预测微生物学的研究进展

预测微生物学的研究进展

作者姓名：钟强

工作单位：安康学院

摘 要

简要介绍了预测微生物学模型的2个类型(品质预测模型和安全评估模型),特定腐败菌在微生物预测中的特殊作用,可追溯技术、温度综合函数和生物指示器等新技术在微生物预测中的应用,以及国外的预测模型库和国内的研究现状,展望了预测微生物学未来的发展趋势。

关键词：[微生物]；[预测模型]；[特定腐败菌]；[模型库]。

Advancement ofPredictive Microbiology

Abstract

Two types of the predictive microbiology model the special role of specific spoila gemicrobes; the applica-tions of technology, temperature comprehensive function and bio-indicator and other new technologies inpredictivemi-crobiology were raced,the research progressof the Repredictive ModelLibrary abroad and currentstudies in home coun-trywere briefly reviewed in this paper; and the development trend of the predictive micro biology was also prospected.

Keywords：[predictive micro biology]; [predictive model];[specific spoila gemicrobe];

[repredictive model library]

目录

摘 要 ......................................................................................................... i Abstract ..................................................................................................... ii

前言 ............................................................................................................. 1

1 微生物预测模型的类型 ...................................................................... 2

1.1 食品品质预测模型 ..................................................................... 2

1.2 食品安全评估模型 ..................................................................... 2

2 特定腐败菌(Specific spoilage or-ganism) ......................................... 2

3 技术手段与革新 .................................................................................. 3

3.1 可追溯技术 ................................................................................. 3

3. 2 温度综合函数(Temperature function inte-gration,TFI)和温度

监控 ....................................................................................................... 4

3.3 生物指示器 ................................................................................. 4

4 国外微生物预报模型库 ...................................................................... 6

5 国内预报微生物学研究现状 .............................................................. 7

6 展 望 .................................................................................................. 8

参考文献: ................................................................................................... 9

前言

20世纪80年代初,Ross等[1]最先提出“微生物预报技术”这一概念,从此预测微生物学便应运而生。食品预测微生物学(Food PredictiveMicro-biology)是一门在微生物学、数学、统计学和应用计算机科学基础上建立起来的新学科。它的发展方向是研究和设计一系列能描述和预测微生物在特定条件下生长和衰亡的模型。它是依据各种食品微生物在不同加工、储藏和流通条件下的特征信息库,通过计算机的配套软件,在不进行微生物检测分析的前提下,判断食品内主要病原菌或腐败微生物死亡、残存和增殖的动态变化,从而对食品安全做出快速评估的预测方法[2-3]。1983年,国外食品微生物学家小组应用直观预测的Delphi工艺,用计算机预测了食品货架期,开发了腐败菌生长的数据库,从此揭开了预测微生物学序幕[4]。上世纪八九十年代,由于食品安全问题的严峻形式,预测微生物学的研究对象主要是食品中的病原菌(如单核增生李斯特菌、沙门菌、金黄色葡萄球菌等),后来,随着食品企业对自身产品品质问题的关注,腐败菌的研究也逐渐发展起来,并且对这些细菌进行建模[5]。近年来美国、英国、澳大

利亚、丹麦等国更是致力于微生物预测软件开发,旨在对食品货架期进行有效的预测,并对致病菌进行风险评估[6]。

1 微生物预测模型的类型

1.1 食品品质预测模型

食品品质的变化受诸多因素影响,依据内在和外在因子来分析导致食品变质的主导因素,每一种产品有其特定的腐败菌(SSO)、腐败范围(SD)和腐败量(SL)。微生物生长模型只能用在初始限定的微生物类别、产品类型和贮藏条件范围内。为了获得精确的货架期预测,依据相关产品腐败过程来选择和运用微生物模型是重要的,例如修正的Gompertz方程是最佳拟合方程之一[7]。建立微生物生长曲线模型时,要考虑多个变量对微生物生长的影响,包括温度、pH、Aw、防腐剂等变量的数目和联合作用。在考虑温度、pH、Aw 3因素时,假设它们是分别独立的,相互之间没有影响的,使用修正Rat-kowsky和Davey方程。微生物生长曲线采用非线性回归分析结合Gompertz方程得到,然后使用多变量响应曲面法(Response surfaceMethodologyo-gy)来建立温度、pH、NaCl、NaHO2、空气状态等影响的立体生长模型。

1.2 食品安全评估模型

预测微生物风险评估常采用概率模型,为了预测致病菌生长的可能性或毒素的产生,将已知样品在确定的环境条件和固定时间培养,评估多个重复样品中微生物生长或产毒所占的比例,从而推导出各个因子下微生物生长的概率模型,概率模型主要适合孢子的萌发,通常使用Hauschild的一般方法来估算食品中肉毒梭状芽胞杆菌单孢子的萌发和产生毒素的可能性,有助于认知细菌孢子产生毒素受培养条件,如pH、温度、NaCl浓度的影响。概率模型最主要的应用领域是食品卫生质量管理。风险评估不能提供食品是否安全的答案,但可以通过输入有关参数对模型进行预测,使人们了解参数和加工步骤是如何影响食品安全的。概率模型与生长、残存模型相结合能够评估特定贮藏条件下特定产品存在的危害性,分析关键控制点。

失活/残存曲线是使用线性初始模型(Prima-rymodels)拟合数据得出的,往往用D值(decimalreduction time)和T4D(time to a 4-D inactivation)的对数值表示。D值受加热方式、孢子存在方式等多种因素的影响变化很大。失活曲线通过对实验分析所得的Ln(4D)、Ln(D)用SAS对反应曲线回归方程进行分析,结合温度、pH等影响因子,求出多变量二次多项式,使用非线性方程拟合得到多因素响应曲面图,在实验范围内可预测出D值[8]。

2 特定腐败菌(Specific spoilage or-ganism)

为了食品的保鲜防腐,研究人员对腐败微生物进行了长期研究,发现食品所含微生物中只有部分微生物参与腐败过程[9],上世纪90年代中期Dalgaard[10]提出了“特定腐败菌”(Specific spoil-age organism, SSO)的概念。在对食品微生物学的研究中发现,与致病菌动态响

应相比,腐败菌由于产品特征和贮藏条件的不同,其动态响应复杂且变化大[11]。研究者指出,食品腐败主要表现在某些微生物生长和代谢生成胺、硫化物、醇、醛、酮、有机酸等,产生不良气味和异味,使产品变得感官上不可接受[12]。不同的食品,导致其腐败的微生物种类是不同的,代谢产物也不尽相同,由此可以把食品划分成具有不同微生物生态的类群,即每种产品具有自身独有的菌相,那些适合生存繁殖并产生腐败臭味和异味代谢产物的微生物,就是该产品的SSO[13]。SSO在刚加工产品微生物菌丛中的数量少,仅占非常小的一部分,但贮藏中生长比其他微生物快,并且腐败活性强[14]。

研究证明,假单胞菌(Pseudomonas)、希瓦氏菌(Shewanella)是冷链流通中高水分蛋白食品的SSO[15];弧菌(Vibrionaceae)等发酵型革兰阴性菌是新鲜水产品的SSO[16];真空或气调包装蛋白食品的SSO为明亮发光杆菌(Photobacterium phos-phoreum)、乳酸菌(Lactic acid bacteria)、热杀索丝菌(Brochothrix thermosphacta)等[17];低酸、高盐、烟熏食品的腐败源于乳酸菌和酵母菌(Yeast);热处理食品的腐败往往和芽胞杆菌(Bacillus)有关[18]。相同地域的同类产品中,腐败优势菌往往包括几种微生物,但SSO可能只有一两种[14, 18]。由于SSO带来腐败,所以SSO的生长与腐败速度密切相关。SSO及其腐败代谢产物可作为食品品质指标,更重要的是,通过预测SSO的生长可以准确评估货架期[18]。欧盟“鱼类鲜度评定”项目研究发现,腐败希瓦氏菌、明亮发光杆菌、热杀索氏菌等SSO的数目与产品货架期的相关性在0. 90~0. 99之间[14]。

不同的原料、工艺、包装、贮藏等导致食品微生态系统的不同, SSO也随之变化, SSO生长预报模型只适合特定环境。为了准确预测货架期,必须针对不同产品进行食品微生物和微生态研究。微生物生长动力学模型的建立必须以加工、流通过程中积累的微生物学知识为基础。一般而言,预测模型的建立需要围绕腐败菌进行以下研究[19-20]:①腐败带来的种种反应(SR),无论是挥发性气味的产生还是色素的生成;②SSO,特别是导致各种腐败反应的腐败菌;③SD,例如在何种环境条件的范围内特定腐败菌导致系列腐败反应。同一种腐败菌在不同的环境下,所建立的预测模型评价值是不同的。

3 技术手段与革新

在考虑各种环境条件检测方法之前,必须认识到诸如监控系统、网络等资料库的重要性,这可以让我们由点及面进行相关工作,将离散数据由单点进行传输汇总,与通过文献获得的相似文献相比,这会获得很多强有力的新数据。在微生物预测工作中,可追溯技术、温度综合监控、生物指示器等都将使预测模型更加准确的应用于食品品质和安全地预测。

3.1 可追溯技术

可追溯技术诸如条形码或射频识别技术,对产品进行逐步追踪,运用独一无二的代码对物

体进行标示。这种方法是真实可靠的,不会发生非法产品替换的情况。可追溯技术如同‘正面对反面’一样简单,每一个销售人员都能借此识别出他们的供应商和顾客,并将这些信息提供给官方。对大多数消费者来说,印刷在产品上的条形码、机器代码是顾客识别追溯产品的最通常的技术。Neimeyer-Stein[21]对不规则代码进行了描述,认为条形码的变化同样包含了许多微生物方面的信息。

电子连锁分配监控系统,许多要依赖RFID技术,在流通过程中对产品的检测已经引起了足够的重视。Frederiksen等[22]指出除了产品识别码以外,在产品供应链中许多系统也运用温度测量技术在任意点获得及时的数据。此外,还可以通过身份识别加强冷链中系统效用。需要重点考虑的是通过通用的标准和标识对RFID技术进行补充[23]。通过原产地的工艺控制中的温度记录,在运输和贮藏过程中,加上进展报告中资料的复原、回顾性分析和手动检查,就能够获得实时报告。McMeekin等[24]已经通过Smart-Trace电子系统可以获得产品详细的报告。

3. 2 温度综合函数(Temperature function inte-gration,TFI)和温度监控

评估食物腐败率时温度是一个重要的因素,腐败率是用食物中病原菌的生长率来评价的。在许多情况下,温度可以使其他因素效应加强。Bigelow[25]首先提议将温度/时间曲线运用到热致死模型中以来,经过工艺实践已经在评价罐头食品热过程效力方面运用多年。TFI广泛应用于评价加工过程中的卫生情况,特别是肉类加工厂,用来评估在转运及贮藏过程中的安全性和稳定性,Labuza[26]认为在选择温度检测指示器时,化学、物理及电子指示器中,后者的应用范围最广。然而,McMeekin and Ross[27]指出生物温度指示器可以解答潜在的生化反应动力学,再运用新技术将知识转化为特有的、实用的、可出售的设备。

JuneOlley和他的研究小组[28]在上世纪70年代就指出温度指示器的不同类型,以及用以描述时间进程中某一点的腐败水平,它的应用都是以特定腐败水平和相对率这两个新概念为基础的,Nixon[29]提出改进了的线性相对腐败率,用Arrhenius动力学加以描述。值得注意的是对于用多种腐败进程描述的“通用的”腐败模型而言,这些腐败过程具有相似的活化能。此后Olley和Ratkowsky[30]又对通用腐败模型进行了进一步研究,出版了描述温度对对数细菌生长速率影响的热力学基础模型,理论依据是低温和高温下球蛋白的变性,这种模型同样可以描述温度对古细菌生长速率的影响。

3.3 生物指示器

目前逐渐采用快速的检测方法为预测模型的创建提供数据,除了应用化学和物理的指示器测量微生物的变化外,另一种方法是直接利用微生物生长,如生物指示器来反应食品中微生物的种视无菌加工过程,该指示器是一系列浸透了孢子的标签纸,对无菌加工工艺进行监视时,把生物指示器和食品一起进行热处理（牛乳菌落的时间- 温度指示器显示的剩余货架期与生

物化学方法实际测量的剩余货架期随存放时间的变化如下图）。然后把生物指示器放到合适的营养培养基中进行培养,观察其生长和pH的变化。

各节点前后牛乳菌落总数变化

The change of TBC with different storage time

在选择合适的生物指示器对货架期进行预测时,所选择的指示菌必须和特定的腐败微生物具有相同的温度特征。以巴氏灭菌均质牛奶/假单胞菌为例[27],指示菌的初始量为10-1cfu/mL,达到特定腐败水平(107. 5cfu/mL)时菌体大约需生长28代,该特定的腐败水平可由指示器中细菌生长的浊度来判断;当所预计产品中的起始细菌浓度为10-2cfu/mL时,在4℃条件微生物要经过约3代18 h的生长才能达到指示菌的起始含量,预测所需时间为真实货架期的90%。在应用中可采用不同的接种量,如指示菌的起始含量为100cfu/mL, 4℃时,食品中的微生物要经过约7代39 h的生长才能达到这一水平,预测时间为货架期的80%;而指示菌起始含量为101cfu/mL时,要经过约10代55 h的生长才能达到这一水平,预测时间为货架期的70%。用和延滞期等量的细胞传代时间(代时)对它进行调整,在计算剩余货架期时把延滞期也作为一个考虑因素。因此,通过调节指示器中细菌的起始含量,可以对产品货架期的各个点进行预测。

未来考虑产品的货架期和安全性时,一个突破点是开发混合培养的生物指示器,在不同储藏条件和产品形式下,用诸如食品微生物模型和假单胞菌指示器之类的系统模拟各种微生物的生长情况[33]。在预测模型中,生长速率并不是唯一的重要因子,而且,对腐败微生物和病原菌而言,它们在食品中所允许的检出下限不同。例如,当病原菌的数目在10以上,或腐败菌在为期7 d的储藏中,在混合生物指示剂的模拟下,预测模型可以指出7 d内是否可保证产品质量的储藏条件界限,同时也指明了各个条件,何种微生物的生长对产品保藏期起关键作用[34]

。

决定微生物的最大可能生长速率要求把具体研究结果和可能性的推测结合在一起,而且可以用它来开发广泛应用的化学整合器和混合的生物指示器。

4 国外微生物预报模型库

微生物预报技术的研究主要集中在美国、英国、欧盟、澳大利亚等国。目前世界上已开发的预报软件多达几十种,其中以美国农业部开发的病原菌模型程序PMP(PathogenModeling Program)、加拿大开发的微生物动态专家系统MKES(Micro-bialKinetics ExpertSystem)以及英国农粮渔部开发的食品微生物模型FM(FoodMicromodel)最为著名。美国农业部PMP模型库中有嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)、蜡样芽胞杆菌(Bacilluscereus)、肉毒梭菌(Clostridium botulinum)等十几种重要的食源性病原菌的生长、失活、残存、产毒等38个预报模型,每个预报模型包括温度、pH、Aw、添加剂等影响因子,见表1。使用时输入温度、pH、Aw(NaCl浓度)、添加剂等微生物生长影响因子和初始菌数,就可以得到微生物生长的重要参数,如延滞期、代时、生长曲线和生长数据[35]。

英国农业、渔业和食品部(UKMAFF)开发了“FoodMicromodel(FM)”—建立在数据库和数学模型基础上的食品微生物咨询服务器,是目前世界上开发的最为成熟的专家系统,具有数据库信息量大、数学模型成熟完善以及预测结果误差小的特点。其含有的二十几种数学模型对12种食品腐败菌和致病菌的生长、死亡和残存进行了数学表达,较为广泛地应用于食品生产、加工和配送等领域[36]。澳大利亚Tasmania大学在假单胞菌生长模型基础上开发食品腐败预测器(FSP, Foodspoilage predictor),是对食品品质进行多环境因子分析预测的软件[21]。主要是以恶臭假单胞菌(Pseudomonasputida)1442等菌株为研究对象,测得不同温度、Aw、pH条件下8 000多个生长数据,建立了500余条生长曲线;同时,用实际流通中大量数据对模型进行了验证和改良,建立了假单胞菌生长模型数据库,应用准确度的概念客观地评估预测值和实际值之间的比率,建立了微生物生长的数据库,形成专家系统和应用软件包,从而对特定腐败菌是假单胞菌的食品剩余货架期进行快速估测[37]。

许多同类的货架期预测系统也正在开发验证之中,如丹麦水产研究所的SSP(Seafood spoilage食品微生物学会议上,美、英两国科学家宣布,将共同建立世界上最大的预测微生物学信息数据库“ComBase”,该数据库将拥有约25 000个有关微生物生长和存货的数据库档案。预测微生物学如今已得到了前所未有的发展。

表1 PMP预报模型库的病原菌模型类别

5 国内预报微生物学研究现状

中国水产科学研究院东海水产研究所与美国农业部在PMP基础上联合开发的FSLP(Fishshelf life predictor)正在验证之中。许钟等[38]研究了0~15℃波动条件下,有氧贮藏养殖罗非鱼的SSO生长动力学模型及其对剩余货架期预测的适用性。由Belehradek方程建立了温度对假单胞菌生长动力学影响的数学模型,在设计的2种波动温度条件下假单胞菌生长动力学模型的预测值,与波动温度贮藏罗非鱼中假单胞菌生长的实测值比较,偏差度在0. 906~0. 942之间,获得的实测剩余货架期相比较,相对误差分别为5. 9%和-9. 1%。结果显示在贮藏温度波动的情况下,假单胞菌生长动力学模型同样可以快速可靠地实时预测0~15℃贮藏的罗非鱼剩余货架期。李苗云[39]对冷却肉中的微生物分布和作用进行了系统研究,应用修正的Gompertz函数建立了不同温度条件下SSO在猪肉中的6种生长曲线和模型,即0、4、7、10、14和20℃下猪肉中影响腐败品质SSO的生长模型。应用实际肉品中4℃和10℃污染的细菌总数对模型进行验证,建立的数学模型能很好地预测SSO在4℃和10℃下的生长动态,

偏差度(Bf)分别为1. 09和1. 18,准确度(Af)分别为0. 94和1. 09。

6 展 望

预测微生物学是数量化描述微生物的新兴学科,它在食品工业领域内有其独特的优越性。在预测微生物学这一领域所得到的定量的信息为监测储藏、流通、零售过程中商品货架期和安全装置的开发提供了坚实的基础。因此推测预测微生物学将成为准确估算商品货架期、计算剩余货架期和安全性评估的有效手段。目前的微生物预测模型尚无法完全预测某食品中微生物的增殖情况,高精度的智能专家模型有待开发。预测微生物学与神经元网络技术的结合使得数学模型的预测更为精确,神经元网络技术成为预测微生物学下一个发展阶段的重要技术支撑。随着我们进入系统生物学时代,生理学和分子层面的信息将会更多地运用到预测模型中,微生物预报学家将面临新的试验及数据处理方面的挑战。微生物学家与数学家之间的相互合作有助于困难的克服,有利于生态系统中微生物生长状态发展模型的描述。为了更好地进行微生物预测学的战略研究,应同时引进新技术,预测微生物将会有巨大的发展前景。

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