兽药慢性毒性和致癌试验指导原则
兽药慢性毒性和致癌试验指导原则
一、概述
（一）定义与目的
慢性毒性和致癌试验是预测药物在临床应用中诱发癌症危险性的评价方法。在动物的大部分生命期间，经过反复给予受试药物后观察其呈现的慢性毒性作用及其剂量－反应关系，尤其是进行性和不可逆毒性作用及肿瘤疾患。确定受试药物的无作用剂量(NOEL)，作为最终评定受试药物能否应用于动物尤其是食品动物的依据。
为了确保慢性毒性和致癌试验结果的真实性、可靠性和可追溯性，根据新兽药研究的规律，结合国内兽药毒理学评价的实际情况制定了本指导原则。
（二）适用范围
本指导原则适用于评价兽用化学药品、中兽药、消毒剂及饲料药物添加剂对动物的慢性毒性和/或致癌性的测定。
长期毒性试验发现有可疑肿瘤发生，某些器官组织细胞异常、药物结果与已知致癌物有关或代谢物与已知致癌物有关、作用机制为细胞毒类等情况下，要求进行致癌试验。
二、试验设计
（一）材料与方法
1. 实验动物
（1）实验动物种类选择
一般要求选用两个种属的实验动物，即啮齿类和非啮齿类，目前已掌握大白鼠和小白鼠各品系的特点及诱发肿瘤的敏感性，故可优先将其用于慢性毒性和致癌试验。对活性不明的受试药物，则应选用两种性别的啮齿类和非啮齿类动物。
（2）动物的起始周龄和体重
慢性毒性试验期长，故一般用刚断乳的大鼠或小鼠。大鼠50～70g （出生3～4周），小鼠10～15g （出生3周）。动物个体体重的变动范围不超出各性别平均体重的20%。
（3）动物的性别和数量
每个剂量组的动物数应满足试验结束时进行统计学处理的要求，如大鼠40～60只（小鼠数应据此适当增加），一般雌雄各半，雌鼠应为非经产鼠、非孕鼠。如果将慢性毒性试验与致癌试验结合进行，每组雌雄动物数均应在50只以上。如计划在试验过程中定期剖杀动物，则动物数应相应增加。
（4）肿瘤自发率
实验动物的自然肿瘤发生率原则是控制到越低越好，但试验结果评价时主要是以在相同条件下观察对照组与各剂量组的肿瘤发生率及其剂量-反应关系作为判定依据。
2. 受试药物
应与其他做非临床和临床试验的兽药为同批次产品。
3. 仪器设备
一般生理生化和剖检仪器。
（二）试验步骤
1. 剂量组设计
设3～5剂量组和一个对照组。高剂量组根据90天喂养试验确定，一般应引起一些毒性表现或损害作用，但不引起太多动物死亡；低剂量组不引起任何毒性作用；在高剂量和低剂量之间再设1～3剂量组，剂量可按几何级数或其他规律划分。对照组除了不给予受试药物外，其他各方面都应与试验组相同。如果受试药物使用了某种毒性不明的介质，则应同时设未处理对照和介质对照。
2. 给药方法
经口给药，可加入饲料、饮水中或灌胃。如果受试药物是灌胃给药，应每周称体重两次，根据体重计算给予受试药物的量。
3. 受试药物的配制及存放
（1）一般用蒸馏水作溶剂，如受试药物不溶于水，可用食用植物油、医用淀粉、羧甲基纤维素等配成乳浊液或悬浊液。受试药物应于灌胃前新鲜配制，除非有资料表明以溶液（或乳浊液、悬浊液）保存具有稳定性。同时应考虑使用的
介质可能对受试药物的吸收、分布、代谢或储存的影响；对理化性质的影响及由此引起的毒性特征的影响；对摄食量或饮水量或动物营养状况的影响。
（2）受试药物加入饲料中的量不能大于饲料量的5%；受试药物制备或存放时，要求不影响饲料的营养成分含量和性质。饲料中加入受试药物的量很少时，宜先将受试药物加入少量饲料中充分混匀后，再加入一定量饲料后混匀，如此反复3-4次。
4. 饲料
（1）饲料中营养成分应能满足实验动物的营养需要。
（2）饲料的污染物如残余杀虫剂、多环芳烃化合物、雌激素、重金属、亚硝胺类化合物等的含量要控制；不饱和脂肪酸与硒的含量要限制，均应使其不影响受试药物的试验结果。
5. 实验动物饲养管理
（1）同一间动物房中不得放置两种实验动物，也不能同时进行两种受试药物的毒性试验；
（2）动物料槽中的饲料每周至少要更换两次。
（3）试验期间，动物最好采用单笼饲养，且要求各组动物饲养条件（笼具、温度、光照、饲料等）严格一致。
6. 试验期限
一般情况下，慢性试验期限不能少于6个月，致癌试验小鼠定为18个月，大鼠定为24个月。
7. 观察指标
（1）一般观察，包括：
①对实验动物的一般健康状况每天至少进行一次观察和记录。对死亡动物要及时剖检；对有病或濒死的动物需分开放置或处死，并检测各项指标。
②动物出现异常，需详细记录肉眼所见、病变性质、时间、部位、大小、外形和发展等情况，对濒死动物要详细描述。
③试验期的前13周，每周要对全部动物分别称量体重，以后每4周一次，每周要检查和记录一次每只动物的采食量。如以后健康状况或体重无异常改变，可以每3个月检查一次。
（2）血液学检查
试验的第3、第6个月及以后每半年一次采试验鼠血进行血液学检测。血液学检指标包括血红蛋白，血细胞压积，红细胞计数，白细胞计数及嗜中性、嗜酸性、嗜碱性、淋巴、单核细胞的分类计数，血小板数和网织红细胞数，血凝试验等。大、小鼠每组每一性别不少于5只，且每次检查尽可能安排为同一动物。
（3）血液生化检测
试验的第3、第6个月及以后每半年一次采试验鼠血进行血液生化指标检测。血液生化检测指标包括谷丙转氨酶（ALT 或SGPT ）、谷草转氨酶（AST 或SGOT ）、尿素氮（BUN ）、肌酐（Cr ）、血糖（Glu ）、血清白蛋白（Alb ）、总蛋白（TP ）、总胆固醇（TCH ）和甘油三酯（TG ）等。此外还可考虑测定碱性磷酸酶（ALP ）、乳酸脱氢酶（LDH ）、胆酸等。大、小鼠每组每一性别不少于5只，且每次检查尽可能安排为同一动物。
（4）病理检查
①大体剖检
所有试验动物，包括试验过程中死亡或濒死处理的动物以及试验结束处死的动物都应进行解剖和全面系统的肉眼观察。观察到的可疑病变和肿瘤部位均应固定保存，以备进一步做组织学检查。在试验过程中各组应剖检部分动物进行病理组织学检查，一般情况是每3-6个月检查一次。
②脏器称量
剖检试验动物的同时，称取体重及重要脏器重，计算脏体比值。脏器包括肝、肾、肾上腺、肺、脾、睾丸、附睾、卵巢、子宫、脑、心等，必要时还应选择其他脏器。
③组织病理学检查
凡是试验过程中死亡或濒死处理的动物都应进行组织病理学检查。试验期间和试验结束处死的动物先对高剂量组和对照组进行组织病理学检查，发现病变后再对较低剂量组相应器官及组织进行检查。应进行组织病理学检查的器官和组织如下表： 剖检系统
消化系统 器官组织 直肠、胰腺、肝
神经系统
腺体
呼吸系统
心血管系统及造血
系统
泌尿及生殖系统
其他
④电镜检查 脑、脑垂体、周围神经、脊髓、眼 肾上腺、甲状腺（包括甲状旁腺）、胸腺 气管、肺、咽、喉、鼻 主动脉、心、骨髓、淋巴结、脾 肾、膀胱、前列腺、睾丸、附睾、精囊、子宫、卵巢、雌鼠乳腺 大体检查中观察到有损害的组织、肿块、皮肤
有条件和需要时可酌情进行。
8. 试验记录
认真填写“慢性毒性和致癌试验”原始记录。内容包括受试药物名称、试验依据、试验日期、试验人员签名等；实验动物来源、种属和品系、年龄、体重范围、数量、性别、购置日期、健康状态等；动物分组、受试药物给予记录等；试验观察（包括动物的一般表现、行为、中毒表现和死亡情况等）记录；血液学指标测定结果；血液生化指标测定结果；组织病理学检查（包括大体解剖、脏器重量、病理组织学检查等）结果等。
（三）数据处理分析
1. 数据处理
（1）整理归纳各试验组动物的临床数据。
（2）整理试验动物的饮水量, 求取各试验组动物饮水量的平均值(表述为⎯x±s）。
（3）整理试验动物的饲料摄入量和增重, 求取各试验组动物的平均增重率(表述为⎯x±s）。
（4）整理测得的血液学指标，求取各指标的组内平均值(表述为⎯x±s）。
（5）整理测得的血液生化指标，求取各指标的组内平均值(表述为⎯x±s）。
（6）整理测得的动物体重及其主要脏器重量，计算脏/体比值(脏器系数), 求取各试验组动物脏器系数的平均值(表述为⎯x±s）。
（7）归纳各试验组动物剖检和组织病理学检查结果。
2. 数据分析
以适当的统计学方法分析上述整理的数据，比较试验组与对照组之间的差异性。计量资料采用方差分析或t 检验，计数资料采用X 2检验、泊松分布等。
（四）结果评价
根据试验结果确定该兽药的最大无作用剂量（NOEL ），并经有关专家评审后制定ADI 。
（五）注意事项
1. 除特别注明外，试验用水为蒸馏水，试剂为分析纯试剂，动物为SPF 实验动物。
2. 实验动物饲养环境要求达到SPF 级。
三、试验报告
为公正、科学地评价药物的特殊毒性，对试验报告内容做如下要求：
1. 试验目的。
2. 试验时间与地点。
3. 试验设计者、负责人、参加者及电子邮箱。
4. 受试药物需注明兽药名称、生产厂家、规格、生产批号及用法与用量。
5. 试验动物的品种与品系、体重、日龄或月龄、健康状况、检疫情况等。
6. 归纳总结该药物的试验结果，评价受试药物在临床应用中诱发癌症危险性, 确定受试药物的无作用剂量(NOEL)。
7. 参考文献。
8. 试验数据，应有详细的试验原始记录。原始资料保存处、联系人、电话。
9. 试验单位（加盖公章）。