土荆皮总二萜酸的代谢产物和代谢途径

药学学报 Acta Pharmaceutica Sinica 2014, 49 (8): 1169−1174 · 1169 ·

土荆皮总二萜酸的代谢产物和代谢途径

刘 鹏1, 2, 郭洪祝1, 3*, 孙江浩1, 徐 曼1, 郭 慧1, 孙士丰1, 果德安1*

(1. 北京大学医学部药学院天然药物学系, 北京 100083; 2. 国家知识产权局, 北京 100088;

3. 北京市药品检验所, 北京 100035)

摘要: 综合运用体内实验和多种体外实验模型, 初步分析了土荆皮总二萜酸 (total diterpene acid, TDA) 的代谢情况。在口服和静脉注射给药实验中, 使用HPLC-UV 和HPLC-ESI/MSn 方法在大鼠血、尿、粪和胆汁 样品中都检测到主要代谢产物土荆皮丙2酸 (pseudolaric acid C2, PC2), 还可检测到脱甲氧基脱乙酰氧基土荆皮 乙酸 (demethoxydeacetoxypseudolaric acid B, DDPB), 以及推测为土荆皮丙2酸的葡萄糖苷 (PC2G) 的代谢产物, 原形药物中的土荆皮丙酸 (pseudolaric acid C, PC)、土荆皮甲酸 (pseudolaric acid A, PA)、土荆皮甲酸葡萄糖苷 (pseudolaric acid A O -β-D glucopyranoside, PAG)、土荆皮乙酸葡萄糖苷 (pseudolaric acid B O -β-D glucopyranoside, PBG) 和脱乙酰基土荆皮甲酸 (deacetylpseudolaric acid A, DPA) 也可以检测到。实验表明, TDA的代谢与肠内菌无关, 胃蛋白酶和胰蛋白酶不是主导TDA 代谢的因素, 在胃、肠道的pH 环境下TDA 也是稳定的。TDA 在体外DDPB 和PC 2G, 证明TDA 在体内的代谢转化反应主要是在血液中完成全血孵育模型中的主要代谢产物是PC 2、

的, 并且主要归结于血浆酯酶对酯键的水解以及葡萄糖苷化反应。这一发现首次初步阐明了TDA 在体内的代谢途径, 对于明确土荆皮的有效物质基础、体内活性形式及其作用机制都具有非常重要的意义。

关键词: 土荆皮; 总二萜酸; 土荆皮乙酸; 土荆皮丙2酸; 脱甲氧基脱乙酰氧基土荆皮乙酸 中图分类号: R917 文献标识码: A 文章编号: 0513-4870 (2014) 08-1169-06

Metabolic pathway and metabolites of total diterpene

acid isolated from Pseudolarix kaempferi

LIU Peng1, 2, GUO Hong-zhu1, 3*, SUN Jiang-hao1, XU Man1, GUO Hui1,

SUN Shi-feng1, GUO De-an1*

(1. Department of Natural Medicines, School of Pharmaceutical Sciences, Peking University Health Science Center, Beijing 100083, China; 2. State Intellectual Property Office of People’s Republic of China, Beijing 100088, China;

3. Beijing Institute for Drug Control, Beijing 100035, China)

Abstract : The preliminary metabolic profile of total diterpene acid (TDA) isolated from Pseudolarix kaempfer i was investigated by using in vivo and in vitro tests. Pseudolaric acid C2 (PC2) was identified as the predominant metabolite in plasma, urine, bile and feces after both oral and intravenous administrations to rats using HPLC-UV and HPLC-ESI/MSn , and demethoxydeacetoxypseudolaric acid B (DDPB), a metabolite proposed to be the glucoside of PC2 (PC2G), as well as pseudolaric acid C (PC), pseudolaric acid A (PA), pseudolaric acid A O -β-D glucopyranoside (PAG), pseudolaric acid B O -β-D glucopyranoside (PBG) and deacetylpseudolaric acid A (DPA) originated from TDA could also be detected. It was demonstrated by tests that the metabolism of TDA is independent of intestinal microflora, and neither of pepsin and trypsin is in

收稿日期: 2014-02-08; 修回日期: 2014-03-16.

基金项目: 国家高技术研究发展计划 (863计划) 资助项目 (2003AA2Z2030); 教育部长江学者和创新团队发展计划资助项目 (985-2-063-112) *通讯作者 Tel / Fax: 86-10-83226434, E-mail: [email protected];

Tel / Fax: 86-10-82801516, E-mail: [email protected]

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charge of metabolism of TDA, TDA is also stable in both pH environments of gastric tract and intestinal tract.

The metabolites of TDA in whole blood in vitro incubation were found to be PC2, DDPB and PC2G, which demonstrated that the metabolic reaction of TDA in vivo is mainly occurred in blood and contributed to be the hydrolysis of plasma esterase to ester bond, as well as the glucosylation reaction. These results clarified the

metabolic pathway of TDA for the first time, which is of great significance to the in vivo active form and acting mechanism research of P . kaempferi .

Key words: Pseudolarix kaempferi; total diterpene acid; pseudolaric acid B; pseudolaric acid C2; demethoxydeacetoxypseudolaric acid B

中药中活性化合物的代谢研究有助于揭示中药的有效物质基础和作用机制, 对新药研发、临床安全有效合理用药具有重要的指导意义。本研究前期已经报道了来源于松科 (Pinaceae) 植物金钱松Pseudolarix kaempferi Gord.的中药土荆皮 (Cortex Pseudolaricis) 中含量最高、各种活性最强的单体化合物土荆皮乙酸 (pseudolaric acid B, PB) 的初步代谢研究[1]。

但是, 中药的成分是复杂的, 中药的化学实体是活性物质群, 中药的作用方式具有多成分、多靶点、多效性的特点, 这已逐步成为国内外学者的基本共识[2]。中药的代谢研究仅仅对单一成分进行考察不能阐明中药的上述特点, 对有效部位或活性物质群的代谢过程进行研究, 更接近中药的临床应用实际, 能更好地反映中药的作用特点。在前期工作的基础上, 本文进一步研究了土荆皮的活性物质群——土荆皮总二萜酸 (total diterpene acid, TDA) 的代谢过程, 首次初步阐明了TDA 的体内代谢产物和代谢途径, 对于明确土荆皮乃至中药复杂体系的有效物质基础、体内活性形式及其作用机制都具有非常重要的意义。

材料与方法

仪器与试剂 Agilent 1100液相色谱仪和Chemstation 10.02A工作站 (美国Agilent 公司); Finnigan LCQ Advantage离子阱质谱仪和Xcalibur 数据处理系统 (美国Thermo 公司); IKA T18 basic 组织匀浆机 (广州仪科实验室技术有限公司); LXJ-II离心机 (上海医用分析仪器厂); HZQ-F全温振荡培养箱 (哈尔滨市东联电子技术开发有限公司); −80 ℃超低温冰箱 (美国REVCO 公司); Inertsil ODS-3 (4.6 mm × 250 mm, 5 μm) 色谱柱。

去离子水经Milli-Q 系统纯化 (美国Millipore 公司); 甲醇和乙酸为色谱纯, 其他试剂为分析纯, 均购于北京化工厂。

土荆皮总二萜酸的制备 取95%乙醇提取浓缩

而得的药材浸膏600 mL, 以2 L 5% NaHCO3混悬, 以6 L石油醚快速萃取3次, 水层加入5% HCl酸化

至pH 6, 以6 L乙酸乙酯萃取3次, 合并乙酸乙酯层, 减压蒸干, 以ODS 开口柱分离纯化, 以80% MeOH洗脱, 收集总酸部分, 得到黄色固体17.9 g, 用已有的HPLC 含量测定方法检测[3], 二萜酸类化合物含量为57.8%。

动物 清洁级Spraque-Dawley 雄性大鼠, 体重 (250 ± 20) g, 北京大学医学部实验科学动物部, 许可证号: SYXK (京) 2006-0008。

给药及样品采集 给药: 大鼠分组后, 置于代谢笼中正常饲养3天, 实验前禁食24 h。TDA 溶解于60% 1, 2-丙二醇中, 分别以200和20 mg·kg−1体重的剂量口服和尾静脉注射给药, 以等体积的60% 1, 2-丙二醇溶液作为空白给药。血浆: 大鼠灌胃或尾静脉注射给药后1、3、5、10、20、40、60和90 min, 2、3、4、6、8和10 h眼眶取血700 μL, 血样用肝素化的离心管收集, 于4 ℃、

9 000 r·min−1离心10 min, 收集血浆, 保存于−80 ℃中待用。尿样和粪样: 大鼠灌胃或尾静

脉注射给药后, 置于代谢笼中, 分别于12、24、36和48 h收集尿液和粪便, 保存于−80 ℃中待用。

胆汁: 大鼠灌胃或尾静脉注射给药后, 固定于鼠板上, 腹腔注射乌拉坦麻醉, 胆管插管, 分别于12、24、36和48 h收集胆汁, 保存于−80 ℃。

肠内菌抑制模型: 为考察肠内菌对TDA 代谢的影响, 连续6天口服给予大鼠新霉素 (200 mg·kg−1) 和链霉素 (200 mg·kg−1), 每日两次, 最后一次给予抗生素后4 h, 以200 mg·kg−1体重的剂量口服给予TDA, 以等体积的60% 1, 2-丙二醇溶液作为空白给药[4, 5]。同样方法收集尿样和粪样。

人工胃肠液体外孵育模型: 为模拟TDA 在胃肠液中的代谢情况, 分别取TDA (20 mg·mL−1) 100 μL 加入人工胃液和肠液10 mL中, 置于37 ℃培养箱中振荡培养, 分别于4、8、12、24和48 h取出0.5 mL, 保存于−80 ℃待用。人工胃液、肠液按药典方法配制[6]。

体外全血孵育模型: 为模拟TDA 在血液中的代谢情况, 将1.5 mL的Eppendorf 管预先肝素化, 加入

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TDA (20 mg·mL−1) 20 μL, 然后经颈总动脉插管接入新鲜全血1 mL, 混匀, 迅速置于37 ℃培养箱静置培养, 于1、5、10、30和60 min, 2、4、8、12和24 h取出, 4 ℃、9 000 r·min−1离心10 min, 收集血浆, 保存于−80 ℃待用。

碰撞诱导解离 (CID) 能量设为50%; 母离子分离宽度为3.0 Th。

结果与讨论

1 口服给药

1.1 血样分析 口服给药1 min后即可检测到明显

[7]

样品制备 血样: 大鼠血浆250 μL, 置于10 mL

离心管中, 加5% HCl溶液20 μL 酸化, 以EtOAc 的代谢产物1 (t 15.11 min), PC、PB 和PA 也可检测

R

−1

750 μL 萃取, 在涡旋振荡器上以2 000 r·min振荡 到; 3 min时, 代谢产物1的峰达到最高, 保留时间

3 min后, 于4 ℃、9 000 r·min−1离心10 min, 取上层 10.50 min的小峰是可能的代谢产物2, 同时PBG 、PC 、有机相, 下层水相再用EtOAc 萃取一次, 合并有机 DPA 、PB 和PA 也可检测到; 90 min时, 保留时间 相, 35 ℃ N 2吹干, 残渣以60% MeOH 250 μL 溶解, 2 000 r·min−1涡旋振荡1 min助溶, 过0.45 μm 微孔滤

膜, 即得供试品液。

尿样: 大鼠尿液1 mL, 置于10 mL离心管中, 加

5% HCl溶液80 μL 酸化, 以3 mL EtOAc萃取, 在 涡旋振荡器上以2 000 r·min−1振荡3 min后, 于4 ℃、 9 000 r·min−1离心10 min, 取上层有机相, 下层水相再用EtOAc 萃取一次, 合并有机相, 35 ℃ N2吹干, 残渣以60% MeOH 500 μL 溶解, 2 000 r·min−1涡旋振荡1 min助溶, 过0.45 μm 微孔滤膜, 即得供试品液。

粪样: 大鼠粪便置于研钵中研碎, 称取0.50 g (不足0.50 g的使用全部并记录重量), 加入10倍体积的60% MeOH, 超声提取30 min, 然后9 000 r·min−1离心10 min, 吸取上清液, 过0.45 μm 微孔滤膜, 即得供试品液。

胆汁: 大鼠胆汁0.5 mL, 置于10 mL离心管中, 加入5% HCl溶液40 μL 酸化, 以1.5 mL EtOAc萃取, 后续操作同尿样。

人工胃、肠液: 人工胃液或肠液样品0.5 mL, 操作方法同胆汁样品。

体外全血孵育样品: 同血样制备方法。 样品分析 HPLC: 使用Inertsil ODS-3 (4.6 mm ×

250 mm, 5 μm) 色谱柱; 流动相为A (甲醇), B (水, 含0.5% HAc), 梯度洗脱: 0～40 min, 55% A～90% A; 柱温40 ℃, 流速0.6 mL·min−1, 检测波长262 nm; 进样10 μL 进行分析。HPLC/ESI-MSn 条件: 使用Inertsil ODS-3 (250 mm × 4.6 mm, 5 μm) 色谱柱; 流动相为 C (甲醇), D (水, 含0.3% HAc), 梯度洗脱: 0～40 min, 55% C～90% C; 柱温40 ℃, 流速0.6 mL·min−1, 分流比1∶3, 检测波长262 nm; 进样10 μL 进行分析。ESI 正离子扫描模式: 喷雾电压, 4.5 kV; 鞘气 (N2) 压, 50单位; 辅助气 (N2) 压, 10单位; 毛细管温度, 300 ℃; 毛细管电压, 30 V; 锥孔电压: 15 V; 全扫描质谱记录范围为m/z 100～800; 多级质谱设定n = 5,

10.50 min的峰值明显, PB和PC 基本消失; 2～24 h, PC 2、DPA 和PB 逐渐清除, 见图1。通过与已知化合物的HPLC-UV 图谱对比, 确定代谢产物1与PC 2具有相同的保留时间, 确定保留时间10.50 min小峰与

DDPB 具有相同的保留时间。ESI/MSn 分析的结果显

示代谢产物1和PC 2

对照品具有相同裂解行为, 分子离子都为m/z 441, 二级质谱都能得到m/z 397、m/z 381和m/z 337的离子, 确定该产物即为PC 2[8]。保留时间10.50 min小峰的质谱响应较低, 其他峰干扰严重, 未能得到多级质谱的结果。

Figure 1 HPLC-UV chromatograms of plasma samples that

were collected at different times after oral administration of TDA (A) and TDA isolated from Pseudolarix kaempferi (B). Peaks 1−7 represent PBG, PC2, PC, DPA, PAG, PB and PA, respectively

1.2 尿、粪、胆汁样品分析 通过保留时间的比较, 给药后0～12 h内, 与血中一致的代谢产物1和代谢产物2大量经尿液和胆汁排泄, 保留时间15.65 min的PC 也大量排泄, 但不能确定其是原形排泄还是其他化合物的代谢产物, 还可见PBG 、DPA 和PB 的少

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量原形排泄; 12 h以后, 代谢产物的峰逐渐降低, 说明这两个途径的排泄逐渐完成。12～36 h主要以代谢产物1的形式大量经粪便排泄, 代谢产物2相对较少, PBG 、PC 、PB 和PA 少量经粪排泄。ESI/MSn 的分析结果表明, 代谢产物1为PC 2; 代谢产物2与DDPB 对照品具有一致的裂解行为, 分子离子都为m/z 399, 二级质谱都得到m/z 355的离子, 确定其为DDPB [8]; 保留时间15.65 min的峰与PC 有同样的裂解行为, 分子离子都为m/z 413, 二级质谱都得到m/z 369的离子, 确定其为PC [8]。 2 注射给药

2.1 血样分析 给药后1 min, 代谢产物PC 2的峰最高, DDPB也可检测到, 保留时间8.36 min的峰也是可能的代谢产物, 原形药物中的DPA 、PAG 和PA 也可以检测到。其后随着时间的延长, 各化合物的峰都逐渐降低, 到2 h基本从血中清除。代谢产物PC 2和DDPB 通过与已知化合物的HPLC-UV 图谱对比和ESI/MSn 分析确认。保留时间8.36 min峰的紫外吸收波长为266 nm, 符合二萜酸类化合物的特征, 其分子离子为m/z 603, 二级质谱得到的m/z 559、m/z 543、

m/z 499和m/z 441的离子分别是分子离子脱去-COO −

和-CH 3COOH, 同时脱去-COO −和-CH 3COOH (Δm =

104) 以及脱去六碳糖基 (Δm = 162) 的产物, 二级基峰离子m/z 559还可脱去糖基得到m/z 397的3级离子 (图2) 。综上, 确定该化合物为糖苷类, C-4位有 乙酰氧基, m/z 441为苷元离子, 初步推测其为土荆皮 丙2酸的葡萄糖苷 (PC2G) 。

2.2 尿、粪、胆汁样品分析 注射给药后0～4 h 内PC 和PC 2从尿液大量排泄, 还可见少量代谢产物PC 2G , PBG和PB 也可见明显原形排泄, 4 h以后经

尿排泄基本完成。给药后4～15 h, 仅有少量PB 原 形经粪排泄。24 h后, 代谢产物PC 2开始大量经粪 便排泄, DDPB仅有少量可以检测, PC的排泄也很 少, 原形化合物PBG 和PB 有少量排泄。同时, 给药后0～12 h内, 代谢产物PC 2大量经胆汁排泄, PC也有一定量的排泄, 代谢产物PC 2G 、DDPB 及原形PBG 、PB 和PA 也有少量排泄; 12～24 h仅有PC 2和PC 的少量排泄。代谢产物PC 2G 、DDPB 和PC 2通过与已知化合物HPLC-UV 图谱对比和ESI/MSn 的分析确认。

Figure 2 UV and MS spectra of metabolite with retention time at 8.36 min in plasma sample collected from rats intravenously admin-istration of TDA for 1 min (A: UV spectrum; B1: MS spectrum; B2: MS2 spectrum; B3: MS3 spectrum)

n

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TDA 注射给药后快速产生的代谢产物PC 2和DDPB 的结构都与原形药物的酯键断裂相关, 推测TDA 入血后被血浆酯酶迅速水解酯键。 3 肠内菌抑制模型大鼠口服给药

肠内菌抑制模型与肠内菌正常组相比, TDA代谢的情况基本一致, 提示其在体内的代谢应该与肠内菌无关。

4 人工胃液、肠液的体外孵育模型

结果表明, TDA在体外的人工胃液和肠液中都非常稳定, 提示TDA 在体内的代谢不是由胃、肠道内的胃蛋白酶和胰蛋白酶所主导, 其在胃、肠道的pH 环境下48 h内基本稳定。 5 体外全血孵育模型

TDA 在体外接触到全血后, 1 min时原形中的7个化合物都可检测到, 同时也可以检测到保留时间15.11 min的PC 2比原形明显增加。根据前文[1]单体 化合物体内过程分析的结果, 增加的PC 2应该是由PB 代谢转化而来。保留时间8.36 min的峰 (PC2G) 也开始出现, 这个峰在原形和空白血浆中都不存在, 应该是代谢产物。随着孵育时间的延长, 代谢产物PC 2的量持续增加, PB不断减少。60 min时保留时间 10.50 min的DDPB 开始出现, 4 h时PB 和PBG 基本消失。由于DDPB 的峰出现时间晚, 且量少, 推测此12 h时的DDPB 应该主要由PC 2断裂C-4酯键得来。以后, PC2和PC 都有一定减少, 而DDPB 则有所增加, 说明DDPB 也有可能由PC 断裂C-19酯键得来。整个过程中, DPA、PAG 和PA 都比较稳定, 始终可以检测到。

上述结果说明TDA 在体外全血孵育模型中发生的代谢反应基本模拟了TDA 的体内代谢过程, 从而证明TDA 在体内的代谢转化反应主要是在血液中完成的, 而且主要体现在血浆酯酶对酯键的水解以及葡萄糖苷化产物的生成。

小结

本文综合应用体内和体外代谢模型, 初步揭示了TDA 的体内代谢主要在血液中完成。如图3所示, TDA 的代谢产物主要以PC 2为主, 它是血浆酯酶快速水解PB 的C-19酯键的产物。DDPB 是很少量的代谢产物, 它可能由PC 2和PC 水解酯键得来, 推测这一过程也应该和血浆酯酶的作用有关。通过质谱 裂解规律推测代谢产物PC 2G 的结构为PC 2的葡萄 糖苷, 属于相对少见的Ⅱ相代谢产物, 这一结果需要进一步实验的确证。

Figure 3 Proposed metabolic pathway of TDA

口服TDA 后各种样品的HPLC-UV 图谱中都未检测到代谢产物PC 2G , 但是胆汁样品的ESI/MSn 分

析发现了PC 2G , 证明TDA 口服给药也能产生该代谢

产物, 该代谢物的产生应该与给药途径无关, 其在口服样品中几乎未检测到的原因可能是含量过低。

各种样品中测得的代谢产物和原形药物的分布情况见表1。总体上看, TDA经口服给药和静脉注射给药得到的代谢产物的种类基本一致, 不同给药途径和样品中检测到的原形药物略有不同。

Table 1 Metabolites and prototypes detected from samples obtained from oral and intravenous administrations, and whole blood in vitro incubation

Item Sample Metabolite Prototype Oral administration

Plasma

PC 2, DDPB

PC, PB, PA, PBG, PC, DPA PC, PB, PBG, DPA PC, PB, PBG, PA PC, PB, PBG, DPA DPA, PAG, PA PC, PB, PBG, PB, PC, PB, PBG, PC, PB, PBG, PA

Urine PC 2, DDPB Bile PC 2, DDPB Feces PC 2, DDPB, PC2G Intravenous administration

Plasma

PC 2, DDPB, PC2G

Urine PC 2, DDPB, PC2G Bile PC 2, DDPB, PC2G Feces PC 2, DDPB, PC2G Whole blood in vitro incubation

Plasma PC 2, DDPB, PC2G all the prototypes

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TDA 是7个主要二萜酸类化合物含量占57.8%以上的总提物, 其中PB 的含量占7个主要二萜酸化

合物的54%。研究发现, TDA在体内的代谢主要表 现为PB 的代谢, 其他的化合物多以原形排泄。7个主要二萜酸类化合物按照C-19取代情况的不同可分为两大类, 一类是以PB 为代表的C-19为羧酸基团的化合物, 还包括PBG 、PC 和PC 2, 另一类是以PA 为代表的C-19为甲基的化合物, 还包括DPA 和PAG 。TDA 入血后被血浆酯酶迅速水解酯键的代谢过程表现出了明显的取代基位置特异性, C-19酯键处于整个环系的边缘, 空间位阻比较小, 易被水解, 因此PB 能被快速而彻底的代谢成PC 2; 而C-4酯键由于处在母核的中心位置, 空间位阻比较大, 较难发生水解反应, 导致DDPB 的量很少。

由于大量PB 的存在可能竞争性抑制了PA 类物质的代谢, 再加上C-4酯键具有较大的空间位阻, 基本上PA 类化合物表现为原形排泄。此外, TDA中的两个苷类物质PBG 和PAG 的含量之和约占7个主 要二萜酸类化合物的18%, 但他们只表现出少量的原形排泄, 代谢行为不很明显, 需要进一步研究。PC 在7个主要二萜酸类化合物中约占15%, 其通过尿液大量排泄, 但是通过粪便和胆汁的排泄相对较少。由于PB 在体外的强碱环境中很容易先后水解C-19和C-4酯键得到PC 2和DDPB [9], 但是基本不会单独水解C-4酯键得到PC 。因此推测PC 在体内的大量排泄可能是原形排泄的结果, 而不是由PB 代谢而来, 这一推测尚需实验研究证实。

对比本文和前期[1]

研究的结果, TDA比PB 多出两个代谢产物DDPB 和PC 2G , 虽然这两个产物从结

构上看也与PB 及其代谢产物PC 2密切相关, 但是PB 却没有这两个代谢产物, 表明单体化合物和总提物的代谢存在着明显的区别, 造成这种现象的原因值得进一步深入探讨。这也提示, 中药代谢研究应注意将单体化合物和总提物的研究互相结合、互相验证, 才能更好的阐明中药这一复杂体系的体内代谢过程。

根据目前已有的报道, PC2基本无体外抗真菌和细胞毒活性

[10, 11]

, 但是由于已报道的活性成分PB 一

进入血液就被迅速代谢成PC 2, 因此PC 2在其他模型中的体外和体内活性, 非常值得进一步研究, 以确定其是否是体内的主要活性形式。而且, 由于目前的研究结果普遍认为PC 2的活性不强, 有理由推测TDA

中以原形排泄的其他活性化合物PA 、PBG 、PAG 可能会对TDA 的活性起到重要作用。

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