生物活性测定与质控

中药材　Journal of Chinese MedicinalM aterials 　　第31卷第4期2008年4

月

・473・

・专论・

生物活性测定在中药质量控制中

应用的可行性及研究思路

肖贵南, 李瑾翡, 陈浩桉

(广东省药品检验所, 广东广州510180)

　　摘要　中药具有成分复杂多变、活性成分多、药效成分和毒性成分不甚明确等特点, 目前绝大多数中药制剂质量控制主要采用理化分析方法, 存在一定的片面性, 没有与药效学建立直接的内在联系。重症疾病的治疗药物需要确保安全有效, 种能反映中药药效的生物活性测定思路, 标准的评价更全面更合理。当然, , , 生物活性测定法一。

关键词　中药; A 　　文章编号:100124454(2008) 0420473203

　　安全、有效、质量可控是药品的基本属性, 这一点应当通过质量标准体现出来。2006年以来我国陆续发生的“齐二药事件”、“鱼腥草注射液事件”、“香丹注射液事件”、“甲氨蝶呤事件”等重大事件, 使公众以及药品质量工作者对药品的安全性问题有了更深的认识, 但仅仅关注药品的安全性是远远不够的, 实际上药品的有效性从某种意义上讲更为重要。化学药由于成分单一、疗效确切, 有效性指标往往能在临床前得到较好的研究, 而中药特别是治疗急性和重症疾病的中药注射剂, 如果有效性得不到保证, 那么轻则贻误病情, 重则闹出人命。因此, 关注中药质量标准中的有效性指标是十分重要的。1　中药质量控制现状

中药具有成分复杂多变、活性成分多、药效成分和毒性成分不甚明确等特点, 从各级标准所载中药质量标准内容可看出, 自1953年第一版中国药典发行至今, 随着现代分析手段的大量应用, 中药质量控制水平有了巨大的飞跃。从传统的以感官为主发展到以仪器、外观(宏观) 表象为主, 继而又发展到以分子(微观) 物质基础为主。目前绝大多数中药质量控制主要采用理化分析方法, 近年来, 随着中药指纹图谱检测方法的推广, 使其质量控制由单一成分分析向综合与单一成分相结合的分析方向全面发展。

尽管中药质量控制水平发展很快, 但仍存在一些共性问题。例如, 在质量控制中重要指标即含量测定指标的选择上, 本应以药品的功能主治及所含成分为主要依据, 以尽量体现所测指标与药物安全性、有效性的关联。但目前在中药新药质量标准研究中, 含量测定指标选择不当是常见问题之一。经常选用的含量高、容易控制的成分未必是药效成分, 而含量过低的药效成分又不能保证与临床有效剂量之间的关联性, 用以控制和评价中药质量不够理想。例如以丹参为主药治疗心血管疾病的中药复方制剂, 测定丹参酚酸比测定丹参酮更能反应药物的质量, 却未能体现在质量标准中; 又如用于痔疮治疗的某中药复方制剂以五倍子为君药, 考虑到结合状态的鞣质可与蛋白质作用产生收敛效果, 其质控指标应选择水解后的总没食子酸量与水解前游离没食子酸量之差, 以间接反映结合状态鞣质的含量, 比采用水解后总没食子酸量为测定指标更能反映产品的有效性, 这一点同样未能在现有质量标准中体现出来。另外, 许多适应症完全不同的中药新药却采用相同的含量测定指标, 如芍药苷、黄芪甲苷、大黄素、绿原酸等, 难以真正反映中药制剂的质量。中药及其制剂的质量需要通过真正反映其安全性及有效性的成分表现出来, 一旦脱离了这两点, 其质量标准的制定就会偏离方向。

此外, 脱离成分有效性的单一成分含量测定分析方法和多种成分分析的指纹图谱检测方法, 虽然先进, 却具有一定的片面性, 如目前的指纹图谱技术多是在承认其传统药效的基础上开展的化学物质组成及量化研究, 却未以这些成分的药效作为指纹性依据。也就是说, 这种指纹图谱的研究与建立只是对中药产品成分的稳定性和可控性实行改进, 并没有与中药的药效建立直接的内在联系。

基金项目:广东省药品检验所科技创新基金项目(S N 20071112) ; 广州市科技局科技攻关重点项目(2007Z22E5061) 作者简介:肖贵南, 男, 硕士, 副主任药师, 研究方向:药品的生物安全性评价; Tel:[1**********]2, E 2mail:gzxgn@1631com 。

・474・

中药材　Journal of Chinese MedicinalM aterials 　　第31卷第4期2008年4

月

2　开展中药生物活性测定方法学研究的必要性和

可行性

中药特别是注射剂和危重症疾病的治疗药物都需要确保安全有效。因此在中药现代化的研究过程中, 必须重视质量控制与疗效评价标准的研究相结合。用生物检定法评价中药质量, 较理化测定法更能反映其生物活性, 可对整体的药效进行有效的控制。但目前仅有人工麝香和水蛭使用了指标成分的生物活性测定。中药活性成分的复杂多变性(中成药中君药和各成分功效的不确定性, 多种相似相反药效活性成分的存在, 活性成分间的协同、相加和拮抗作用, 原料和工艺过程中成分的变化) 、方法、质量标准的局限性(相对微量的限度, 性均需要验证, 必须重视中药质量控制的有效性研究。

近年来, 有些不法分子采用以假乱真、偷工减料、甚至在中药中加入指标成分蒙骗药检机构, 这样生产的假中药也许“符合”质量标准, 但由于没有生物活性或者活性过低, 显然属于假劣药品, 这一点完全可以通过对其生物活性进行测定而揭穿。

由于生产工艺不同以及储运过程中各种因素的影响导致某些生物活性成分降解或破坏, 故该药虽然符合质量标准, 但疗效未必能得到保证; 中药新药临床前研究阶段虽然经过主要药效学及临床研究, 但由于取样的代表性以及活性成分的可变性, 不能保证每一批样品都具有药效作用, 因此质量控制中进行生物活性测定也是必要的。

此外, 如何科学的提高中成药的疗效及更好地开发疗效肯定的中成药, 迫切地需要找到一种直接反映中药药效的生物活性测定方法, 这也将是中药现代化研究的重点之一。

众所周知, 天然药物研究中的一个难点, 就是复杂多样的化学成分与生物活性之间的具体关系。因此, 只有结合现代的药理技术去解析中药药效的物质基础, 将标示化学成分特征峰的中药指纹图谱与药效结果对应起来, 从单一成分的“微观分析”向群体成分的“宏观分析”发展, 找出二者之间的科学规律, 才能克服目前中药及其制剂质量控制中理化分析方法的局限性, 保证药效结果和指纹图谱分析结果的一致性, 为法定质量标准的提高提供依据, 最终建立中药及其制剂完备的质量评价体系。3　开展中药生物活性测定方法学研究的思路

生物检定法是药物内在质量控制的两大方法体

系(化学和生物学) 之一, 特别适用于成分复杂、具有多种活性成分和未知药效或毒性成分的药品。在现有药品质量标准中, 由微生物发酵产生的抗生素, 由动物为原料提取的生化药品, 由植物提取的洋地黄制剂以及药品杂质等均采用此法来评价药品的效价和安全性。中药也具有上述特性, 故采用生物活性测定法是可行的。311　总体思路　结合中药(特别是中药注射剂或治疗危重症的中药制剂) , 参考成熟的, 经过方法学和, , 取, 取不同的, 制定试行标准, 再经过验证、完善直至成为正式标准。312　基础　中药的“功能主治”是其生物活性测定的药理学基础; 而主要药效学实验方法和观察指标的阳性结果可作为生物活性测定的方法学基础, 并以此确定具体测定方法和检查限值剂量。313　方法　根据生物检定方法的要求, 采用符合国家药品标准要求的具有相似功能的中药有效成分(如葛根素、黄连素等单体成分) 或相同药理作用的化学药品(如氨茶碱、尼莫地平等) 作为阳性对照品, 根据药品的“功能主治”和主要药效学实验方法筛选2种左右的生物活性测定方法, 每种方法又可选取2个左右的观察指标, 以此比较供试组与对照品组的量效和时效反应参数。31311　样品剂量:在预实验时可设定3个剂量组(一般采用临床用量的715、15、30或5、10、20倍剂量组) , 筛选出1个经证实比较有效的剂量供正式实验用, 该剂量应低于急性毒性实验的最大耐受量(或最低致死量LD5) , 并不得出现明显的毒副反应。

31312　方法验证:依次进行重复性验证(同实验室用符合现有质量标准的同一批样品进行3次以上的实验) 、限度验证(条件允许时采用3家以上的同种样品进行测定并验证限值的合理性) 、重现性验证(在2个以上不同实验室对同批样品进行验证实验) 。

31313　根据中药的“功能主治”可参考的药效学

实验项目:

(1) 治疗痹症和心肌缺血实验:垂体后叶致大鼠心肌缺血实验、小鼠耐缺氧实验;

(2) 解热、镇痛实验:角叉菜胶或细菌内毒素解热实验、小鼠扭体实验;

(3) 止咳平喘实验:氨水刺激实验、离体豚鼠气

中药材　Journal of Chinese MedicinalM aterials 　　第31卷第4期2008年4

月

・475・

管实验;

(4) 抗炎解毒实验:小鼠耳肿胀实验、毛细血管通透性实验、抑菌实验;

(5) 活血化瘀实验:血小板聚集实验、耳廓微循环实验。

4　生物活性测定存在的问题

411　生物活性测定与中药的“功能主治”只能部分

413　生物测定方法存在一定的因生物个体差异而

引起的误差, 重现性和精密度较差, 因而对实验方

法、观察指标、限值剂量的设计要求较高, 需要多次验证, 直至建立一种相对成型的方法和指标。5　展望生物活性测定方法在中药质量控制应用研究中具有一定的创新意义, 目前国内还没有此类研究。随着该方法在化学药品、抗生素、生物制品中的广泛应用, 通过长期深入的研究, , 在中药现代化(2007-08-10收稿)

相关而不能完全一致。

412　生物活性测定只能针对中药做主要的药效学验证研究, 在现有相对成熟的药效学实验中选取一种或几种方法和指标进行, 难以完全真实反映所有的功效。

・栽培与育种鲍氏针层孔菌原生质体融合育种的研究

曾念开, 王秋颖, 苏明声

(11中国协和医科大学/中国医学科学院药用植物研究所, 北京100094; 21海南医学院药学系, 海南海口571101)

　　摘要　目的:鲍氏针层孔菌优良菌株的选育。方法:通过518S r DNA 2I TS 序列, 生长速度、液体发酵生产菌丝体和胞外多糖产量等方面, 对不同来源的菌株进行分析比较, 筛选出优良的亲本菌株。在此基础上, 采用双灭活标记, 原生质体PEG 诱导融合的方法。结果:筛选出亲本菌株S A02和S A04, 以及编号为R002、R003、R005等三个融合菌株与两亲本菌株都具有拮抗反应, 且菌落性状表现出不同于亲本的性状。结论:R002、R003和R005初步确定为双亲株的融合子。

关键词　鲍氏针层孔菌; 桑黄; 原生质体融合; 育种

中图分类号:R28212　　文献标识码:A 　　文章编号:100124454(2008) 0420475204

1, 2

13

1

The Breed ing of Phellinus baum ii by Protopl a st Fusi on

ZE NG N ian 2kai , WANG Q iu 2ying , S U M ing 2sheng

1, 2

1

1

(11I nstitute of M edicinal Plant Devel opment, Chinese Acade my of Medical Sciences and Peking Uni on Medical College, Beijing 100094, China; 21Depart m ent of Phar macy, Hainan M edical College, Haikou 571101, China )

Abstract 　Objective:T o breed good strains by p r ot op last fusi on in Phellinus baum ii 1M ethods:518S r DNA 2I TS sequences, my 2celial gr owth rate, mycelial bi o mass and exopolysaccharides (EPS ) p r oducti on of 7strains in different origins were analyzed, res pec 2tively 1Then the inactivated parent p r ot op last and the PEG inducti on were used in the p r ocess of p r ot op last fusi on 1Results:The strain P 1baum ii S A02and P 1baum ii S A04were selected as the parent strains 1R002, R003and R005had antagonistic effects with parent

strains 1Conclusi on:R002, R003and R005are fusants of the parent strains 1

Key words 　Phellinus baum ii ; Sanghuang; Pr ot op last fusi on; B reeding

　　锈革孔菌科(Hy menochaetacae ) 鲍氏针层孔菌Phellinus baum ii , 是我国传统药物桑黄的来源菌之〔1〕〔2〕〔3〕〔4、5〕一, 具有抗氧化、抗炎、降血糖等药理活

性。在我国, 野生鲍氏针层孔菌的资源越来越少。

〔6〕〔7〕

现阶段已采用栽培及液体发酵。但在人工栽培和液体发酵的过程中, 鲍氏针层孔菌菌株性状不

基金项目:国家科技部社会公益项目(2004D I A 3J011)

作者简介:曾念开(19782) , 讲师, 研究方向:药用真菌资源与应用; Tel:[1**********]80, E 2mail:niankaiz@1631com 。3

() 通讯作者:王秋颖, Tel:[1**********], E 2mail:qy wang@i m p lad 1ac 1cn 。