快速测定植物叶片叶绿素含量方法的探讨

第19卷,第4期2002年7月

光　谱　实　验　室

ChineseJournalofSpectroscopyLaboratory

Vol.19,No.4July,2002

快速测定植物叶片叶绿素含量方法的探讨

杨敏文①

()

,结果表明,用不同提2乙醇提取法速度快,叶绿素得率高、稳定性好,精密度高,。

关,测定,方法,叶片。

中图分类号:O657.32　　　文献标识码:A　　　文章编号:100428138(2002)0420478204

1　前言

植物叶片叶绿素含量与光合速率、营养状况等密切相关,实践上通常测定叶绿素含量以表征植物生长状况,也往往把叶色变化作为看苗诊断和肥水管理的重要指标。叶绿素含量测定方法主要有分光光度法和活体叶绿素仪法两大类[1],最近又发展了光声光谱法[2]。其中,应用最为广泛的是分光光度法。用得较多的是由Mackinney[3]提出经Arnon[4]解释和推导的Arnon法以及80年代初提出的乙醇提取法[5],本试验提出另一种提取溶剂——丙酮2乙醇混合法提取叶绿素,以常规的Arnon法(提取溶剂为80%丙酮)和乙醇提取法作对比,就3种提取液对测定植物叶片叶绿素含量的影响进行了研究比较,并提出了一种快速测定叶绿素含量的方法。

2　实验部分

2.1　仪器与试剂

UV2401PC型紫外可见分光光度计(日本岛津,狭缝宽度012nm,吸光池厚1cm),FSH2 高速电动匀浆器(金坛望华科教仪器厂),FA1004A型电子天平(上海精天电子仪器厂)。

将珊瑚树嫩叶用双蒸水洗净,吸水纸吸干表面水分,作为试验材料。叶绿素提取溶剂为:95%丙酮2乙醇(用体积比为2∶1的丙酮2无水乙醇混合液配成95%的水溶液,下同)、95%乙醇和80%丙酮,均为分析纯。2.2　实验方法

叶绿素的提取:将材料去脉剪碎(约1—2mm

见方),随机取样,准确称重取015g(精确到011mg),放入50mL比色管中,分别加入上述三种提取液25mL;另称015g样品,加6mL双蒸水和少量CaCO3,匀浆,定容至25mL,过滤,取2125mL滤液放入50mL比色管中,加23175mL丙酮2乙

①联系人,电话:(0576)5157136

作者简介:杨敏文(1965—),女,浙江省台州市人,高级讲师,华东师范大学2001年在职教育硕士,从事化学教学与研究。收稿日期:2002201201

第4期杨敏文:

快速测定植物叶片叶绿素含量方法的探讨479

醇(2∶1),使之成为95%丙酮2乙醇匀桨提取液。比色管加塞放置于25℃生化培养箱内暗中提取叶绿素。每种提取方法重复3次。

叶绿素提取液吸收光谱的测定:用分光光度计在600—700nm范围内对不同叶绿素提取液进行扫描,波长精度为012nm。

叶绿素含量测定:分别以提取溶剂作空白,测定叶绿素提取液吸光度A645、A663,利用Arnon公式:

叶绿素a浓度(mg L):Ca=12.7A663-2.69A645;叶绿素b浓度(mg L):Cb=22.9A645-4.68A663;叶绿素总浓度(mg L):Ca+b=Ca+Cb。

计算提取液中叶绿素浓度,(3　结果与讨论

3.14600—700nm(图1),说明4种叶绿

素提取液的光吸收性质基本相似,可以用Arnon公式进行叶绿素含量的计算。3.2　不同提取溶剂对叶绿素提取总量的影响

不同提取溶剂对叶绿素提取总量有着明显的影响(表1),95%丙酮2乙醇提取的叶绿素总量最高,高于传统的80%丙酮提取法2915%,95%乙醇提取的叶绿素总量亦比80%丙酮法

高915%。95%丙酮2乙醇提取叶片匀浆的叶绿素总量与提取叶片碎片的叶绿素总量没有显著差异。

3.3　不同提取溶剂提取叶绿素的进程

图1　珊瑚树叶片叶绿素在不同提取液中的吸收光谱

1——95%丙酮2乙醇;2——95%乙醇;3——80%丙酮;4——95%丙酮2乙醇(匀浆)。

不同提取溶剂提取叶绿素速度差异较大,提取完全程度也不同(表1)。提取速度最快的是95%丙酮2乙醇,叶绿素经过8h已经基本提取完全,叶片碎片变白;其次是95%乙醇,而80%丙酮提取速度最慢,后两者在24h内没有完全提取出叶绿素。从提取速度来看,95%丙酮2乙醇要优于95%乙醇和80%丙酮。叶片匀浆后用95%丙酮2乙醇在015h就已经提取完全,大大加快了叶绿素提取速度。

表1　不同提取溶剂提取叶绿素的进程和叶绿素总量①

提取溶剂

95%丙酮2乙醇95%乙醇80%丙酮

95%丙酮2乙醇(匀浆)

1.251.26叶绿素含量(mg g鲜重)

0.5h

1h

2h0.81

(65.9)0.61(58.7)0.53(55.8)1.234h1.03(83.7)0.79(76.0)0.68(71.6)1.268h1.21(98.4)0.90(86.5)0.77(81.1)1.2416h1.23(100.0)0.96(92.3)0.86(90.5)1.2524h1.22(99.2)1.01(97.1)0.91(95.8)1.24叶绿素总量

1.23(100)1.04(100)0.95(100)1.26　　①括号内的数据为叶绿素相对含量。

480光谱实验室第19卷

3.4　不同提取液中叶绿素的稳定性

用不同提取溶剂提取珊瑚树叶片叶绿素,在25℃生化培养箱中暗中放置0、3、6天后测定提取液中叶绿素含量,结果见表2。叶绿素提取液放置6天后,叶绿素a下降了518%—1119%,叶绿素b下降了217%—714%,叶绿素总量下降了419%—1015%。这些都说明,在这些提取液中,叶绿素b比叶绿素a稳定。叶绿素提取液中叶绿素a、叶绿素b的含量、稳定性与提取材料、提取液性质和提取液含水量有关[6,7]。为了提高叶绿素提取液的稳定性,。但若所用的材料是干粉,提取液中最好含有适量的水分,,利于叶绿素从类囊体膜中游离出来。鲜叶叶绿素,效果较好[8,9]。本试验结果表明,:95%丙酮2乙醇>95%乙醇>80%丙酮。

①

(mg g鲜重)

80%丙酮0.68

(100)0.27(100)0.95(100)0.63(92.6)0.26(96.3)0.89(93.7)0.60(88.2)0.25(92.6)0.85(89.5)

aba+b

95%丙酮2乙醇

0.86(100)0.37(100)1.23(100)0.83(96.5)0.37(100.0)1.20(97.6)0.81(94.2)0.36(97.3)1.17(95.1)

95%乙醇0.74(100)0.30(100)1.04(100)0.69(93.2)0.29(96.7)0.98(94.2)0.67(90.5)0.28(93.3)0.95(91.3)

3aba+b

6aba+b

　　　①括号内的数据为叶绿素相对含量。

3.5　精密度实验

95%丙酮2乙醇提取效果好,提取速度快,具有较高的精密度(表3)。

提取溶剂

95%丙酮2乙醇95%乙醇80%丙酮

表3　不同提取方法的精密度①

叶绿素测定值(mg g鲜重)

1.23±0.021.04±0.030.95±0.031.26±0.02

RSD(%)1.62.93.21.6

4　结论

分光光度法测定植物叶片叶绿素含

　　①5次重复。

量,由于所用提取溶剂不同,测定结果差

异显著。一种好的提取溶剂应该提取速度快,叶绿素得率高,稳定性好,测定结果精密度高,吸收光谱与传统丙酮法一致,能用Arnon公式计算叶绿素含量。本试验结果表明,95%丙酮2乙醇法具有上述特点,是一种较好的叶绿素提取溶剂,而传统的80%丙酮法和95%乙醇法提取叶绿素速度慢,提取不完全,应慎用。叶片经匀浆后再用丙酮2乙醇提取,叶绿素得率与叶片浸泡法相似,但大大提高了提取速度,这对于快速测定大量样品叶绿素含量具有实际意义。

95%丙酮

2乙醇(匀浆)

第4期杨敏文:

快速测定植物叶片叶绿素含量方法的探讨481

参考文献

[1]苏正淑.几种测定植物叶绿素含量的方法比较[J].植物生理学通讯,1989,25(5):77—78.

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[7]沈伟其.测定水稻叶片叶绿素含量的混合液提取法[J].植物生理学通讯,1988,24(3):62—64.[8]林植芳,李双顺,张东林等.采后荔枝果皮色素、总酚及有关酶活性的变化[J].植物学报,1988,30(1).[9]陈玉萍,刘后利.甘蓝型油菜种子发育过程中种皮色素含量动态[J].中国油料,16()StudyonRapidDeterminationteaves

Y(MedicalSTVInstitute,Taizhou,Zhejiang318000,P.R.China)

Abstract

Effectextractingsolventsonthedeterminationofchlorophyllcontentsofleaveswasstudiedbyspectrophotometricmethod.Theresultsshowthatchlorophyllabsorptionspectrumsare

.Mixedacetoneandethanolasextractingsolventofchlorophyllsimilarindifferentextractingsolvents

hasthepeculiarityofaquickextractspeed,highextractefficiency,goodstabilityanddeterminationaccuracy.Andamethodofrapiddeterminationofchlorophyllcontentisproposed.

Keywords　ChlorophyllContent,Determination,Method,Leaf.

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