物细胞融合的常用方法

Learn common methods of cell fusion

2、学习用PEG进行细胞融合的基本操作过程

Use PEG to induce cell fusion

3、注意动物细胞融合的过程中细胞的行为和变化

Pay attention to the action and change of cells during the process of cell fusion

【实验原理】

细胞融合是指把相同或不同类型的两个或多个细胞融合成一个具有共同细胞质和单一、连续细胞膜的细胞。

Cell fusion is that two or more cells ，of same or different types，be fused by certain technique to produce one cell with a common cytoplasm and a single continuous cell membrane.

目前用于细胞融合的有以下三种常用的方法：

1、Virus 病毒

2、PEG 聚乙二醇

3、Electric shock 电击

通过结合化学和电击的方法，可以使细胞融合率高达70%

Up to 70% cell fusion efficiencies by combining both chemical and electrical fusion protocols.

细胞融合率=已融合的细胞核总数/所有细胞的细胞核总数*100%

Cell fusion efficiency is the ratio of the total number of fused nucleus over that of all the cells in the vision，usually shown as percentage.

除了诱导剂外，其他因素，如细胞类型和性质、温度、PH值、离子强度等也会影响细胞融合率。

In addition to inducers，some other factors，such as cell type and nature，temperature，PH value，ionic strength etc，will also affect the efficiency of cell fusion.

聚乙二醇PEG，又名聚环氧乙烷PEO、聚氧乙烯POE，是一种具有重要商业价值的聚醚。

Poly-ethylene-glycol，also known as poly-ethylene-oxide、polyoxyethylene，is a kind of important polyether of great commercial value.

PEG分子能改变各类细胞的膜结构，使两细胞接触处质膜的脂类分子发生疏散和重组，改变接触处双分子层质膜的相互亲和以及彼此的表面张力作用，从而使细胞发生融合，产生体细胞杂合体。

PEG molecule could change the membrane structure of cells which

makes the lipid molecule disperse and recombine at the point of contract between two cells. With the change of the affinity and the surface tension of the lipid bilayer at the point of contract，cell fusion occurs，producing somatic cell hybrids.

细胞融合技术的应用：application of cell fusion

1、生产单克隆抗体 production of monoclonal antibody

2、基因定位 Gene mapping

3、绘制人类基因图谱 Human’s genetic map

4、原生质体新培养体系 New culture system for protoplast

5、培育抗逆植株 production of adverse-resistant plants

6、生物药品的生产 production of biological drug

7、为发酵工程提供优良菌种 providing strains for fermentation industry

【实验材料】

1、试剂

用Alsver液悬浮培养的鸡血细胞，0.85%的生理盐水，GKN溶液，50%PEG溶液

2、仪器和工具

盖玻片、载玻片、离心管、离心机、滴管、显微镜等

【实验方法】

1、向1ml血细胞悬液中加入4ml 0.85%的生理盐水，清洗细胞，1000~1200r/min离心5min，弃上清。

Add 4 ml 0.85%physiological saline into 1 ml blood cell suspension，wash thoroughly and centrifuge for 5 minutes at 1000~1200r/min，discard supernatant

2、重复第一步1~2次

Repeat step 1 once or twice

3、细胞沉淀中加入GKN溶液至1~2ml，混匀

Add GKN solution into cell pellet of step 2 to 1~2 ml and mix

4、加0.5ml 的混合液到1.5ml的GKN溶液中，充分混匀，红细胞密度应为1.5*107/ml

Add 0.5ml mixed solution into 1.5ml GKN solution，mix them up，and the density of RBC in this suspension should be around 1.5*107/ml

5、取1ml上述红细胞悬液，加入0.5ml50%PEG溶液，室温下静置2~3min，混匀，再进行镜检观察

Add 0.5ml 50%PEG solution into 1ml RBC suspension，incubate at room temperature for 2~3min before observe under microscope

【注意事项】

1、制备的鸡血红细胞浓度不能太高，否则细胞容易聚集，影响融合效果。

The density of RBC should not be too high，or it would be easy to lead to the gathering of cells，which would affect the result of cell fusion.

2、小心仔细，以免出错

Be careful，lest mistakes.

3、溶液的pH值8.0-8.2，可采用缓冲液。温度为38-40℃。适当地提高温度可以使细胞融合得更充分，但温度不能过高，以免细胞膜上的蛋白质变性。

The PH value of solution should be 8.0~8.2，we can use buffer to control it. The temperature should be 38~40℃，increasing the temperature appropriately can contribute to a higher ratio of cell fusion，but a high temperature may lead to protein denaturation.

【实验结果】

图1 未加入PEG时的细胞

图2 加入PEG后的细胞（10*40）

经过PEG的处理，鸡血红细胞中有少部分的细胞发生了融合，但融合大多是刚刚开始，或两个细胞细胞质膜刚刚接触，大部分细胞

仍呈分散状态。其中在视野下还发现少量细胞聚集成团。

【分析】

1、由于PEG的加入，使得鸡血细胞变形较为严重。

2、PEG对细胞融合的作用效果与毒害作用随着分子量的增加而增大，在实验过程中一般取其分子量800-6000。若做细胞融合培养实验则需考虑融合细胞的成活率，故使用分子量不大于1000的PEG溶液；做细胞融合实验，本次试验中采用分子量为4000的PEG。

3、本次试验采用的是鸡血细胞，原因是：鸡血细胞具有细胞核，便于对发生融合的细胞进行鉴别，细胞内只有一个细胞核，则为未融合的细胞，若有多个细胞核，则为发生了融合的细胞；实验材料便宜易得。

4、PEG处理时间，应控制在1~2min，尽管PEG处理的时间越长，细胞融合越多，但对细胞的毒害也越大。

5、实验中两次离心是为了清洗细胞表面，增大细胞接触面积，有利于细胞间的融合。因此，每一步离心前都要将样品小心吹打混匀，反之，视野下有可能出现聚集成团的细胞。

6、在加入PEG时，要缓慢沿着管壁加入，同时避免振动。

7、化学诱导融合，操作简便，诱导融合的概率比较高，且效果比较稳定，适用于动、植物细胞，但对于细胞具有一定的毒性。

【思考题】

细胞融合理论和实际意义

在理论上，细胞融合能把亲缘关系较远，甚至毫无亲缘关系的生物体

细胞融合在一起，为远缘杂交架起了桥梁，是改造细胞遗传物质的有力手段。它的意义在于从此打破了仅仅依赖有性杂交重组基因创造新种的界限，扩大了遗传物质的重组范围。

实际意义：细胞融合不仅可用于基础研究，而且还有重要的应用价值。在植物育种方面已经成功的有萝卜+甘蓝、粉蓝烟草+郎氏烟草等。细胞融合另一个重要应用就是制备单克隆抗体，单克隆抗体可以用作诊断试剂、治疗疾病和运载药物，具有准确、高效、简易、快速等优点。