学年论文---胚胎干细胞全能性及冷冻剂对其影响

胚胎干细胞全能性及冷冻剂对其影响

摘要

胚胎干细胞（embryonic stem cell ，ESCs ，简称ES 或EK 细胞）是早期胚胎（原肠

胚期之前）或原始性腺中分离出来的一类细胞，它具有体外培养无限增殖、自我更新和多向分化的特性。无论在体外还是体内环境，ES 细胞都能被诱导分化为机体几乎所有的细胞类型。在生产克隆动物、生产转基因生物、器官移植等方面有着极好的应用前景。本文主要介绍了哺乳类动物胚胎干细胞的一些生物学特性和它的全能性，以及全能性的检测技术，并着重分析了冷冻剂对小鼠胚胎干细胞全能性的影响。

关键词：胚胎干细胞 诱导分化 全能性 冷冻剂

Totipotency of Embryonic Stem Cells And

T otipotent’s Effect on It

Abstract

Embryonic stem cells (embryonic stem cell, ESCs, ES or EK cells) is separated from the early embryo or the primitive gonad cells. It has the characteristics of unlimited proliferation, self-renewal and multilineage differentiation. Both in vitro and in vivo environment, ES cells can be induced to differentiate into almost all cell types of the body. It has a great application future in the production of cloned animal, transgenic organisms and organ transplantation. This paper mainly introduces

some biological characteristics of mammalian animal embryonic stem cells and its totipotency, and totipotent detection technology.

Emphatically introduced the influence of refrigerant stem cells in

mouse embryos.

Key words: Embryonic stem cells differentiation totipotency refrigerant

目录

1. 胚胎干细胞的生物学特性 .......................................................................... 1

1.1胚胎干细胞的定义及形态鉴定 . ........................................................... 1

1.2胚胎干细胞的遗传稳定性 . ................................................................... 1

1.3胚胎干细胞的全能性 . ........................................................................... 1

1.4胚胎干细胞的体外分化 . ....................................................................... 2

2. 细胞全能性检测的方法 ................................................................................ 2

2.1 胚胎嵌合技术 . ...................................................................................... 2

2.1.1嵌合体制作技术 ........................................................................... 2

2.1.2用于检测ES 细胞在嵌合体表达的方法 .................................... 3

2.2原核注射技术 . ....................................................................................... 3

2.3 ES细胞的诱导分化检测技 .................................................................. 3

2.4胚胎干细胞核移植技术 . ....................................................................... 4

2.5 免疫学方法鉴定 . .................................................................................. 4

3. 冷冻剂对小鼠胚胎干细胞全能性的影响 .................................................. 4

3.1冷冻剂的温度 . ....................................................................................... 4

3.2冷冻剂的类型 . ....................................................................................... 4

3.3 冷冻保护液的改良 . .............................................................................. 5

4. 胚胎干细胞研究的意义和前景 .................................................................... 5

4.1 胚胎干细胞研究的意义 . ...................................................................... 5

4.2 胚胎干细胞研究的前景 . ...................................................................... 6

4.2.1 研究人胚胎发育及疾病的发生 .................................................. 6

4.2.2 用于移植和基因治疗 .................................................................. 6

4.2.3 用于药物筛选和药物开发以及作为外源基因 . ......................... 6

前言

胚胎干细胞(Embryonic stem cell,ES)是从早期胚胎的内细胞团或原始生殖细胞分离出来的具有发育全能性的一种未分化的细胞, 它具有与胚胎细胞相似的形态特征及分化潜能。它一方面保留了所有的发育潜力，在适合的条件下能够分化成多种类型的细胞、组织，将ES 细胞移植到动物囊胚后，它可以参与宿主细胞多种组织的构成，形成嵌合体并产生遗传，另一方面，人们可以对ES 细胞的基因组进行各种遗传操作。因此ES 细胞己成为一种研究哺乳动物细胞分化、早期胚胎的发生、基因表达和调控、组织形成过程的基本体系，又是临床移植治疗的新的细胞来源，具有极好的研究价值和应用前景。

1. 胚胎干细胞的生物学特性

1.1胚胎干细胞的定义及形态鉴定

在显微镜下观察，存活5-7天的胚胎由大约140个细胞所组成，看上去就像黏稠的浆果或花粉粒。它们通体毛绒绒，相互依偎着呈空心的圆球状，这被称为胚泡。其外层组织即滋养层，由一层扁平的细胞组成，会发展成胎盘。胚泡中心的腔称“囊胚腔”，腔内一侧的细胞群即“内细胞团(Inner cell mass,ICM)”，胚胎干细胞便是由此分离培养建系的。这时的内层细胞尚未决定今后生长发育的走向，但它们均具有“全能性”，亦即可演变为200多种构成从心脏、肝脏、肾到皮肤、神经元等人体中任何一种器官组织的组成细胞。内层细胞团在形成人的内、中、外三个胚层时开始分化，每个胚层将分别分化形成人体的各种组织器官。由于内细胞群可以发育成完整的个体，因而这些细胞被认为具有发育全能性。当内细胞群在培养皿培养并传代用于研究时，我们称之为胚胎干细胞(Embryonic stem cell,ES ) [1]。

1.2胚胎干细胞的遗传稳定性

ES 细胞在分化的过程中，可以将完整地体现原有的生理特点和结构组成, 即基因能够得到完全的表达，具有稳定的遗传性能。因此，在骨髓移植、肌肉和皮肤等的修复等医学方面具有广阔的前景。也可在体外对ES 细胞进行遗传操作选择，如诱导外源基因，标志基因等制作嵌合体，通常不会改变选择后的ES 细胞本身的遗传性能，所以在理论上经遗传操作后的ES 细胞仍能保持其扩增、发育的全能性的稳定遗传。这就可以根据这种性能制备转基因动物个体或基因缺失、突变或过量表达的杂合或纯合个体，以便分析各种基因功能和因的表达调控机制等。

1.3胚胎干细胞的全能性

全能性(Totipotency ) 是指ES 细胞在解除分化抑制的条件下能参与包括生殖腺在内的各种组织的发育潜力, 能发育成完整的动物个体[2]。ES 细胞全能性或多能性的基础是其具有的高度的分化潜能。细胞分化终究归结为在胚胎发育过程中基因组中的特定基因按一定顺

序相继活化和表达。所以, 细胞全能性的实质是细胞基因组中决定蛋白质编码的所有基因按一定顺序表达。细胞全能性或多能性与细胞分化状态的相对稳定性密切相关。细胞分化具有相对的稳定性, 但在一定条件下, 细胞分化又是可逆的。低等生物细胞和高等动物的早期胚胎细胞具有全能性, 但用成年绵羊的乳腺细胞和胎儿成纤维细胞为供体进行核移植生出了绵羊羔, 这表明:不但未分化的胚胎细胞具有全能性, 已分化的体细胞在特定条件下经过脱分化也具有全能性。已分化的细胞具有的全能性的前提条件是这种细胞在体外诱导进入休眠状态。细胞全能性是细胞核基因在不断变化的胞质环境的作用下有次序、有系统地表达的结果, 在分化的细胞内存在有可逆性修饰的遗传物质[3]。但并非所有的体细胞均具有全能性, 例如红细胞, 在成熟时失去细胞核, 丧失了可逆性分化的遗传物质。

1.4胚胎干细胞的体外分化

在特定的体外培养条件下，ES 细胞也能分化形成各种细胞系，如造血细胞、肌肉细胞和神经胶质细胞等。ES 细胞体外分化途径和机制与在体胚胎细胞不完全相同，但在分子水平上仍有许多相似之处，因而可将其作为研究各种类型体细胞决定与分化机理等发育生物学问题的新颖的实验模型。与传统的整体胚胎的研究相比，体外ES 细胞具有以下几个优点：

(1)ES细胞在体外可分化形成各种终末细胞, 这为研究某些前体细胞的起源和特性提供了理想的实验体系。(2)体外培养系统能定性甚至定量地研究某些细胞因子，胞外基质等因素对细胞生长和分化的影响，避免和减少了整体胚胎研究中各种内源性因素干扰的复杂性。(3)在研究胚胎早期发育中某些必需基因的功能时，在体胚胎的这些基因常发生突变引起胚胎过早地在子宫中死亡，而在体外这些基因突变的ES 细胞仍保持存活、增殖和分化的潜能，参与胚胎发育[4]。因此为研究这些基因在胚胎发育中的功能提供了基本条件。

2. 细胞全能性检测的方法

2.1 胚胎嵌合技术

嵌合体是指由2个或2个以上受精卵发育成的复合个体。将早期胚胎未分化的细胞(ES细胞和胞团细胞) 导入另一个品种动物的早期胚胎中, 可获得嵌合体动物［5］。如果细胞具有全能性(或多能性), 它就可参与受体胚胎的发育, 形成组织。若不参与受体胚胎的发育, 注入的细胞就不具备全能性。

2.1.1嵌合体制作技术

聚合法：将ES 细胞, 内细胞团细胞或早期的卵裂球与一个或多个去透明带胚胎聚合培养, 形成胚胎嵌合体, 再通过胚胎移植, 使受体妊娠, 检测ES 细胞参与胚胎发育的情况, 就可证明ES 细胞是否具有全能性或多能性。ES 细胞与8-16细胞期胚胎嵌合, 形成嵌合胚, 将嵌合胚进行胚胎移植, 生产嵌合鼠。

共同培养法：将裸胚置于浓度为106个/ml的ES 细胞悬液中, 培养3-4 h,再将聚合胚移入新鲜培养液中过夜, 即得嵌合胚[6]。在体外培养到囊胚阶段, 移入受体子宫, 使妊娠, 并对胚胎

或活体后代进行检测, 就可证明ES 细胞的多能性。

囊胚注射法：用显微注射法将ES 细胞直接注射到正常囊胚的胚腔中, 使ES 细胞与ICM 嵌合, 形成嵌合胚, 并对嵌合胚进行分析, 也可证明ES 细胞的全能性(或多能性) 。

2.1.2用于检测ES 细胞在嵌合体表达的方法

色素分析法 :选择两种肤色、毛色差异明显的动物胚胎干细胞与胚胎进行嵌合, 观察胎儿或个体的肤色或毛色, 若呈现皮毛嵌合体, 证明胚胎干细胞参与了胚胎发育, 具有多能性。色素分析法的优点是简单易操作不需任何仪器, 仅凭肉眼即可观察到结果。缺陷是难以检测到其它性状的嵌合。

生物化学分析法 :利用生物化学法、免疫组织化学法分析嵌合体, 确定ES 细胞在器官或组织中嵌合的表达程度及细胞的分化等。常用的重要方法是同工酶分析。首先应选用同工酶谱系不同的两种或多种动物, 一种做为分离干细胞的供体材料, 另一种做为嵌合胚的受体胚胎, 将胚胎干细胞与受体胚胎嵌合形成嵌合胚。如果用电泳方法分析嵌合动物(胚胎) 的同工酶, 出现两种特异的同工酶带谱, 就证明ES 细胞参与了胚胎的发育, 具有多能性, 若只出现一种带谱, 则说明不是嵌合体［6］。

利用标记基因检测 :利用DNA 重组技术将抗药性基因在体外与腺病毒载体相结合, 通过腺病毒的感染, 使外源基因与ES 细胞基因整合形成转基因ES 细胞。将这种ES 细胞通过核移植形成重构胚或通过显微注射形成嵌合胚, 通过胚胎移植获得的嵌合动物或核移植动物少量组织在含有特定药物的培养基中培养, 若能正常增殖, 证明ES 细胞参与了该组织的形成, 具有发育全能性或多能性。Mitan-k 等用这种方法成功地获得了具有抗新霉素的小鼠ES 细胞的克隆, 丛笑倩等获得了抗秋水仙碱的ES 细胞, 并产生了嵌合鼠［7］ 。

生殖细胞系中的嵌合:用携带特定基因的ES 细胞制作嵌合体, 如果ES 细胞参与配子形成, 特定基因即可在子代表达。

2.2原核注射技术

将目的基因用显微注射的方法导入受精卵原核中, 获取具有标记性状的转基因胚胎。在体外分化抑制培养转基因胚胎, 形成内细胞团, 从中分离克隆具有特定，标记性状的ES 细胞。以其作供体进行核移植, 检测目的基因表达产物, 就可对ES 细胞的全能性或多能性进行鉴定。将这种技术与核移植和胚胎嵌合等技术相结合, 就可以在ES 细胞的功能方面检测其全能性或多能性。尽管这种转基因技术已成功地应用到小鼠、山羊、绵羊、兔子、猪和牛等动物, 但仍存在许多问题, 如导入的基因并非全部在细胞期整合形成转基因胚胎。目的基因的随机整合导致其产物发生变化，只有少数简单基因能够表达产物等。这都限制了该项技术的应用。

2.3 ES细胞的诱导分化检测技

体外分化试验⑴类胚体：将ES 细胞从饲养层转移到涂有明胶的培养板中(6×106个/10

cm 板) 培养3 d,待ES 细胞集落形成时, 用PBS(-)清洗细胞表面, 并加入2 ml胰酶, 消化2 min。轻轻摇动培养皿, 使细胞成片或成凝集团状离开底层, 然后加入过量DMEM+10%NBS培养液中和酶。将ES 细胞团在无饲养层溶液中悬浮培养4-5 d,若形成简单类胚体, 就证明培养细胞具有多能性。⑵囊状胚体 将类胚体在培养液中继续培养8-10 d(每2 d换一次溶液), 可形成囊状胚体。⑶类胚体贴壁分化 将4月龄的类胚体以适当密度在明胶层上培养。2 d 后将贴壁进一步培养发分生分化, 形成诸如神经细胞、肌肉细胞等, 然后采用组织切片技术进行鉴定。⑷定向诱导分化 将待测ES 细胞培养在无分化抑制因子但有某种定向分化的诱导因子的培养基中, 若形成特定的组织, 即证明这种细胞具有多能性, 用于ES 细胞定向诱导分化的试剂主要有维生素A 酸(Retinotic acid, RA), DMSO(二甲基亚砜) 、六亚甲基乙酰胺及神经生长因子等。在实践中, 将ES 细胞培养在含有RA 的培养基中,RA 诱导ES 细胞分化形成体壁内胚层; 用神经生长因子诱导聚集培养的ES 细胞, 形成有节律性收缩的心肌细胞。这说明, 用定向诱导分化的方法, 可对ES 细胞进行初步鉴定［8］。体内分化试验 将浓度为106个/ml的ES 细胞悬液注射入同源动物皮下, 形成混合组织瘤, 取瘤块, 按常规方法制作组织切片, 染色, 观察细胞分化情况。若形成多种组织细胞, 就可证明注入的细胞具有多能性。该方法不需复杂的培养条件, 利用动物体稳定的内环境, 易于成功。

2.4胚胎干细胞核移植技术

细胞核移植技术是哺乳类动物胚胎工程的重要组成部分, 也是实现同型动物克隆的有效方法。采用该技术可对移植细胞的全能性进行有效的检测。将瓜蟾的囊胚细胞移入去核的卵母细胞, 获得具有繁殖力的后代, 将ICM 细胞转入去核卵母细胞形成重构胚, 该重构胚可发育至正常仔鼠, 此外, 家兔、山羊及牛的早期胚胎细胞及ICM 的核移植胚胎都能发育成个体[9]。Campbell 等用第三代类ES 细胞作核移植, 获得4只绵羊, 从实践上也证明, 用细胞核移植技术进行胚胎干细胞全能性鉴定是可行的。

2.5 免疫学方法鉴定

碱性磷酸酶染色或免疫荧光标记是检测ES 细胞多能性比较可靠的方法。ES 细胞保持着早期胚胎未分化的特性, 其表面含有丰富的AKP 及胚胎阶段特异性抗原, 采用AKP 染色或SSEA 免疫荧光标记,ES 均表现为阳性反应[10]。

3. 冷冻剂对小鼠胚胎干细胞全能性的影响

3.1冷冻剂的温度

胚胎干细胞经传代长期培养后会导致核型出现异常、未分化细胞的克隆数减少, 因此经低温保存后复苏的胚胎干细胞必须要保持其未分化状态及生物学特性。但是冷冻温度对其全能性表达是有很大的影响的，冷冻温度过高或者过低都很难使哺乳动物胚胎干细胞得全能性高效表达。

3.2冷冻剂的类型

冷冻保存是干细胞的研究及其应用的核心技术之一，安全高效的胚胎干细胞冻存方法是胚胎干细胞广泛用于研究和应用的必要条件。采用不同的冷冻剂将会对小鼠胚胎干细胞的全能性高效表达产生一定程度上影响。当前能用作制冷剂的物质有80多种，最常用的是氨、氟里昂类、水和少数碳氢化合物等。

3.3 冷冻保护液的改良

胞内冰晶会形成，会给细胞器造成机械损伤，干细胞冷冻保存是干细胞研究和临床应用中的必需技术。为提高小鼠胚胎干细胞在慢速冻存过程中的保存效果，必须对其冷冻保护液进行改良。所以本设计在一定基础上对冷冻保护液的配方进行一些研究和探索，并且设计一系列实验对传统的几种冷冻剂保护液配方进行重新整合，在剂量上和浓度上进行一些尝试，以寻求一种高效良好的胚胎干细胞冷冻保护液的配方[11]。

4. 胚胎干细胞研究的意义和前景

4.1 胚胎干细胞研究的意义

从理论上讲，小鼠胚胎干细胞具有发育成某一器官的能力，但还没有用干细胞体外培养成器官的报道。不过，如果将小鼠胚胎干细胞移植到重度复合免疫缺损小鼠（SCID ，它不会排斥移植的细胞）体内时，胚胎干细胞则能够发育成肌肉、软骨、骨骼、牙齿和毛发。但无论如何，如果直接将分离的小鼠胚胎干细胞植入子宫内，它们不会发育成个体小鼠，因为没有着床必需的滋养层细胞。这种条件下，胚胎干细胞被认为是多能的（pluripotent ），而不是全能的（totipotent ）。尽管如此，如果将胚胎干细胞植入不能发育成个体的四倍体胚胎中，再将该胚胎植入小鼠子宫中，那么可以获得完全是由培养的胚胎干细胞产生的正常个体小鼠。这表明了胚胎干细胞具有难以置信的全能性。

由于以下几个原因，胚胎干细胞的研究使人感到激动。首先是它们拥有类似胚胎的全能分化性，可以从单个的受精卵发育成完整的个体，能够给我们解释完整的发育体系，而成体个体来源的多能干细胞就不可能。同时，极早期的胚胎发育均可追溯到ES 细胞，而不可能是成熟个体来源的多能干细胞。ES 细胞也是唯一不死的细胞，能够非限定地分化，是细胞的源头。ES 细胞天生就是全能的，这就是问题的关键，换言之，他们能制造机体需要的全部细胞。最后，ES 细胞是遗传操作的最早期细胞。因此，尽管目前的争论集中在治疗方面，但也许ES 细胞最伟大的用途是作为科学研究的工具。

人胚胎干细胞的分离及体外培养的成功，将给人类带来医学革命。如果科学家最终能够成功诱导和调控体外培养的胚胎干细胞正常的分化，这一技术将对基础研究和临床应用产生巨大的影响，有可能在以下领域发挥作用：体外研究人胚胎的发生发育，非正常发育（通过改变细胞系的靶基因），新人类基因的发现，药物筛选和致畸实验，以及作为组织移植、细胞治疗和基因治疗的细胞源等。

人胚胎干细胞提供了在细胞和分子水平上研究人体发育过程中的极早期事件的良好材料和方法，这种研究不会引起与胚胎实验相关的伦理问题。采用基因芯片等技术，比较胚胎干细胞以及不同发育阶段的干细胞和分化细胞的基因转录和表达，可以确定胚胎发育及细胞分化的分子机制，发现新的人类基因。结合基因打靶技术，可发现不同基因在生命活动中的功能等。另一个令人兴奋的应用在于新药的发现及筛选。胚胎干细胞提供了新药的药理、药效、毒理及药代等研究的细胞水平的研究手段，大大减少了药物实验所需动物的数量。目前上述实验使用的细胞系或来自其他种属的细胞系，很多时候并不能真正代表正常的人体细胞对药物的反应。胚胎干细胞还可用来研究人类疾病的发生机制和发展过程，以便找到有效和持久的治疗方法。

4.2 胚胎干细胞研究的前景

4.2.1 研究人胚胎发育及疾病的发生

此前对人胚胎的了解仅局限于从胚胎组织切片和其他种属胚胎的研究中获取信息，但人与动物之间在胚胎发育和成体结构上都有很大差别。如今，可以通过胚胎干细胞建立体外分化模型，并建立各种基因改变的胚胎干细胞系，以求发现某些基因或细胞因子在胚胎发育早期对不同类型细胞或组织分化的作用。

4.2.2 用于移植和基因治疗

在组织工程中以胚胎干细胞作为种子细胞，可以为临床的细胞、组织、器官移植提供大量的材料。通过控制胚胎干细胞生长环境、向胚胎干细胞转染某一种系细胞形成的决定基因等，可获得特定种系的较纯化的细胞，并且数量不受限制。将这些细胞用于移植治疗，将给帕金森氏病、脊髓损伤、糖尿病、心肌损伤、肝硬化、肾衰竭、各种血液疾病等疑难症的治疗带来新的希望[11]。

利用基因打靶技术使外源性ＤＮＡ与胚胎干细胞中的相应部分重组，或靶向破坏等位基因造成基因纯合失效来治疗某些遗传性疾病，具有基因转移效率高、易于操作的优点[12]。 目前, 胚胎干细胞已经在多种疾病的治疗中发挥着重要的作用。如帕金森氏综合症是以某些运动障碍(静止性震颤、肌强直、运动迟缓和姿势反射丧失) 为临床特征的一组疾病。发病是由于多巴胺神经系统病变或损伤引起原发性多巴胺缺损。正常健康状态下, 乙酰胆碱和多巴胺的效应之间存在一种平衡状态。患病时多巴胺减少, 打破平衡, 导致病人活动障碍。所以可以在体外培养胚胎干细胞, 并定向诱导其分化成生成多巴胺的神经细胞, 可望用于治疗帕金森氏综合症[12]。

4.2.3 用于药物筛选和药物开发以及作为外源基因

用于药物筛选和药物开发新药在临床使用前需要进行一系列的检测和实验，这些实验都依靠动物来完成。但是动物模型实验不可能完全反映药物对人体细胞的作用。胚胎干细胞或许能模拟体内细胞或组织对被检测药物的反应，从而提供更安全、更有效、更经济的

药物筛选模型。

导入的重要受体细胞之一随着功能基因组学研究的全面展开，利用胚胎干细胞建立转基因动物的研究热点在基因打靶上，因为这种方法能够将外源基因导入靶细胞染色体上某一特定部位，或使某一基因发生定点突变实现了外源基因的定点整合[13]。80年代转基因鼠的产生，使人们致力于建立有效的分析系统来从分子水平上研究不同的生物学问题. 到了90年代，通过基因打靶在基因组水平上建立突变体己经成为近年来广泛应用的技术，而建立于ES 细胞和基因打靶技术上的复杂的转基因体系无疑得到了普遍的应用. 这项新技术对分子生物学、生理学、发育生物学等领域都产生了重大的影响. 它不仅可以将一些在发育过程中对动物体通常非必需或可被替代的特定基因敲除在体进行功能缺失研究; 还可以研究基因在不同发育时期中的作用。这其中最主要的发现是ES 细胞系的分离及其未分化状态在体外的永久保持的特性。并且，这些细胞也能重新植入胚胎内发育成包括生殖系统在内的各种组织。另外，ES 细胞作为一种体外细胞系，提供了一个研究处理整体细胞群的实验体系。因此，就有可能人为地产生，些基因突变，如对胚胎致死性基因的研究等，也可利用这些突变的基因来克隆产生转基因小鼠，从而建立了基因突变的模型。

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