胶体金免疫层析技术定量检测人绒毛膜促性腺激素

第41卷第3期

2012年6月上海师范大学学报（自然科学版）JournalofShanghaiNormalUniversity（NaturalSciences）Vol．41，No．3Jun．，2012

胶体金免疫层析技术定量检测人绒毛膜促性腺激素

杨秀梅，邢国杰，徐宽，沈鹤柏，朱龙章

（上海师范大学生命与环境科学学院，上海200234）*

摘要：采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金，用胶体金标记和双抗体夹心免疫层析方法，建立

对人绒毛膜促性腺激素的快速定量检测方法．该检测方法可以在15min内完成对HCG的定

量检测，灵敏度可达25mIU/mL，线性范围25～10000mIU/mL．与人促黄体生成素（hLH）、人

促甲状腺激素（hTSH）、人卵泡刺激素均无交叉反应，所建立的检测人绒毛膜促性腺激素的胶

体金免疫层析方法，能快速、灵敏、特异、准确地检测样品中的人绒毛膜促性腺激素，在异位妊

娠的早期诊断及过程监控中具有较为广阔的应用前景．

关键词：HCG；胶体金；免疫层析；定量检测

5137（2012）03-0274-06中图分类号：O648文献标识码：A文章编号：1000-

0前言

HCG）是由胎盘合体滋养细胞分泌的一种糖蛋人绒毛膜促性腺激素（humanchorionicgonadotropin，

［1］［2］白激素．HCG的产生与滋养细胞的生长状况和数量有直接关系，正常发育的绒毛所分泌的HCG量很大，每天的滴度不断地快速上升，每48h上升66%以上．如果HCG每2d增加的量＞66%，可以诊断

［3］为宫内妊娠；而如果增加的量＜66%，则异位妊娠或宫内孕发育不良的可能性很大．HCG是妊娠时所

分泌的特异性激素，可用于协助异位妊娠早期未破裂的诊断．目前较为明确的诊断方法为B超，但是在怀孕5周内B超难以发现胚芽的影像，所以寻找早期诊断异位妊娠的方法显得尤为重要．因此，本文作者试图探讨血清人绒毛膜促性腺激素检测在异位妊娠早期诊断的价值．

胶体金免疫层析方法对人绒毛膜促性腺激素的定量检测的研究目前只达到半定量的水平，而本研究则实现了对人绒毛膜促性腺激素的定量检测．这弥补了胶体金免疫层析方法中无法定量的缺陷，这在医学领域将会带来一个新的突破，极具现实意义与医用价值．

目前现有的胶体金免疫层析试条只能定性判断是否怀孕，而先兆流产、异位妊娠、药物引流、某些妇产科

［4－5］．孕卵在子宫腔以外的疾病、术后治疗过程等都需要对HCG指标变化进行跟踪及对HCG进行定量检测

［6］任何部位着床发育，均称异位妊娠．异位妊娠是妇产科常见急腹症之一，当输卵管妊娠流产或破裂时可引起

［7］腹腔内严重出血，如不能及时就诊、处理可危及生命．HCG动态定量检测可作为异位妊娠随访监控指标，对

［8］早期异位妊娠的诊断具有重要意义．本研究在常规早孕试纸定性检测的基础上，对原有胶体金免疫层析技

术进行改进，实现了HCG的定量检测，对异位妊娠的早期诊断及过程监控具有重要的影响．

1

1．1材料主要材料

HCG单克隆抗体、羊抗鼠二抗（上海捷宁生物科技有限公司）；硝酸纤维素膜、吸水纸、玻璃纤维购

12-21收稿日期：2011-

作者简介：杨秀梅（1985－），女，上海师范大学生命与环境科学学院硕士研究生；朱龙章（1956－），男，上海师范大学生命与环境科学学院教授．

*通信作者

第3期杨秀梅，邢国杰，徐宽，等：胶体金免疫层析技术定量检测人绒毛膜促性腺激素275于美国Millipore公司；柠檬酸三钠（上海青析化工有限公司）；氯金酸（国药集团化学试剂有限公司）．

1．2主要仪器

HM3010单维往复划膜仪；AllegraTM64R台式高速冷冻离心机（美国贝克曼库尔特有限公司）；金标分析仪（中国科学院上海光学精密机械研究所）．

2

2．1试纸条的制备方法胶体金的制备

［9］用柠檬酸三钠还原法制备20nm胶体金．向洗净的锥形瓶中加入98mL的超纯水，再加入1%的

维持加热状态并加入1%柠檬酸三钠2mL．继续氯金酸2mL．将锥形瓶放在恒温搅拌器上加热至沸腾，

观察颜色变化，冷却至室温后置于4℃冰箱待用．煮沸10min，

2．2结合垫的制备

取1mL的胶体金用0．1mol/L的K2CO3溶液调节pH值到8．0～9．0，加入36μgα－HCG抗体，混匀涡旋并静置10min，加入50μLBSA（10%）溶液反应10min后，用离心机在13000r/min下离心15min，弃去上

4℃保存．清液，沉淀物用硼酸盐缓冲溶液重悬至原体积后，再次离心弃去上清液，浓缩至原体积的1/10，

选用玻璃纤维作为结合垫材料，将上述制备的胶体金α－HCG抗体复合物重新分散于0．01mol/L

1%BSA）中，37℃烘干2h．PBS（pH=7．4，含5%蔗糖，并喷于结合垫上，

2．3样品垫的制备

选用玻璃纤维素膜作为样品垫材料，将其放入样品垫处理液（0．01mol/LPBS（pH=7．4），含有1%BSA，0．1%TritonX－100）中浸泡后，37℃烘干2h备用．

2．4硝酸纤维素膜（NC膜）的制备

用划膜仪在NC膜的不同位置喷点α－HCG单抗及羊抗鼠IgG抗体，自下至上依次为质控线（C

37℃烘干2h备用．线）、检测线（T线），

2．5试纸条的组装

NC膜、将吸水纸、结合垫、样品垫依次贴在带有粘合剂的PVC底板上，并切成4mm宽的试纸条装壳．

3实验结果

3．1胶体金的表征

3．1．1胶体金的紫外扫描

对2．1．1所制备的20nm的胶体金进行紫外扫描，测定结果见图1，从图1上可看出所制备的20nm

10］的胶体金的最大吸收峰位于520nm处，这与文献［报道的一致，符合实验的要求

．

图120nm胶体金的紫外—可见扫描曲线

276上海师范大学学报（自然科学版）2012年

3．1．2用Zeta电位分析仪对所制得的胶体金进行Zeta电位、粒径测定

对所制备的20nm胶体金进行Zeta电位、粒径的测定．测定结果见图2和图3．可以看出，所制备的胶体金的平均Zeta电位是－25．0mV（图2），胶体金颗粒的平均粒径大约为20．01nm（图3）

．

图2胶体金的粒径分布曲线图3胶体金的Zeta电位扫描曲线

3．1．3用透射电子显微镜（TEM）对胶体金进行扫描

对所制备的20nm的胶体金用透射电子显微镜（TEM）对胶体金进行扫描，扫描结果见下图4，从图4中可以看出胶体金颗粒粒径在20nm左右，而且粒径分布比较均一，形貌接近于球形，符合实验的要求

．

图420nm胶体金的透射电镜图

3．2胶体金免疫层析试纸条的构造图

NC膜、将吸水纸、结合垫、样品垫依次贴在带有粘合剂的PVC底板上，并切成4cm宽的试纸条，胶

体金免疫层析试纸条的构造见图

5．

图5胶体金免疫层析试纸条构造图

3．3

3．3．1检测结果的判读定性检测

将待测样品滴加到检测卡的加样孔中，静置15min，观察结果．质控线和检测线均出现红色为阳性，仅质控线出现红色为阴性，质控线不显色为无效．

3．3．2定量检测判定

［11］将显色后的试纸条放入金标分析仪中进行扫描，读取T/C比值，大于判定值为阳性．

第3期杨秀梅，邢国杰，徐宽，等：胶体金免疫层析技术定量检测人绒毛膜促性腺激素277

3．3．3定量检测重复性

检测6个浓度的HCG样品，每个浓度检测10次，并用金标分析仪扫描读取信号T/C值．每个浓度样品10次检测的T/C值的标准差与平均值的比值即为变异系数．

直观检测灵敏度评价

25、100、500、1000、3000、5000、8000、10000mIU/mL．如图1将HCG样品用样品处理液稀释成10、

1000、3000、5000、8000、10000mIU/mL为强阳性反应；25、100mIU/mL为弱阳性反应；所示500、3．4

10mIU/mL无阳性反应；即肉眼可观察到的最低浓度是25mIU/mL（图6）

．

1阴性对照；2～10HCG样品的浓度：10、25、100、500、1000、3000、5000、8000、10000mIU/mL

图6胶体金试免疫层析纸条检测HCG结果

3．5定量检测结果

3．5．1HCG标准曲线测定

每个浓度检测3次，取3次T/C比值的平均值．在最优实用金标分析仪检测不同浓度的HCG样品，

验条件下，依据检测体系中待测物浓度与金标分析仪读值T/C比值在一定条件下呈线性关系的原理，以HCG样品的浓度为横坐标，金标分析仪读值T/C比值为纵坐标作图，建立胶体金检测标准曲线．当HCG样品浓度为25～10000mIU/mL时，HCG的浓度与其金标分析仪读值T/C比值之间呈良好的线性

2关系（图7），线性回归方程为y=0．0014x+0．6901，相关系数R=0．9977，线性良好

．

图7胶体金免疫层析试纸条检测HCG标准品系统拟合工作曲线

3．5．2试纸条检测卡重复性结果

通过实验发现，同一批次的该试纸的重复性良好，可达到98%；不同批次的试纸条的重复性也可达到97%，假阳性率和假阴性率均为0．

3．5．3试纸条检测卡稳定性结果

经实验验证表明，该试纸条检测卡在4℃和20℃条件下，可保存6个月，在37℃条件下可保存3个星期，检测结果均没有发生变化．

3．6试纸条的特异性

配制人促黄体生成素（hLH）、人促甲状腺激素（hTSH）、人卵泡刺激素（hFSH）的抗原溶液，以处理液作为空白对照，用HCG免疫层析试纸检测．结果显示，金标分析仪对其他常见的干扰物均未检出，说明此试纸无交叉反应现象（图8）．

278上海师范大学学报（自然科学版）2012

年

1．空白；2．hLH；3．hTSH；4．hFSH；5．HCG

图8检测结果

3．7试纸的精密性

50000、80000mIU/mL）按检测方法平行测定10次，取3种浓度的HCG标准品（1000、所得结果计

临床检测结果

用试纸条检测HCG临床血清样本20份．每个浓度检测3次，取其平均值作标准曲线．定量检测结8．75%、9．62%．算变异系数（CV值），分别为9．79%、3．8

R2=0．9689，果如图9所示，得到的相关性曲线方程为y=0．0009x+1．6188，线性良好

．

图920例HCG血清样本检测结果

4结论

（1）定量检测HCG的金标免疫层析方法的建立．本研究建立了一种快速的定量检测HCG的金标免疫层析方法，此方法具有法操作简单，快速，灵敏度高等特点，克服了传统方法的很多缺点，本方法最具创新的地方就是弥补了纸层析的方法中无法定量的缺陷，利用免疫层析方法定量检测HCG的动态变化从而达到检测和用于术后复查的目的，这在医学领域将会带来一个新的突破，极具现实意义与医用价值．

（2）HCG定量检测试纸条的灵敏度和线性范围．研制出的HCG定量检测试纸条的检测灵敏度为25mIU/mL，线性范围：25～10000mIU/mL；与人促黄体生成素（hLH）、人促甲状腺激（hTSH）、人卵泡刺激素（hFSH）没有交叉反应，特异性较好；精密度符合临床应用要求，具有实际应用价值．

（3）HCG定量检测试纸条的优势．本研究建立了HCG的标准工作曲线，在线性范围内可以对HCG样品进行定量检测，经检测发现HCG的浓度与T/C比值具有良好的线性关系．相比ELISA进行定量检测时存在检测时间较长的缺点，本方法可以在15min内完成一定范围内的定量检测，时间缩短3～4h，同时在准确性、重复性、稳定性等方面均比ELISA方法更具优势．

第3期杨秀梅，邢国杰，徐宽，等：胶体金免疫层析技术定量检测人绒毛膜促性腺激素279参考文献：

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Quantitativedetectionofhumanchorionic

gonadotrophinusingcolloidgoldimmunochromatographicassay

YANGXiu-mei，XINGGuo-jie，XUKuan，SHENHe-bai，ZHULong-zhang*

（CollegeofLifeandEnvironmentSciences，ShanghaiNormalUniversity，Shanghai200234，China）

Abstract：Colloidalgoldwaspreparedthroughreducingreactionofgoldionsbysodiumcitrate．Therapiddetectionmethodwasestablishedwithdouble-antibodysandwichassay．Arapidandquantitativedetectionmethodforhumanchorionicgonadotrophinu-singcolloidgoldimmunochromatographicassaywasdeveloped，whichcouldaccomplishqualitativedetectionin15min．Thesensi-tivitywasupto25mIU/mL．HCGsamplewithconcentrationof25mIU/mLto10000mIU/mLwasmeasured．Therewerenocross-reactionswithotherhormones，suchashLH，hTSH，Hfsh．Thecolloidalgoldimmunochromatographicassayisrapid，specif-ic，sensitive，accurateandsuitableforHCG，showinggoodpotentialintheearlydiagnosisofectopicpregnancyandprocessmoni-toring．

Keywords：HCG；colloidgold；immunochromatographicassay；quantitativedetection

（责任编辑：郁慧）