豌豆茎尖的培养方案
豌豆茎尖的培养方案
一、试验目的
通过实验，初步掌握外植体植物材料消毒、接种的无菌操作技术以及外植体愈伤组织诱导和 分化的方法。
二、实验原理
植物组织培养是应用无菌操作的方法培养离体的植物器官或组织，甚至单个细胞的过程。 如果组织培养使用的植物材料是带菌的，在接种前就必须选择合适的消毒剂对植物外植体经行表面消毒，获得无菌材料去进行组织培养，这是取得组织培养成功的最基本的前提和重要保证。
植物细胞具有具有全能型，外植体在合适的培养基上，通过脱分化 ，形成一种能迅速增殖的无特定结构和功能的细胞团--------愈伤组织。
植物增长调节剂是诱导外植体 形成愈伤组织和愈伤组织分化的重要影响因素。
消毒目的：通过表面消毒剂杀死植物材料（外植体）表面微生物，同时要尽可能保持植物体材料的生命体。
三、实验材料、试剂及器具
（1）材料：豌豆叶片
（2）试剂及培养基
10%NaClO（全班配2000mL ）
75%乙醇（全班配2000mL ）
无菌水
0.1%新洁尔灭（全班配2000mL ）
豌豆叶片的培养基
（3）器具：超净工作台、无菌吸水纸、脱脂棉花、标签纸、记号笔、酒精灯、烧杯、镊子、剪刀、解剖刀、生长素、豌豆茎尖等。
四、操作步骤
① 培养基、用具灭菌
② 打开超净工作台紫外灯20min, 关灯后要等20min 才能进入实验室
③ 进入接种室：穿已灭菌工作服，换拖鞋，接种前用75%酒精或0.1%新洁尔擦手 ④ 选取外植体
⑤ 自来水冲洗
⑥ 75%酒精浸泡30s
⑦ 10%NaClO侵侵15~20min
⑧ 无菌水冲洗4~5次
⑨ 无菌吸水纸吸干
⑩ 分割成边长为0.8~1cm的正方形
11 火焰上方接种
12 盖紧瓶盖
13 培养
14 清理超级净工作台
接种注意事项
接种前75%酒精或0.1%新洁尔灭擦手
● 进入接种室：穿已灭菌工作服，换拖鞋
● 接种时尽量不说话，戴口罩（防交叉污染），不要在接种室来回走动 超净工作台的使用
接种前，用75%酒精棉球或1%新洁尔灭溶液擦拭超净工作台台面
将培养基及接种用具放入超净工作台台面
打开超净工作台紫外灯，照射约20~30min
关闭紫外灯，打开送风开关
通风10min 后，开日光灯即可进行外植体的消毒和接种等无菌操作
五、观察记录
观察污染情况
细菌性污染：菌斑呈粘液状，接种1~2天出现
真菌性污染：出现不同颜色（霉菌），接种后3~10天出现
材料发黄，组织变软，可能是因消毒时间过长，组织破坏死亡 污染率（%）=污染的材料数/接种材料总数×100
观察愈伤组织情况
愈伤组织出现时间
愈伤组织形态特征
颜色
质地
诱导率（%）=形成愈伤组织的材料数×100
如污染严重或没有诱导出愈伤组织，则需重新做实验