单克隆抗体制备技术的最新进展及应用前景_孔君

·170·免疫学杂志2011年2月第27卷第2期IM M UNOLOGICAL JOURNAL Vol. 27No. 2Feb. 2011

·综述·

[文章编号]1000-8861（2011）02-0170-04

单克隆抗体制备技术的最新进展及应用前景

孔

君，刘

[摘

箐*，韩跃武，王天昌，刘金芝

要]单克隆抗体技术是现代生命科学研究的重要工具，其在基因和蛋白质的结构与功能研究方面有着不可或缺的作

用, 在人类和动植物的免疫学诊断方面至今仍有着无可代替的重要作用。本文综述了单克隆抗体的制备技术，包括嵌合抗体、噬菌体展示技术、核糖体展示技术、基因工程抗体等，及其在临床医学和疾病的诊断与治疗等领域的广阔应用前景。

[关键词]单克隆抗体；制备技术；应用前景[中图分类号]R392.11

[文献标识码]A

The advances and application prospects of monoclonal antibody preparation technology

KONG Jun, LIU Qing ,HAN Yuewu, WANG Tianchang, LIU Jinzhi

The Center Laboratory of Gansu Exit-Entry Inspection and Quarantine Bureau, Lanzhou 730000, China

[Abstract]Monoclonal antibody technique, as an important tool in modern life science research, plays an in －dispensable role in the study of gene structure and protein function, as well as in the immunological diagnosis of humans, animals and plants. This review gives an overview on the preparation of monoclonal antibody, such as chimeric antibody, phage display, ribosome display, genetically engineered antibody, etc. and its broad application prospects in clinical medicine, diagnosis and therapy of diseases.

[Keywords]Monoclonal antibody; Preparation technique; Application prospects

1975年德国科学家Kohler 和英国科学家Mil －stein 利用杂交瘤技术将产生抗体的B 淋巴细胞同骨髓瘤细胞融合，成功的建立了单克隆抗体制备技术[1]，由于单克隆抗体在生命科学领域的巨大贡献，此技术获得1984年的诺贝尔医学和生理学奖；1994年Winter 等创建了以噬菌体抗体库技术为代表的基因工程抗体，是单克隆抗体技术的又一重要进步，该技术是按人工设计所重新组装的新型抗体分子，使不经免疫既可获得任何一种动物（包括人）的特异性抗体成为可能，目前基因工程抗体在疾病的预防、诊断、及治疗方面已获得广泛应用。

单克隆抗体技术的基本原理为：小鼠受到外界抗原刺激后可诱发免疫反应，产生相应的抗体，这一职能是由B 淋巴细胞来承担的；肿瘤细胞在体外培

“永久”的细胞。把小鼠养的条件下可以无限传代，是

基金项目：甘肃省科技厅中小企业创新基金计划(0802NCCA028)；国

的骨髓瘤细胞与经免疫过的小鼠的脾细胞在聚乙二醇等介导下发生融合，融合后的杂交瘤细胞具有两

种亲本细胞的特性，一方面可以分泌特定的抗体, 另一方面也具备了肿瘤细胞无限增殖的能力, 可在体外培养条件下或移植到体内无限增殖, 从而分泌大量单克隆抗体。

单克隆抗体技术研制成功后在临床应用方面进展缓慢，主要原因是单克隆抗体大多是鼠源性的，而鼠源单抗用于人体治疗时存在诸多问题：鼠源单抗在人体中常不能有效激活补体和Fc 受体相关的效应系统；被人类免疫系统所识别，产生人抗鼠抗体

[2]

(humananti-mouse antibody, HAMA ）反应；且在人体循环系统中很快被清除。因此，在保留对特异抗原表位的高亲和力的基础上实现人源化和全人化的改造，减少异源抗体的免疫源性成为单抗研究的重点。此外，传统杂交瘤技术还存在制备周期长，成本较高，杂交瘤细胞不稳定和抗性易丢失等缺陷。近年来，随着分子生物学的发展，出现了嵌合单克隆抗体和由转基因小鼠、噬菌体展示技术、核糖体展示技术所制备的单克隆抗体。这些技术可有效解决传统杂交瘤技术所存在的问题，为单克隆抗体的发展提供

家质监总局项目(2007IK259，2009IK276)

作者单位：730000兰州，甘肃省出入境检验检疫局中心实验室（孔君，刘箐）；730000，兰州大学基础医学院医学生物化学与分子生物

730000，兰州慧盟生物科技有限公司（王天昌）；学研究所（韩跃武）；

730070兰州，甘肃农业大学生命科学技术学院（刘金芝）*通信作者：刘箐，E-mail:[email protected]

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更广阔的空间。噬菌体表达技术制备抗体有以下优点：其一是可以获得具有人体性质的单克隆抗体, 其二是分离抗体的速度极快, 最快在1周内即可完成抗体的分离工作。相比之下采用常规免疫接种法制备的鼠源单克隆抗体其分离时间需6至8个月，这种抗体生产效率使得噬菌体抗体库技术成为一种有效的功能基因筛选工具，广泛运用于药物的筛选[9]。

1.3核糖体展示技术核糖体展示技术是一种完全在体外合成蛋白质分子并进行选择与进化的新技术。1994年，Mattheakis 等[10]建立了一种体外核糖体展示随机肽系统, 利用“多肽-核糖体-mRNA ”复合物将多肽库构建在多核糖体上, 借助多核糖体在体外将基因型和表型联系起来。1997年Plukthun 实验室Hanes 等[11]对Mattheakis 等的多聚核糖体展示技术进行改进建立了核糖体展示技术。

该技术基本原理是通过PCR 扩增目的基因的DNA 文库，同时加入启动子、核糖体结合位点及茎环，并置于具有耦联转录／翻译的无细胞翻译系统中孵育，使目的基因的翻译产物呈现在核糖体表面，并

“mRNA-蛋白质-核糖体”三元复合体，最后通形成

过常规的免疫学检测方法，通过固相化的靶分子直接从三元复合体中筛选出感兴趣的核糖体复合体，再利用RT-PCR 扩增，经过多次循环过程，最终筛选出高亲和力的目标分子[12]。

由于核糖体展示技术是纯粹的体外系统，核糖体展示技术可以克服其他展示技术所不能解决的问题，也就同时具有了其优势。首先，核糖体展示技术

分子具有库容量大的优点，库容量可达到1012~1015，

文库的筛选结果与库容量具有正相关的关系，所以能更容易筛选到目标分子。其次，核糖体展示技术不需要考虑细胞毒性，在体内表达系统中，考虑到大肠杆菌宿主菌的生长，具有毒性的蛋白分子无法通过此方法表达，这个缺点在体外展示系统中可以被克

由于核糖体展示技术是完全体外系统，因此避免服。

了体内体外操作的转换，只通过PCR 就可进行所有复制与扩增，几个小时就能够建立核糖体展示文库，因此还具有建库周期短，筛选简便等优势[13]。

1.4RNA-多肽融合技术RNA-多肽融合技术也被称为mRNA 展示技术或是体外病毒技术。1997年Roberts 和Szostak [14]与Nemoto [15]分别独立设计了这种与核糖体展示类似的方法。这个展示系统是利用嘌呤霉素分子将mRNA 分子和其所编码的多肽共价结合起来，嘌呤霉素与单链DNA 连接物的3' 端连结，然后这个DNA 连接物再与文库编码的mRNA 的3' 端连结。当mRNA 在体外翻译时，核糖体到达

1单克隆抗体制备技术的最新进展

1.1嵌合抗体嵌合抗体产生于1980年代中期，是

将非人源抗体可变区移植到人抗体恒定区, 应用DNA 重组技术将小鼠抗体基因上的可变区与人抗体基因的恒定区重组, 再将重组后的基因导入骨髓瘤细胞中表达。根据所用的载体质粒标记基因产物, 选用适当的抗生素或试剂进行筛选, 再用与传统杂交瘤技术相似的方法克隆出分泌人鼠嵌合抗体的细胞株。但这种抗体仍保留了原来鼠源抗体约30%左右的鼠源性，可诱发人抗小鼠反应（HAMA ）。为了进一步提高嵌合抗体的人源化，在嵌合抗体的制备过程中又引进了重构抗体技术和表面重塑技术[3-4]以提高抗体的人源化。重构抗体是与异源抗体和抗原的结合相关的；而表面重塑抗体技术是对鼠抗体表面氨基酸残基进行人源化改造，在维持抗体活性并兼顾减少异源性基础上选用与人抗体表面残基

所替换的片段不应过多，对相似的氨基酸进行替换。

于影响侧链大小、电荷、疏水性，或可能形成氢键从而

影响到抗体互补决定区构像的残基要尽量保留[5]。

到目前为止，嵌合单克隆抗体基本主宰着治疗性单抗的商品市场，嵌合抗体的制备技术也不断发展，抗体人源化程度也不断提高，但是即使是在仅移植不到整个嵌合抗体5%的鼠抗体互补决定区(com－plementarity determining reign, CDRs) [6]的情况下，鼠源成分依然存在，并未完全解决鼠抗体的免疫原性问题, 而且人源化过程较复杂，造价也比较高。

1.2噬菌体抗体库技术噬菌体抗体库技术和核糖体展示技术是抗体库筛选技术的主要手段，而噬菌体抗体库技术是迄今发展最成熟、应用最广泛的抗体库技术。20世纪80年代Smith [7]发现了可以分离基因的噬菌体展示技术。噬菌体展示技术建立在噬菌体外壳具有表达抗体蛋白片段能力的基础上。这项技术的基本原理是用基因工程技术克隆人抗体可变区的全套基因，然后将克隆的基因插入噬菌体编码衣壳蛋白的基因中，建立噬菌体抗体文库，从而使该异源分子呈现于噬菌体表面。

抗体的制备方法是将抗原包被在固项介质上，加入待筛选的噬菌体颗粒与固定的抗原结合，获取结合的抗体，将未结合的抗体洗脱，从噬菌体库中筛选出针对特定抗原的特异性抗体的可变区。用表达有相应抗体分子的噬菌体颗粒去感染宿主菌，使该噬菌体颗粒得到扩增，将抗体可变区与恒定区组合得到具有完整功能的全人单克隆抗体[8]。

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mRNA 和DNA 的结合点并稳定下来，嘌呤霉素进入核糖体的氨酰化位点，并在氨酰转移酶的作用下与所编码的多肽偶联。mRNA-DNA-嘌呤霉素分子文库可在体外翻译，然后用固相化的靶分子将纯化的RNA-多肽复合物淘选出来，像核糖体展示系统那样，这个复合体可通过RT-RCR 得到进一步的扩增[16-17]。1.5转基因小鼠制备全人抗体转基因小鼠的Ig 基因是用人的相应基因替代，产生对人免疫系统非异种抗体，这种影响人抗体的策略是改造小鼠的体液免疫系统，将人Ig 基因微位点转入小鼠，产生能分泌人Ig 的转基因小鼠。这样可省去对抗体分子重构时在基因水平的复杂性，保留了完整的Ig 类别转换和亲和力成熟的自然机理。这种转基因小鼠的不足之

因此这种抗体处在于基因片段较小，仅30kb 左右，

在面对抗原多样性时，其抗体应答显得单薄而不足[18]。

此后，Green 等[19]人利用基因打靶技术将编码人抗体轻重链的基因片段大约18Mb 的DNA 全部转到自身抗体基因位点已被灭活的小鼠基因组中，再经过繁育筛选，建立了稳定的转基因小鼠品系。这样得到的转基因小鼠对特异的抗原能产生高亲和力的人源抗体。再用传统的杂交瘤技术，将表达特异抗体的转基因小鼠B 细胞和骨髓瘤细胞融合，获得杂交瘤细胞系，产生人源抗体。

2.2.1用于肿瘤治疗的单克隆抗体①纯抗体治疗：

肿瘤的生物免疫治疗已向针对某中肿瘤的特异性

McAb 转变。随着一些关键技术的突破，进入临床实验的McAb 已达70多种，有些已取得了很好的疗效[21]。如曲妥珠单抗为一种针对HER-2/neu的重组人源化IgG 单克隆抗体，大量临床资料证实曲妥珠单抗用于乳腺癌的有效率为21%，而且它与化疗的联合应用，能显著延长HER ／2阳性复发乳癌患者的生存时间[22]。②“生物导弹”治疗：以McAb 为导向的导弹可直射癌细胞靶，选择性杀伤癌细胞而对正常组织细胞损伤极小。根据“导弹”的不同分为免疫化学疗法、免疫毒素疗法和免疫放射疗法。McAb 载体有肿瘤特异性抗原抗体、肿瘤相关抗原抗体以及癌基因

CA125单克隆抗体耦联放射性核素，在肿瘤抗体等。

局部产生足够的电离辐射生物学效应，治疗卵巢癌的实验与临床研究已取得较大进展，给卵巢癌特别是术后复发及化疗耐药患者的治疗带来新的希望[23]。利妥昔单抗和化疗药物CHOP （环磷酰胺+多柔比星+长春新碱+泼尼松）联合使用方案能有效提高淋巴瘤治愈率[24]。

2.2.2单克隆抗体在其他疾病中的应用单克隆抗体药物不只在肿瘤的治疗中取得了很好疗效, 在其他疾病的治疗中也取得了显著效果，例如：抗CD25McAb 治疗骨髓移植术排斥反应表现出良好的疗效[25]。重组抗肿瘤坏死因子-α人鼠嵌合单克隆抗体治疗

），能迅速改善RA 患者的活动性类风湿关节炎（RA

病情，并有可能阻止或修复其影像学进展，尤其对于中度RA 患者疗效更显著[26]。

2.3单克隆抗体在蛋白提纯中的应用单克隆抗体能与其相应的抗原特异性结合，因而能够从复杂系统中识别出单个成分。只要得到针对某一成分的单克隆抗体，利用它作为配体，固定在层析柱上，通过亲合层析即可从复杂的混和物中分离、纯化这一特定成分。如用抗人绒毛膜促性腺激素（HCG ）亲合层析柱，就可从孕妇尿液中提取到纯化的HCG ，与其他提取方法包括沉淀法、高效疏水色谱法等相比，具有更加简便、快速、经济、产品活性高等优点。

2.4单克隆抗体在临床诊断及检测中的应用业已证实，单抗在传染病、免疫性疾病、内分泌性疾病的诊断和早孕诊断方面，大大优于现有的抗血清，具有

灵敏度高和易标准化等优点。例如，美国特异性强、

Centorco 公司与麻省总医院联合制备的抗乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)单抗，比当前最佳抗血清敏感100倍，能从抗血清确认的阴性人群中检查出60%的漏诊带病毒者[20]。再如，人脱嘌呤脱嘧啶核酸内切

2单克隆抗体的应用

单克隆抗体的应用涉及医学、农业、食品、环境

等众多领域，其在基础研究、蛋白纯化、环境与食品监测、疾病诊断、预防及治疗和优生优育等方面均有不可替代的作用。

2.1单克隆抗体在预防方面应用生物免疫预防包括主动免疫和被动免疫，被动免疫指的是被感染后输入抗体，中和或清除病原体预防疾病的发生。如为了切断母婴传播途径，防止婴幼儿感染乙型肝炎病毒，可给围产期母亲或婴幼儿注入抗乙型肝炎病毒的单抗；主动免疫是指将病原体经过加工处理减毒或除去致病性，使其丧失致病性但保持其抗原性，接种后能引起机体的免疫反应，产生抗体，但不会引起机体的病变，例如，为了预防结核病而接种的卡介苗在体内生长繁殖，接近于自然感染，可激发机体对病原的持久免疫力。不论是主动免疫还是被动免疫均可以使用单抗[20]。

2.2单抗在临床治疗方面的应用目前用单克隆抗体对疾病进行治疗已取得了重大的突破, 可治疗的疾病包括肿瘤、免疫系统疾病及心血管疾病和变态反应等。

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酶(hAPE1)是一种肿瘤相关抗原，其（hAPE1）单克隆抗体制备可能能作为某些肿瘤早期诊断敏感而特异的指标，并为开展多种免疫学实验及研究提供必要的物质基础[27]。

单抗技术已深入到医学和生物学的各个领域，成为一种必不可少的工具，具有极为重要的理论研究价值和实用价值。目前，单抗技术已基本完善，大量的单抗已广泛应用到各个领域。单抗领域目前的研究重点是制备、应用新的单抗，扩大已有单抗的应用范围，特别是在临床治疗性单抗和导向药物方面尚有较大潜力。

[11]

[12]

3展望

在过去的30年里，从鼠源性单抗到全人源性抗

[13][14]

单抗具有体，单抗在制备技术上取得了较大的进展。

高度均一、生物活性单一和与抗原结合的特异性强等优点。但是，鼠源性单抗的免疫源性导致机体产生一系列的急性反应，使药物的功效降低，因此单抗的人源化是单抗药物的发展趋向。目前，如何提高抗体的生产效率，同时保持其优良特性，且能同时解决免疫原性这一问题，是该领域的热点和难点，相信不久

可以根的将来，随着重组DNA 技术的进一步发展，据不同需要实现人-人、人-动物、人-植物和动物-动物等多种抗体重新组合，借助于杂交瘤细胞产生

重组型抗体、单链抗体、单区抗体、全套抗嵌合抗体、

体以及抗体酶，将单克隆抗体的生产效率、质量以及

应用提升到一个更高的水平。

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（收稿日期：2010-04-09；修回日期：2010-09-26）

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（编辑金晓琳）