DNA半保留复制和半不连续复制的提出与确立

自然杂志第３２卷第４期

０２５３—９６０８．２０１０．０４．００８

自然科学史

ｄｏｉ：１０．３９６９／ｊ．ｉｓｓｎ

ＤＮＡ半保留复制和半不连续复制的提出与确立

向义和

教授，清华大学物理系，北京１０００８４关键词

半保留复制

半不连续复制

密度梯度离心法

脉冲标记实验

冈崎片段

尿嘧啶片段

笔者介绍了ＤＮＡ的半保留复制和半不连续复制提出与确立的过程：沃森和克里克提出ＤＮＡ半保留复制的思路；Ｍｅｓｅｌｓｏｎ和Ｓｔａｈｌ的实验验证；冈崎提出不连续复制的思路。并通过步步深入的实验证实。

ＤＮＡ的半保留复制和半不连续复制是ＤＮＡ复制的两种基本方式，生物体内ＤＮＡ双链的复制大都是以这两种复制方式进行的。

半保留复制是在１９５３年由沃森和克里克在分析ＤＮＡ结构特征的基础上，在探讨子代ＤＮＡ如何真实地获得亲代ＤＮＡ的遗传信息中，在回答ＤＮＡ怎样自我复制的问题时提出的。在半保留复制方式提出５年后，Ｍｅｓｅｌｓｏｎ和Ｓｔａｈｌ用放射性元素标记法和密度梯度离心法，通过探讨亲代原子在子代分子中分布的规律，从实验上验证了半保留复制方式。１９６８年冈崎在分析ＤＮＡ双链连续生长的推测与ＤＮＡ聚合酶只按ＤＮＡ的５７—３７延伸方向合成的事实的矛盾中，提出了不连续复制假设，接着他通过脉冲标记实验和密度梯度离心法，揭示了两条链上不连续复制的存在，几年后又通过基因突变体的实验证明了半不连续复制假设。

氮碱基有四种不同的类型，它们是腺嘌呤（ａｄｅｎｉｎｅ），鸟嘌呤（ｇｕａｎｉｎｅ），胸腺嘧啶（ｔｈｙｍｉｎｅ）和胞嘧啶（ｃｙｔｏ．ｓｉｎｅ），分别用Ａ，Ｇ，Ｔ，Ｃ表示。众所周知，沿着这条链的碱基的序列是不受限制的。由糖，磷酸基和碱基组成的单体称为核苷酸。ＤＮＡ单链是一条多核苷酸链。多核苷酸链一端的核苷酸具有自由的５’磷酸基团，而另一端核苷酸具有３７羟基基团。传统上按照５７到３’的方向写ＤＮＡ的顺序。ＤＮＡ分子不是由一条链而是由两条链组成的。这两条链围绕着一条共同的纤维轴盘绕，如图２所示。

两条链是由碱基之间的氢键连在一起的。这些碱基以成对的方式连接在一起，从一条链的一个单碱基通过氢键键结到另一条链的单碱基。重要之点在于只有确定的碱基配对才能适应于这个结构。受到形成氢键条件的限制，唯一可能的碱基配对是腺嘌呤与胸腺嘧啶

１半保留复制的确立

５

端一Ｏ

ｏ．～

。

１．１半保留复制的提出

在沃森（Ｊ．Ｄ．Ｗａｔｓｏｎ）和克里克（Ｆ．Ｈ．Ｃ．Ｃｒｉｃｋ）在《自然》杂志上把他们的ＤＮＡ双螺旋结构模型公诸于世后一个月。１９５３年５月３０日，他们又在《自然》杂志上发表了一篇题为“脱氧核糖核酸结构的遗传学意义”的论文［１］，对ＤＮＡ的复制过程提出了科学的预见。

他们在文章的开始部分，首先概述了ＤＮＡ双螺旋结构的基本特征：ＤＮＡ主链是由脱氧核糖和磷酸基（ＨＰ０４）有规则的交替组成的。每个脱氧核糖的糖环上有５个碳原子，分别标记为１７—５７，磷酸（Ｈ３１＇０４）分子与邻近核糖的Ｃ．３７位羟基（ｏＨ）和ｃ－５’位羟基缩合成两个酯键，将两个糖结合起来。在图１中连接到每个糖的含

ＯＨ

３’端

圈１ＤＮＡ单链的化学结构式

・２２９・

万方数据

ＨｉｓｔｏｒｙｏｆＮａｔｕｒａｌＳｃｉｅｎｃｅ

圈２

ＤＮＡ双螺旋结构

配对，鸟嘌呤和胞嘧啶配对，如图３所示。所以，两链是互补的，一条链上核苷酸排列顺序决定了另一条链上核苷酸排列顺序。就是说，ＤＮＡ分子的每一条链都含有合成它的互补链的全部信息。由于ＤＮＡ两条链是互补的，因此ＤＮＡ双链分子末端极性是５７—３７和３７－＇５７反向平行的。

ＡＤＥＮＴＮＥ

ＴＨＹＭＩＮＥ

破：忒＿

豳３腺嘌呤（Ａ）和胸腺嘧啶（Ｔ）对，鸟瞟呤（Ｇ）和胞嘧啶（Ｃ）对

这说明“专一的碱基配对直接地表明了遗传物质的一种可能的复制机制。”他们指出：“在这个模型中磷酸和糖的骨架是完全规则的，而在这种结构中碱基对的排列顺序是可以不同的。这一模型说明，在一个很长的分

・２３０・

万方数据

ＣｈｉｎｅｓｅＪｏｕｒｎａｌ

ｏｆＮａｔｕｒｅ

Ｖ０１．３２Ｎｏ．４

子中可以有很多不同的碱基排列顺序。因此，这似乎表明碱基顺序就是携带遗传信息的，如果已知两条链中一条的碱基顺序，根据专一碱基配对法则，可以准确无误地写出另一条链的碱基顺序。可见一条链和另一条链是互补的，正是这一特点表明脱氧核糖核酸分子是如何自我复制的。”

ＤＮＡ怎样自我复制呢？沃森和克里克把ＤＮＡ双螺旋看成是一对模板，这两条模板是彼此互补的。他们假定复制分两步走：在复制之前氢键断裂。两条链解开并彼此分离。然后，每条链都可以作为模板，在其上形成一条新的互补链，因此最终将得到两对ＤＮＡ链，这就实现了自我复制［２］（见图４）。这样新形成的两个ＤＮＡ分子与原来ＤＮＡ分子的碱基顺序完全一样。因此，每

合成的，所以这种复制方式被称为ＤＮＡ的半保留复制

（ｓｅｍｉｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｖｅｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ）

圈４

ＤＮＡ的半保留复制方式

他们还假设在单链存在的条件下对ＤＮＡ的合成做了如下的推测：“对我们的模型所进行的一番研究表明，如果单链（或单链的有关部分）形成螺旋构型的话，这种复制就可通过最简单的方式发生。我们假想在细胞生命周期的这个阶段，游离的核苷酸（严格说是多核苷酸的前体）在数量上是充足的。游离核苷酸的碱基将不时通过氢键的形成来连接到已形成的那部分链的碱基上。现在我们假定，只有当新产生的链能够形成所假设的结构时，这些单体聚合形成新链的过程才可能发生……是否需要一种特殊的酶来完成这种聚合过程，或者已形成的单条螺旋链是否本身就具有酶的效应，这样的问题仍旧有待研究。”

最后，他们认为他们提出的复制方式尚待实验的检个子代分子的一条链来自亲代ＤＮＡ，另一条链则是新验，并提出了一系列富有启发性的问题。他们说：“目前

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我们提出的有关ＤＮＡ复制的一般性过程必须被看成仅

仅是一种推测。即使我们这种推测是正确的，从我们所

描述的内容也清楚地反映了，在遗传复制过程能够被详细描述之前，还有很多内容有待发现。比如，多核苷酸的前体是什么？是什么导致双链的解旋和分离？蛋白质的具体作用是什么？染色体是由一对长的ＤＮＡ双链，还是通过蛋白质连接在一起的ＤＮＡ片段组成的呢？尽管存在这些不确定性，我们觉得我们提出的ＤＮＡ结

构仍然有助于解决一个基本的生物学问题，即进行遗传

复制所需要的模板的分子基础。”［３］

１．２半保留复制的实验验证

１９５８年，美国加利福尼亚大学生物化学教授Ｍｅ—ｓｅｌｓｏｎ和Ｓｔａｈｌ用实验证实了ＤＮＡ的复制是以半保留方式进行的。在当年《美国国家科学院学报》上，他们在题为《在大肠杆菌中ＤＮＡ的复制》的论文中介绍了这项工作［引。他们用放射性元素标记的方法和密度梯度离心法

探讨了亲代原子在子代分子中分布的规律。在氯化铯溶液梯度离心时，它的浓缩梯度和压力梯度导致沿着离心力方向的密度连续增加。存在于这个密度梯度场中的ＤＮＡ大分子它既有离开旋转中心的倾向。又有由较高浓度区域扩散到较低浓度区域的倾向，达到平衡时，ＤＮＡ分子就停在氯化铯溶液浓度等于ＤＮＡ分子浮力密度（即测定的分子密度）处，紫外光下可以看到一条吸收带。单一种类的ＤＮＡ分子分布在一条带上，如果存在几种不同密度的ＤＮＡ，每种ＤＮＡ的浮力密度等于氯化铯溶液的密度处形成该种ＤＮＡ的一条带。图５分别显示了用放射性元素，重氮（１５Ｎ）标记和轻氮（１４Ｎ）标记的ＤＮＡ的两条带，其浮力密度分别为１．７２４ｇ／ｃｍ３和１．７１０ｇ／ｃｍ３。

其中（ａ）图是拍摄的两条带的照片，（ｂ）图是用微密度计

探测的在（ａ）图的两条带中ＤＮＡ的分布。

郾

１４Ｎ．ＤＮＡ和”Ｎ・ＤＮＡ的两条带以及两条带中的密度分布检验ＤＮＡ是否按半保留方式复制的实验是这样进

行的：他们先把大肠杆菌在９６．５％同位索纯度的１５ＮＨ４ＣＬ的培养液中繁殖１５代，使所有的细菌ＤＮＡ都被１５Ｎ标记。然后取出样品，经氯化铯溶液梯度离心，达到平衡时，就形成１５Ｎ—ＤＮＡ重密度带。再把１５Ｎ标记的

万方数据

自然科学史

细菌ＤＮＡ转移到含正常轻同位素１４ＮＨ４ＣＬ的培养液中培养，在不同时间取出样品，用氯化铯溶液梯度离心，就可以得到各个子代的密度带。经过一代的时间，所有ＤＮＡ的密度都介于１５Ｎ．ＤＮＡ和１４Ｎ．ＤＮＡ之间，形成中间密度带。这可以按半保留复制解释，在半保留复制中ＤＮＡ是杂交分子，即形成１５Ｎ１４Ｎ的杂交分子。两条链中一条链是亲代１５Ｎ标记的重链，另一条是含１４Ｎ的轻链，这样两条链形成密度上杂交的ＤＮＡ。在１４Ｎ培养液中经过两代时间，就可以看见在氯化铯密度梯度中出现以相等量存在的两条带，一条在中间密度区域，另一条在低密度区域。按半保留复制方式会形成１５Ｎ¨Ｎ和

１４Ｎ１４Ｎ两种分子，所以出现了以相等量存在的这两条带。而且随着在１。Ｎ培养液中培养的代数的增加，中间密度区带的量始终不变，而低密度区带的量越来越多。这个实验结果与ＤＮＡ分子半保留复制是一致的［５｜。按照半保留复制，显然１４Ｎ¨Ｎ分子越来越多，如图６所示

沉降疗向

矗溢

混合带

图６ＤＮＡ半保留复制实验

根据这些实验结果，Ｍｅｓｅｌｓｏｎ和Ｓｔａｈｌ得出与半保留复制一致的结论：“每个亲代分子把两个亚单位传递给子代分子，每个子代分子只接受到一个亲代亚单位。由此可见，每个单个分子复制的作用导致进入作用的那些分子数量的加倍。”又指出：“现在的实验与沃森和克里克的ＤＮＡ复制模型所预测的是一致的。然而，必须强调的是在现在的实验中没有说明新发现的亚单位是单条多核苷酸链，在此研究的ＤＮＡ分子与沃森和克里

克提出的结构所指的单链ＤＮＡ分子相符合。”为了说明这点，他们做了热变性实验。

在第二个实验中．他们把１５Ｎ１４Ｎ密度杂交ＤＮＡ在１００℃下加热３０ｍｉｎ，然后在氯化铯溶液密度梯度中离心，导致加热前的坫ＮＨＮ中间密度带消失，出现了以相等量（即浓度相同）存在的两条带，这两条带之间的密度

・２３１

・

ＨｉｓｔｏｒｙｏｆＮａｔｕｒａｌＳｃｉｅｎｃｅ

差是０．０１５ｇ／ｃｍ３，接近于１５Ｎ－ＤＮＡ和１４Ｎ・ＤＮＡ密度的差值，如图７所示。这说明１５Ｎ－ＤＮＡ在正常轻同位素１４Ｎ培养液中复制的第一代ＤＮＡ是由一条１４Ｎ轻链和一条重同位素１５Ｎ重链组成的。这就进一步确证了ＤＮＡ的复制是半保留方式。

圈７在加热变性时大肠杆菌１５Ｎ¨Ｎ・ＤＮＡ亚单位的分离

２半不连续复制的确立

２０世纪６０年代日本名古屋大学科学学院分子生物

研究所教授冈崎（ＲｅｉｊｉＯｋａｚａｋｉ）等人对ＤＮＡ链的生长机制进行了研究。１９６８年在美国《冷泉港量子生物专题论文集》中介绍了他们的工作［６］６。他们在题为“在体内ＤＮＡ链生长的机制”的论文中写道：“Ｍｅｓｅｌｓｏｎ和Ｓｔａｈｌ的实验和后来的研究表明细菌染色体的复制是顺序地进行。这就导致染色体ＤＮＡ两条子代链连续生长的推断，在一条链上合成的方向是５７到３７，而在另一条链上是３７到５’（图８Ａ）。然而，两条链连续生长的这种机制与在试管内由ＤＮＡ聚合酶合成的ＤＮＡ在５７到３’方向进行的事实相矛盾。已经发现对于ＤＮＡ链的３７到５７方向的合成没有酶的反应。”当新生单链ＤＮＡ以亲代单链为模板进行合成时，其生长点是在３７端，还是５７端，即新生单链ＤＮＡ分子的延伸方向是５７—３’？还是３７—５７７２０世纪５０年代中期美国生物化学家科恩伯格（Ａ．Ｋｏｒｎｂｅｒｇ）就提出ＤＮＡ分子的复制过程必然是在ＤＮＡ聚合酶作用下的酶促反应过程。实验证明ＤＮＡ聚合酶只能利用引物分子提供的３＂－ＯＨ末端聚合脱氧核苷三磷酸（ｄＮＴＰ），所以７—３７。１９６０年，科恩伯格在《科学》上发表题为“ＤＮＡ的生物合成”的论文时，就明确指出：“ＤＮＡ聚合酶把单核苷酸加到引物链ＤＮＡ生长端的３７羟基上表明ＤＮＡ合成在５７到３’方向进行。”为了解决ＤＮＡ两条子代链连续生长的推断与ＤＮＡ聚合酶只能按ＤＮＡ的５７—３７延伸方向合成ＤＮＡ的事实的矛盾，冈崎提出了他的不连续复制模型。他写道：“如果在体内按照在图８Ｂ—Ｄ中所示的不连续机制合成，这・２３２・

万方数据

Ｃｈｉｎｅｓｅ

ＪｏｕｒｎａｌｏｆＮａｔｕｒｅ

Ｖ０１．３２Ｎｏ．４

链，在复制点按照５７到３’方向合成短的片段，然后连接这些片段成为长的ＤＮＡ链。”

心‘

、、卜一

／

∥纩

心纩≮∥心二

∥

，∥一。

圈８在ＤＮＡ的复制区域中可能的结构和复制的模型

接着，冈崎从这些不连续复制模型提出了如下的预测：①一条或两条子代链的最新复制的部分在变性后能够分离为有别于大的来自染色体其余部分的ＤＮＡ分子

的短的ＤＮＡ链。也就是说，在新合成的ＤＮＡ里存在许

多小的片段。②对于在ＤＮＡ链之间磷酸二酯键的形成，酶的专一性的和暂时的抑制，将导致新生短链明显的积累。也就是说，如果消除了使ＤＮＡ片段连接在一起的连接酶，将导致新生短链明显的积累。

为了检验不连续复制的第１个预测，他们首先进行了脉冲标记实验。１９６８年冈崎等人在《美国国家科学院学报》上发表“ＤＮＡ链生长的机制，Ｉ．新合成链的可能不连续性和不寻常的二级结构”中叙述了对第１个预测的实验检验［７Ｊ。脉冲标记实验指的是将某体系极短暂地暴露于放射性同位素而后进行分析。借助于短时间接触同位素的方法，可以标记一个化合物所用的放射性同位素的量。冈崎小组选择了Ｔ４噬菌体ＤＮＡ的复制。大肠杆菌内产生噬菌体ＤＮＡ。在脉冲标记实验中，他掺入激活的营养物中，在Ｔ４噬菌体侵染的大肠杆菌细即在各种各样脉冲长度（２Ｓ，７Ｓ，１５ｓ，３０ｓ，６０Ｓ，１２０

ｓ）中

通过密度梯度离心，测量新合成的ＤＮＡ片段的大小。在超速离心的的试管内密度由顶部向底部递增，可２．１半不连续复制的提出

新生单链ＤＮＡ分子的延伸方向只能是５个困难就能避免。这些模型假设：或者一条链，或者两条

２．２半不连续复制的实验验证

２．２．１脉冲标记实验

他们使用的有机物是Ｔ４噬菌体侵染的大肠杆菌细胞。我们知道噬菌体是由一个蛋白质外壳及其包裹的核酸组成。在噬菌体把自己的ＤＮＡ注人大肠杆菌后，就在们用放射性同位素３Ｈ标记胸苷，而后使３Ｈ标记的胸苷胞与３Ｈ标记的胸苷三磷酸结合达到所要求的时间后，终止这个反应Ｌ８Ｊ８。

对密度仅有轻微差别的大分子混合物加以分层。大分

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子通过密度沉降成带，根据它们的沉降速度差异而被分开。沉降速度用沉降系数ｓ量度，沉降系数ｓ等于在单位离心力场中颗粒沉降的速度，其单位为秒（ｓ）。因为许多生物大分子的ｓ值很小，所以定义１０—１３Ｓ为一个沉降系数单位，用Ｓ表示。在冈崎的实验中，通过碱性蔗糖梯度使样品分层。在离心后，从管的底部收集这些ＤＮＡ片段。在重复沉淀之后，用分光仪计数每种片段中的放射性ＤＮＡ。用测定在大肠杆菌原生质体中的侵染部分，确定噬菌体ＤＮＡ在片段中的分布。用从界面到噬菌体ＤＮＡ带的距离表示沉降距离。

图９表明用Ｔ４噬菌体侵染的大肠杆菌细胞获得的结果。Ｔ４噬菌体在２０℃下侵染大肠杆菌细胞７０ｍｉｎ后，当噬菌体ＤＮＡ正在能动地合成时，用３Ｈ一脱氧胸苷脉冲标记Ｔ４噬菌体侵染的大肠杆菌细胞。在２ｓ脉冲标记之后，在具有９Ｓ沉降系数的ＤＮＡ组分中，几乎恢复了所有这些脉冲标记。在这个探测限度内好像所有的标记都是处在很短的ＤＮＡ片段内，相应的ＤＮＡ片段的长度为１０００～２０００个核苷酸大小，其放射性峰值接近离心管的顶部。随着标计时段的增加，在较快的沉降物质中也找到这种放射性，其放射性峰值更接近管的底部，这是由于新形成的标记的ＤＮＡ小片段连接到标记开始前合成的ＤＮＡ大片段的结果。大约在３０ｓ脉冲标记时在“９Ｓ组分”中的放射性迅速地增加而且达到了最大值，同时在快速沉降组分中的放射性几乎线性地增加，而在两分钟内达到了高于在“９Ｓ组分”的放射性１０倍的水平。快速组分的沉降速率逐渐增加，像在生长的

０Ｉ．．．．．．．．．．．．．．．．１．．．．．．．．．．．．．．．．Ｊ．．．．．．．．．．．．．．．．Ｊ一２０４０６０Ｓ

圈９来自Ｔ４噬菌体侵染的大肠杆菌细胞的脉冲标

记ＤＮＡ的碱性蔗糖梯度沉降

万方数据

自然科学史

细菌细胞中一样。在两分脉冲之后，平均沉降系数大约是４０Ｓ。在其他实验中对于５ｍｉｎ和１０ｍｉｎ脉冲标记ＤＮＡ分别获得了４５ｓ和５０ｓ的平均沉降系数。

实验结果表明在很短的脉冲标记后，在慢的沉降组分中恢复了所有这些标记，这就证实新合成的ＤＮＡ里存在许多短的片段。这些片段称为冈崎片段（Ｏｋｚａｋｉｆｒａｇｍｅｎｔ）。冈崎片段的发现符合两条子代链不连续合成的预测（图８Ｃ或Ｄ），对于半不连续复制模型还没有提供充分的证据。随后冈崎通过证实当ＤＮＡ连接酶被抑制时，这些小的ＤＮＡ片段累积到很高的水平，进一步支持了不连续复制的假设。

２．２．２抑制连接酶导致新生短链积累的实验

为了检验不连续复制假设的第二个预测，他们进行了抑制连接酶导致新生短链积累的实验。１９６８年，冈崎在《美国国家科学院学报》上发表的第二篇论文［９］“ＤＮＡ链生长的机制，Ⅱ．在用缺陷性连接酶Ｔ４噬菌体侵染的大肠杆菌中新合成短链的积累”中指出：“脉冲标记实验支持了ＤＮＡ链不连续复制的假设。按照这一假设在复制点合成短的ＤＮＡ片段，其后通过磷酸二酯键的形成，把这些较早合成的ＤＮＡ片段连接起来。假设这些短链的连接是由多核苷酸连接酶，最近在Ｔ４噬菌体侵染的

大肠杆菌中发现的一种酶完成的。如果用这种机制在体内复制ＤＮＡ。在连接酶功能暂时削弱的条件下，在细胞内将累积这些新合成的短的ＤＮＡ链。”他们把Ｔ４噬菌体的基因３０等同于连接酶的结构基因，即Ｔ４ｔｓＡ８０和Ｔ４ｔｓＢ２０。用基因３０（ｔｓＡ８０，ｔｓＢ２０）的Ｔ４噬菌体突变型侵染的细胞，在温度从２０℃变动到４３℃后１ｒａｉｎ，开始脉冲标记，检验了这个预测。他们在文中描述了在图１０中表示的实验。他们写道：“在温度从２０℃变动到

到管ｕ的相对距离

到管门的相对距离

Ｉ．．．．．．．．．．．．－．．．．．．．．．．．．－．．．．．．．．＿Ｌ

１．．．．．．．．．．．．Ｉ．．．．．．．．．．．ＪＬ．．．．．．．．上

０２０

４０６００

２０

４０

６０Ｓ

图１０

Ｔ４噬菌体突变型侵染细胞时．在升温后脉冲标记ＤＮＡ的碱性蔗糖梯度沉降

・２３３・

ＨｉｓｔｏｒｙｏｆＮａｔｕｒａｌＳｃｉｅｎｃｅ

４３℃之后，当用Ｈ３－胸苷脉冲标记的Ｔ４ｔｓＡ８０或Ｔ４ｔｓＢ２０侵染细胞时，实际上在１０ｓ或２０Ｓ脉冲之后在具有大约９Ｓ平均沉降率的ＤＮＡ短链中发现了所有的放射性都结合到ＤＮＡ。随着脉冲时间增加到３０

ｓ，４０

Ｓ

或６０Ｓ，在平均沉降率为５～２０Ｓ区域内的标记继续增加，少量的放射性出现在沉降速率超过３５Ｓ的物质中。于是，好像是在这些条件下产生了ＤＮＡ短链，但是它们的连接几乎完全被抑制了。根据标记ＤＮＡ的沉降系数的缓慢增加，提出存在一些连接反应。这可能是由于噬菌体连接酶剩余的活性或者是由于具有较低活性的非热敏的连接酶的作用。”

实验证明了这个假设的第二个预测，用基因３０（ｔｓＡ８０，ｔｓＢ２０）的突变型侵染的细胞，它的多核苷酸连接酶是热敏的，在温度较高时累积了大量新合成的ＤＮＡ短链。在温度较低时用突变型Ｔ４噬菌体也不能发现短链明显的累积。然而用短的脉冲标记总是显示出新生短链的小量存在。在用一种突变体（ｔｓＢ２０）侵染的细胞中，在温度较高时累积的短链，在继续使这些细胞保持在较低温度时能够转变成大分子。另一方面在低温时合成的这些放射性ＤＮＡ长链的沉降系数在继续保持在较高温度时只有一点降低。这些结果对ＤＮＡ链不连续生长给予进一步支持，对多核苷酸连接酶连接新合成的短链提供了证据。最后冈崎在结束语中作出结论说：“在活性噬菌体ＤＮＡ合成的过程中，当把用基因３０（连接酶）的对温度敏感的Ｔ４突变体侵染的细胞升温到４３～４４℃时，累积了大量新合成的ＤＮＡ短链，这些短链与通常在小量中发现的短链具有类似的性质。这一事实支持了这个假设：在体内ＤＮＡ链按照包含短链的合成和连接的不连续机制生长，而短链的连接是由多核苷酸连接酶完成的。”

这些短链就是众所周知的冈崎片段，具有不连续模型所预测的性质；也就是说，它们起始是短的，后来与先前合成的ＤＮＡ连接而变长。然而，由模型预测应该只有一半的放射性存在于小片段中，而实验数据表明，所有新合成的ＤＮＡ都是由片段组成的。这一结果令人惊讶，因为没有理由说明为什么从模板３７一ＯＨ端薪合成的ＤＮＡ会不连续地合成。答案只能是这条链是连续合成的，在合成后才断裂成片段的。下面将从实验上揭示出现这一现象的根源。

２．２．３探测尿嘧啶片段的实验

实验研究表明，在大肠杆菌的细胞内，存在脱氧尿苷三磷酸（ｄＵＴＰ）和脱氧胸苷三磷酸（ｄＴＴＰ）两种类似物。其比例大约为１：３００。ＤＮＡ聚合酶Ⅲ又不能把

ｄＵＴＰ和ｄＴＴＰ区别开来，因为它们同样能和腺嘌呤形

・２３４・

万方数据

Ｃｈｉｎｅｓｅ

ＪｏｕｒｎａｌｏｆＮａｔｕｒｅ

Ｖ０１．３２Ｎｏ．４

成氢键。因此，某些ｄＵＴＰ掺入到ＤＮＡ中形成Ａ・Ｕ配对，ｄＵＭＰ（脱氧尿苷单磷酸）聚合到ＤＮＡ分子中。为了减少这种掺入，大肠杆菌具备了脱氧尿苷三磷酸酶（ｄＵＴＰａｓｅ），它能把ｄＵＴＰ水解成ｄＵＭＰ和ＰＰｉ（无机焦磷酸），从而避免了ｄＵＴＰ作为底物而掺入ＤＮＡ分子中［１０］。但是ｄＵＴＰａｓｅ的作用不十分彻底，某些ｄＵＴＰ仍然存在，并被掺入到ＤＮＡ。

胞嘧啶能脱氨形成尿嘧啶。脱氨作用是一种后果严重的变化，因为脱氨后的产物尿嘧啶和腺嘌呤配对，而不是和鸟嘌呤配对，这样在新复制的ＤＮＡ链中会出现腺嘌呤而不是鸟嘌呤。细胞内存在一种切除修复循环系统（图１１），能够把ＤＮＡ中的尿嘧啶除去，代之以胞嘧啶。第一步通过尿嘧啶一Ｎ一糖苷酶（ｕｒａｃｉｌＮ．ｇｌｙ－ｃｏｓｙｌａｓｅ）剪切Ｎ一糖苷键，除去尿嘧啶，把脱氧核糖留在骨架上，形成一个无嘌呤或嘧啶的位点。第二步是通过ＡＰ内切核酸酶（ＡＰｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ），剪切紧靠无嘌呤嘧啶部位的磷酸二酯键，切出一个切口，游离出脱氧核糖的一端，接着由第二个ＡＰ内切核酸酶作用在无嘌呤部位的另一边，除去脱氧核糖。然后通过聚合酶Ｉ以正确的核苷酸填入缺１３，完成切除修复过程［…１

ｔ２］。

ＡＧＴＧＡＣＴＴＡＧ

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ＡＧｌＢＡＣｌ’ＴＡＧＴＣＡＴＧＡＡｌ℃

尿嘧啶一Ｎ

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ＴＣＡ一／ＡＰ内切核酸酶

－＿一●－＿＿＿＿一

一

ＴＧＭＫ一

／

圈１ｌ去除掺人ＤＮＡ的尿嘧啶的修复图解

尿嘧啶一Ｎ一糖苷酶不能区别由胞嘧啶脱氨引起的尿嘧啶和由ｄＵＴＰ掺入到ＤＮＡ中的尿嘧啶。因此，每当掺入ｄＵＴＰ分子时，尿嘧啶一Ｎ一糖苷酶就会起作用。按照尿嘧啶一Ｎ一糖苷酶的活性，被这种酶作用以后的修复步骤是相当缓慢的。所以，在除去了尿嘧啶以后，磷酸二酯键能够在碱中被水解。于是，所有新合成的ＤＮＡ会以片段出现。这种片段称为尿嘧啶片段（或ｄＵＭＰ片段）。于是，这个过程确认不论它是连续地合成还是不连续地合成，复制的ＤＮＡ会包含一定分量的短的ＤＮＡ片段。问题在于实验中观察到的短的片段，哪些部分属于不连续复制的片段，哪些部分又属于错误结合的ｄＵＭＰ片段？

为了回答这个问题，冈崎和他的同事使用一种有缺失的ｄＵＴＰ酶，其基因突变型是ｄｕｔ一，另一种是有缺失

自然杂志第３２卷第４期

ＵＳＡ，１９６８，５９：５９８—６０５．

自然科学史

ＡｃａｄＳｃｉ

的尿嘧啶～Ｎ一糖苷酶，其基因突变型是ｕｎｇ一。实验结果表明：在ｄｕｔ一的突变体中，由于ｄＵＴＰ未被水解，ｄＵＭＰ掺入的概率增加，ｄＵＭＰ片段变短。在ｕｎｇ一的突变体中，由于这种突变体缺乏切除尿嘧啶的能力，所以不形成片段。然而，在这些细胞中新标记的ＤＮＡ大约５０％仍然以短的片段出现。这是我们预期的半不连续复制。而且一些无细胞的复制系统基本上没有尿嘧啶一Ｎ～糖苷酶，它们也显示出：新标记的ＤＮＡ大约５０％是冈崎片段。于是ＤＮＡ复制真的表现为半不连续复制：一条链连续地复制，另一条链不连续地复制［１３］。

事实上，连续复制链的３＂－ＯＨ末端常常处在不连续链的前沿，因此用了前导链（１ｅａｄｉｎｇｓｔｒａｎｄ）和后随链（１ａｇ—

ｇｉｎｇｓｔｒａｎｄ）这两个术语分别表示连续复制链和不连续复

［８］郑用链．基础分子生物学Ｉ－Ｍ］．北京：高等教育出版社，２００７：

９３—９６．

［９］ＳＵＧｌＭｏＴＯＫ，ｏＫＡＺＡＫｌＴ，ｏＫＡｚＡＫＩＲ．Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｏｆ

ＤＮＡ

ｓｈｏｒｔ

ｃｈａｉｎ

ｇｒｏｗｔｈ，１１．ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎＥ．ｃｏｉｌ

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ｏｆ

ｎｅｗｌｙｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｄ

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ｌｉｇａｓｅ－ｄｅｆｅｃｔｉｖｅｐｈａｇｅｓ

［Ｊ］．Ｐｒｏｃ［１０］ＴＹＥ

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ＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉＵＳＡ，１９６８，６０；１３５６．１３６２．

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ｏｆ

ａ１．Ｔｒａｎｓｉｅｎｔａｃｃｕ・

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制链。前导链按５７—３７的延伸方向合成新生单链ＤＮＡ分子，是朝向复制叉的，随着复制叉的展开而连续延伸；后随链的延伸方向是背向复制叉的，以与复制叉逆行的方式不连续地合成短的片段，而后再连接成长链。

（２０１０年４月１日收到）

ＰｒｏｐｏｓｉｔｉｏｎａｎｄＥｓｔａｂｌｉｓｈｍｅｎｔｏｆＤＮＡＳｅｍｉｃｏｎｓｅｒｖａ・ｆｉｖｅ

Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ

ａｎｄ

ＳｅｍｉｄｉｓｃｏｎｔｉｎｕｏｎｓＲｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ

Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，ＢｅＯｉｎｇ

ＸＩＡＮＧＹｉ．ｈｅＰｒｏｆｅｓｓｏｒ・Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆ

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ＤＮＡ

ｗａｓ

ｉｎ－

［３］ＦＲＵＴＯＮ

Ｊ

Ｓ．蛋白质，酶和基因一化学与生物学的交互作用

ｃａｔｉｏｎ。ａｎｄ

ｉｔｓ

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Ｓｔａｈｌ．Ｏｋｚａｋｉ

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ｐｒｏｐｏｓｅｄ

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ｒｉｃｈｉａ

ｅｖｉｄｅｎｃｅ

ｇｉｙｅｎ

Ｍｅｓｅｌｓｏｎ

ａｎｄ

ａｎｄ

ｐｒｏｐｏｓｅｄ

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ｏｎ

ｗｏｒｄｓｓｅｍｉｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｖｅ

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Ｋ，ｅｔａ１．Ｃｏｌｄ

ｓｐｒｉｎｇ

ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ

ｂｉｏｌｏｇｙ［Ｊ］．Ｐｒｏｃ

Ｋ，ｅｔ

ＮａｔｉＡｃａｄ

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ＤＮＡｃｈａｉｎｇｒｏｗｔｈ，Ｉ．ｐｏｓｓｉｂｌｅ

ｏｎｄａｒｙｓｔｒｕｃｔｕｒｅ

ｏｆ

ａ１．Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｏｆ

ｓｅｃ－

ｄｉｓｃｏｎｔｉｎｕｉｔｙａｎｄｕｎｕｓｕａｌ

ｎｅｗｌｙｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｄ

ｃｈａｉｎｓＥＪ］．ＰｒｏｃＮａｔｌ

（责任编辑：温文）

ｄｏｉ：１０．３９６９／ｊ．ｉｓｓｎ

０２５３－９６０８．２０１０．０４．０１４

密残核——可能真的由奇异物质组成。

如果两个这样的中子星碰撞，少许被称为小奇块（ｓｔｒａｎｇｅｌｅｔ）的奇异物质有可能从

同类型的探测器：月球。它没有折射带电粒子的磁场，因此任何到达的小奇块将撞击表面、停止下来嵌入月球体内。

Ｓａｎｄｗｅｉｓｓ小组取了Ａｐｏｌｌｏ登月带回来的１５ｇ月球土壤并将这蝗颗粒通过一强磁铁使其加速。任何小奇块在磁场中路径的弯折度应小于普通物质在同一磁场中路径的弯折度。但什么也没有发现。Ｓａｎｄｗｅｉｓｓ说。“若ＡＭＳ－０１的发现是真实的，利用月壤也应发现该事件。此问题当２０１０年将ＡＭＳ－０２置于国际空间站进行飞行实验时有可能获得答案”。

［许呆呆据ＮｅｗＳｃｉｅｎｔｉｓｔ，２００９－０８－２９３

探测小奇块

粒子物理学标准模型描述了６种夸克（ｑｕａｒｋ）。然而，我们周围的物质只包含有组成质子和中子的上、下两种夸克。物理学家们曾长时间地从理论上探讨奇异物质，认为这样的物质应含有奇异夸克

（ｓｔｒａｎｇｅ

中子星喷吐出来。美国耶鲁大学的物理学家ＪａｃｋＳａｎｄｗｅｉｓｓ说，“若此猜测为真，将会发现漂浮在空间的奇异物质”。

搭载在发现号航天飞机上的ｇｔ磁谱

仪（ＡＭＳ－０１）好像已探测到了小奇块——

一个类似于氧的原子核但其质量是氧核的３倍。因哥伦比亚号航天飞机失事，延误了计划中的较先进的磁谱仪ＡＭＳ－０２的升空。ＡＭＳ－０１所测结果目前难于确认。Ｓａｎｄｗｅｉｓｓ转而运用一个几乎完全不

ｑｕａｒｋ），奇异物质比普通物质量

重、密度也大．因为奇异夸克的质量大约是上或下夸克的１０倍。

某些中子星——超新星爆发后的致

・２３５・

万方数据

DNA半保留复制和半不连续复制的提出与确立

作者：作者单位：刊名：英文刊名：年，卷(期)：

向义和， XIANG Yi-he

清华大学物理系,北京,100084自然杂志

CHINESE JOURNAL OF NATURE2010,32(4)

参考文献(13条)

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本文链接：http://d.g.wanfangdata.com.cn/Periodical_zrzz201004009.aspx