实验名称 碱性磷酸酶的分离纯化实验报告
实验名称 碱性磷酸酶的分离纯化、比活性测定与动力学分析 实验日期 2011年10月25号 实验地点 生化实验室 合作者 指导老师
总分 教师签名 批改日期
碱性磷酸酶（AKP或ALP）是一种底物特异性较低，在碱性条件下能水解多重磷酸单脂化合物的酶，需要镁和锰离子为激活剂。AKP具有磷酸基团转移活性，能将底物中的磷酸基团转移到另一个含有羟基的接受体上，如磷酸基团的接受体是水，则其作用就是水解。AKP最适ＰＨ范围为８.６－１０，动物中AKP主要存在于小肠粘膜、肾、骨骼、肝脏和胎盘等组织的细胞膜上。血清AKP主要来自肝，小部分来自骨骼。
AKP可从组织中分离纯化，也可以采用基因工程表达的方式获得：将碱性磷酸酶基因克隆到重组载体，转入宿主菌中进行重组表达，并从表达菌提取，并进行酶动力学分析。
一 实验原理
1、碱性磷酸酶的分离纯化
AKP分离纯化的方法与一般蛋白质的分离纯化方法相似，常用中性盐盐析法、电泳法、色谱法、有机溶剂沉淀法等方法分离纯化。有时需要多种方法配合使用，才能得到高纯度的酶蛋白。本实验采用有机溶剂沉淀法从兔肝匀浆液中提取分离AKP。正丁醇能使部分杂蛋白变性，过滤除去杂蛋白即为含有AKP的滤液，AKP能溶于终浓度为33%的丙酮或30%的乙醇中，而不溶于终浓度为50%的丙酮或60%的乙醇中，通过离心即可得到初步纯化的AKP。
2、碱性磷酸酶的比活性测定
根据国际酶学委员会规定，酶的比活性用每毫克蛋白质具有的酶活性来表示，单位（U/mg•pr）来表示。因此，测定样品的比活性必须测定：a每毫升样品中的蛋白质毫克数；b每毫升样品中的酶活性单位数。酶的纯浓度越高酶的比活性也就越高。本实验以磷酸苯二钠为底物，由碱性磷酸酶催化水解，生成游离酚和磷酸盐。酚在碱性条件下与4-氨基安替比作用，经铁氰化钾氧化，生成红色的醌衍生物，颜色深浅和酚的含量成正比。于510nm处比色，即可求出反应过程中产生的酚含量，而碱性磷酸酶的活性单位可定义为：在37摄氏度保温15min每产生1mg的酚为一个酶活性单位。样品蛋白质含量测定用Folin-酚法测定。
3、底物浓度对碱性磷酸酶活性的影响
在环境的温度、ＰＨ和酶的浓度一定时，酶促反应速度与底物浓度之间的关系表现为反应开始时。酶促反应的速度（Ｖ）随底物浓度（Ｓ）的增加而迅速增加。若继续增加底物浓度，反应速度的增加率将减少。当底物浓度增加到某种程度时，反应速度就会达到一个极限值，即最大反引发速度（Vmax）。底物浓度与酶促反应速度的这种关系可用米氏方程式表
示：
式中：Vmax为最大反应速度；[S]为底物浓度；Km为米氏常数；V代表反应的起始速度。 ① 当ν=Vmax/2时，Km=[S]。因此，Km等于酶促反应速度达最大
值一半时的底物
浓度。
② Km是酶的最重要的特征性常数，测定Km值是研究酶动力学的一种重要的方法，大
多数酶的Km值在0.01-100mmol/L。 ③ Km和Vmax的测定：主要采用Lineweaver-Burk双倒数作图法。此式为直线方程，
以不同的底物浓度1/S为横坐标，以1/V为纵坐标，并将各点连成一直线，向纵轴方
向延长，此线与横轴相交的负截距为-1/Km，由此可以正确球的该酶的Km值。方程式与图如下：
本实验以碱性磷酸酶为例，测定不同底物浓度时的酶活性，再根据Lineweaver-Burk法作图计算其Km值。实验以磷酸苯二钠为底物，由碱性磷酸酶催化水解，生成游离酚和磷酸盐。酚在碱性条件下与4-氨基安替比林作用，经铁氰化钾氧化，生成红色的醌衍生物，颜色深浅和酚的含量成正比。根据吸光值得大小可以计算出酶的活性，也可以从标准曲线上差得酚的含量，进而算出酶活性的大小。
二、实验材料
（一）碱性磷酸酶的分解纯化和比活性测定
１、样品 兔肝 ２、试剂
① 0.5mol/L乙酸镁溶液 ② 0.1mol/L乙酸钠溶液
③ 0.01mol/L乙酸镁－0.01mol/L乙酸钠溶液
④ 0.01mol/L Tris－0.01mol/L乙酸镁PH８.８缓冲液 ⑤ 丙酮（分析纯） ⑥ 95%乙醇（分析纯） ⑦ 正丁醇（分析纯） ⑧ 0.04mol/L底物液 ⑨ １mg/ml分标准液 ⑩ 0.5mol/LＮａＯＨ
⑪ 0.3% 4－氨基安替比林 ⑫ 0.5%铁氰化钾
⑬ 0.1mg/mL蛋白标准液 ⑭ 碱性铜试剂
⑮ 酚试剂 ３、仪器与器材
① 研钵
② 刻度离心管 ③ 刻度吸管
④ 电动离心机
⑤ 玻璃漏斗和玻璃棒 ⑥ 托盘天平 ⑦ 恒温水浴 ⑧ 可见分光光度计
（二）底物浓度对碱性磷酸酶活性的影响
１、样品 兔肝匀浆液
２、试剂
① 0.04mol/L底物液
② 0.1 mol/L碳酸盐缓冲液PH10（37℃） ③ 碱性溶液
④ 0.5%铁氰化钾 ⑤ 0.3% 4－氨基安替比林 ⑥ 酚标准液（0.1mg/ml） ３、仪器与器材
① 恒温水浴锅
② 可见光分光光度计
三、实验步骤
（一）AKP的提取
AKP提取实验步骤
(二) AKP的比活性测定
1、AKP的活性测定
AKP活性测定实验步骤
2、蛋白质含量测定
蛋白质含量测定实验步骤
（三）底物浓度对碱性磷酸酶活性的影响
1、底物浓度对酶促反应速度的影响
将新鲜兔肝用PH10.0 0.1mol/L碳酸缓冲液匀浆，按20倍稀释即可
酶曲线绘制步骤
2、酚标准曲线的绘制的绘制
酚标准曲线的绘制的绘制步骤
注意事项
（一）碱性磷酸酶的分解纯化和比活性测定
1、在纯化过程中，各步加入的有机试剂要计算精确。
2、加入有机试剂混匀后应立即离心，不宜放置过久。
3、在测定酶活性时，每加入一种试剂须立即混匀，避免浑浊。
（二）底物浓度对碱性磷酸酶活性的影响 1、血清取量要准确。
2、标准曲线必须是过原点的一条直线。
3、在酶促反应中，每管加入后立即计时，保证各管反应时间一致。