花生种子不同部位脂肪氧化酶同工酶的鉴定研究
安徽农业科学,Journal of Anhui Agri. Sci. 2008,36(33) :14448-14449 责任编辑 刘月娟 责任校对 傅真治
花生种子不同部位脂肪氧化酶同工酶的鉴定研究
侯美玲1, 苗华荣2, 陈静2, 王绍斌13
(1. 沈阳农业大学, 辽宁沈阳110161;2. 山东省花生研究所, 山东青岛266100)
摘要 [目的]为了筛选脂肪氧化酶缺失的花生品种。[方法]根据花生种子脂肪氧化酶同工酶等电点差异, 利用等电聚焦电泳技术, 对6份花生种子不同部位的脂肪氧化酶进行鉴定分析。[结果]完整的花生种子脂肪氧化酶同工酶有3条带, 子叶脂肪氧化酶同工酶有2条带, 种胚的脂肪氧化酶同工酶有7条带; 花生种胚脂肪氧化酶同工酶的IEF 2PAG E 图谱有差异, 除品种P86呈现6条带以外, 其他品种均呈现7条酶带,P86缺失1条带; 相同品种花生种子不同部位的脂肪氧化酶的电泳图谱不同。[结论]脂肪氧化酶主要集中在花生的种胚部分。关键词 花生; 种子; 脂肪氧化酶; 等电聚焦电泳中图分类号 S565. 2 文献标识码 A 文章编号 0517-6611(2008) 33-14448-02Identification of Lipoxygenase Isozym es in P eanut Seeds from Different P arts H OU M ei 2ling et al (Shenyang Agricultural University ,Shenyang ,Liaoning 110161) Abstract [Objective]T he research aim ed to filter the peanut breed of lacking lipoxygenase. [Meth od]A m eth od based on differences of peanut lipoxyge 2nase pI was developed to identify 6kinds of peanut lipoxygenase from different parts by IEF 2PAG E. T he is oenzym es of lipoxygenase from different varieties of peanuts were identified w ith the m eth od. [Result ]T here were 3bands of lipoxygenase in the wh ole peanut seeds ,2bands in the cotyled ons ,and 7bands in the embry os. T here were 7bands of lipoxygeanse in all the varieties ,except that there were 6bands in P86. T he is oenzym es of lipoxygenase from different parts of the sam e variety were different. [C onclusion]T he is oenzym es of peanut lipoxygenase m ainly concentrated in the embry os. K ey w ords Peanut ;Seed ;Lipoxygenase ;IEF 2PAG E
脂肪氧化酶是一种非血红素铁蛋白, 专一催化亚油酸、亚麻酸、花生四烯酸等具有顺, 顺21,42戊二烯结构的多元不饱和脂肪酸的加氧反应, 生成具有共轭双键的脂肪酸氢过氧化物。脂肪氧化酶对于植物的生长、发育、-5]。, 而它可以直接启动脂质过氧化[6], 有异味的挥发性化合物[7]。脂肪氧化酶广泛存在于高等植物体内。不同部位的脂肪氧化酶的生理功能明显不同[8-9]; 同一部位的脂肪氧化酶同工酶的生理功能也有差异[10-12]。脂肪氧化酶的缺失可以在一定程度上阻止脂质氧化, 减缓种子储藏中劣变速度, 提高种子储藏的稳定性[13]。花生是我国重要的油料作物和经济作物。目前, 关于花生的种子脂肪氧化酶的研究较少。笔者根据花生种子脂肪氧化酶同工酶等电点差异, 利用等电聚焦电泳技术, 建立了花生种子脂肪氧化酶的IEF 鉴定方法[14]。在以往研究的基础上[15], 着重分析相同品种花生种子不同部位脂肪氧化酶同工酶的条带差异, 为深入研究花生种子脂肪氧化酶的生理功能奠定基础。
1 材料与方法
1. 1 材料 供试6份花生品种(表1) 由山东省花生研究所
后冷冻离心20m in 12000×g , 1. 2. 聚丙烯酰胺凝胶
(1+) , 3. 2%Amph oline
) 067%AP和浓度0. 1%TEME D 组
, 预先在玻璃板上涂布浓度
0. 12%Bind 2S ilane 涂料2m l , 为不使凝胶粘贴在上层板上, 预
先在玻璃板上均匀涂布浓度10%Repe2S ilane 涂料2m l 。在下层玻璃板两边各放1根隔条, 然后把另一块玻璃板放在上面, 用夹子夹住2块玻璃板, 凝胶溶液倒在上下玻璃板之间的空隙中, 室温放置, 待胶凝固后放入4℃冰箱备用。
1. 2. 3 IEF 电泳。样品直接加在薄层胶片上的加样纸上, 加
样量约10μl , 通冷却水电泳。电泳程序:①60V ,15m in ; ②7
m A 稳流, 电压上升到600～700V ; ③600V 稳压,30m in 后, 关
掉电源, 打开安全罩, 用镊子取出加样纸; ④600V 稳压电泳
2. 5h , 结束电泳。
表1 供试品种
T ab le 1 The tested cu ltivars
编号C ode
1
2345品种Cultivars
06B16A. SP P86
白突9号
类型T y pe 珍珠豆型野生种中间型珍珠豆型普通型提供。亚油酸(纯度为99%) 、邻联茴香胺均由S igma 生产; 两性电解质(pH 值3～10, 纯度40%) 、亲和硅烷均由Pharmacia 生产; 丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺、过硫酸铵、TE ME D 均由
Amresco 生产, 超纯级; 剥离硅烷由北京鼎国生产。1. 2 方法
1. 2. 1 样品制备。吸取0. 8m l 0. 1m ol/L pH 值为7. 3～7. 5
郯城睡果子
1. 2. 4 染色。①将结束电泳后的凝胶板在磷酸缓冲液(0. 1m ol/L ,pH 值7. 4) 中浸泡5m in 。②称取15mg 邻联茴香胺溶
于7m l 无水乙醇中, 得酶染液A 液。吸取150μl 亚油酸溶于
0. 6m l 无水乙醇中, 再加0. 9m l T ween20, 得酶染液B 液。A
的T ris 2C aC l 2提取液, 放入400mg 磨细的花生粉中, 冰浴研磨后转入E ppend orf 管中, 振荡均匀, 置于4℃下, 提取0. 5h , 之
基金项目 山东省农业科学院青年科研基金项目(2005Y Q005) ; 山东
省良种工程(2007LZ 004202) 。
作者简介 侯美玲(1982-) , 女, 辽宁丹东人, 硕士研究生, 研究方向:
花生育种。3通讯作者。
收稿日期 2008209216
与B 溶液混合后, 再用0. 1m ol/L 磷酸盐缓冲液(pH 值7. 4) 定容至150m l 。将凝胶板转移至酶染液中,26～28℃下酶染过夜。③将凝胶板用磷酸缓冲液和脱色液各洗1次, 每次5
m in 。④称取0. 19g 考马斯亮蓝R250, 加入150m l 脱色液(甲
醇∶冰醋酸∶水=3∶1∶6) , 边搅拌边水浴加热至50～60℃, 使其充分溶解, 过滤使用。凝胶板再进行考马斯亮蓝蛋白质染
36卷33期 侯美玲等 花生种子不同部位脂肪氧化酶同工酶的鉴定研究14449
色15m in 。⑤用脱色液洗脱凝胶板数次, 使酶带清晰显色。
2 结果与分析
而子叶中相对较少。根据不同品种花生种胚脂肪氧化酶酶带数量的差异, 可以将供试品种分为2类:一类呈现7条酶带, 如06B16胚、A. SP 胚、白突9号胚、郯城睡果子胚、花育22号胚; 另一类呈现6条酶带, 缺失酶带1, 如P86。6个花生品种的区别在于酶带1的有无。酶带1具体的生理功能尚需利用其他方法深入研究, 其他各条酶带的缺失品种仍需继续筛选。从电泳图谱可以看出, 种胚是脂肪氧化酶同工酶含量比较集中的部分, 以它作为样品对酶带缺失情况反映更为明显, 因而今后要加大从种胚中筛选脂肪氧化酶缺失材料的力度。参考文献
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在该试验条件下,6份花生品种不同部位经IEF 分离后的种子脂肪氧化酶图谱见图1。通过酶活性染色和考马斯亮蓝染色, 不同品种的花生种子脂肪氧化酶的电泳图谱是有差异的, 且所有酶带差异明显。6份花生种子子叶脂肪氧化酶的同工酶有2、3两条带; 完整种子脂肪氧化酶的同工酶有2、
3、4三条带; 种胚脂肪氧化酶的同工酶有1、2、3、4、5、6、7七条
酶带, 其中2、3、4、5、6、7六条酶带清晰可见, 酶带1显色略浅,P86的胚缺失酶带1, 呈现2、3、4、5、6、7
六条酶带。
注:1.06B16全;2. 06B16全;3. A. SP 全;4. P86全;5. 白突9号全;
6. 郯城睡果子全;7. 花育22号全;8. 06B16胚;9. A. SP 胚;10. P86胚;11. 白突9号胚;12. 郯城睡果子胚;13. ; 14.06B16子叶;15. A. 子叶9叶;18. N ote :1,T he wh ,T he of ;3,T he wh ole of A.
SP ;4,T he wh ole ,T he wh ole of Baitu 9;6,T he wh ole of T anchengshuigu ozi ;7,T he wh ole of Huayu 22;8, T he embry o of 06B16;9,T he embry o of A. SP ;10,T he embry o of P86;11,T he embry o of Baitu 9;12,T he embry o of T anchengshuigu ozi ;13,T he embry o of Huayu 22;14,T he cotyled on of 06B16;15,T he cotyle 2d on of A. SP ;16,T he cotyled on of P86;17,T he cotyled on of Baitu 9;18, T he cotyled on of T anchengshuigu ozi ;19, T he cotyled on of Huayu 22.
图1 IEF 2PAG E 图谱(阳极在上, 阴极在下)
Fig. 1 IEF 2PAG E p attern(anode in the upper and cathode in the
low er)
3 结论与讨论
种胚的脂肪氧化酶与种子的耐储藏性密切相关。利用等电聚焦电泳技术鉴定分析花生种子脂肪氧化酶的同工酶时发现, 相同品种花生种子不同部位的脂肪氧化酶同工酶的酶量和种类均有不同, 胚中脂肪氧化酶的酶量和种类最多,
(上接第14444页) 此外, 建议对不育系的鉴定提早至转育的第4年(也即
B 6F 1代) 进行, 以利于杂交组合的同步试种、示范, 及早育成
系与粳糯稻杂交并多次回交后仍出现不育材料太过偏迟于回交父本的现象, 故目前还难以应用成功。晚粳材料在早春
4～5月播种, 通过连续的短日照处理, 可使播种材料于7月
新的稳定杂交组合应用于生产。参考文献
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初抽穗并正常结实, 但秋季播种时, 出苗率极低, 且迟于安全齐穗期, 只有很少量材料能顺利收获去海南南繁加代, 实际尚未起到真正的加代作用, 可能在具体的操作技术上还有待改进。选择粳稻杂种F 1后代出现的田间不育株与粳糯亲本杂交, 杂交后代择糯并以粳糯作父本回交, 数代回交后也可获得稳定的糯稻不育材料。