真菌荧光原位杂交技术-w
真菌荧光原位杂交技术-吴松松
第一步:荧光探针标记。
1, 利用已知的特异序列送公司合成探针。各种情况的探针均适合,
2, 切口平移法。用DNA polymerase I和DNase I。适合较大的片段,一般>7kb,1kb的片段效果较差。
①1×DNA polymerase Ⅰbuffer(1×) 5 μl ②dNTP(10μM) 5 μl
③Bio-11-dUTP or Dig-11-dUTP(1mM) 1.2 μl ④DNase Ⅰ (0.005U/μl) 1μl ⑤DNA polymerase Ⅰ (coli.10U/μ)
1.2μl
⑥DNA(2.5μg) Xμl
⑦ddH2O 36.6-Xμl ⑧Total 50μl 混匀后置于原位PCR或者于水浴锅中15℃4h,然后利用1%的琼脂糖凝胶检测片段大小,在100-500bp左右表示酶切完全,此时可停止反应。
另有FISH Tag DNA Multicolor Kit中也是切口平移法,但探针标记时需结合荧光染料,步骤比较复杂。
3, 随机引物法。用随机引物合成探针,此种方法适合cDNA片段为500~1000bp的片段。
①500ngDNA X μl
②2.5X Random Primers Solution: 20 μl ③10X dNTP Mixture: 5 μl
④ddH2O 24-Xμl
⑤Klenow Fragment 1 μl
1.冰上操作:cDNA大约500 ng DNA(5-20 μl)的离心管中加入20 μl 2.5X Random PrimersSolution.于沸水中变性5min,立即放于冰上
2. 将融化的10X dNTP Mixture及ddH2O提前放于冰上并依次加入,轻轻混匀。
3. 加入 1 μl Klenow Fragmen轻轻混匀(剧烈震荡酶易失活),并低速离心30sce。
4.37℃孵育60min后加入5 μl Stop Buffer。
5.无水乙醇或异丙醇沉淀(加核酸助沉剂),75%乙醇清洗沉淀并用50μl DEPC-H2O溶解。
6.电泳检测探针质量。片段集中在250~500bp质量较好,可用于原位杂交。
第二步:样品的处理。
1, PDB摇培3~5d的菌丝或者收集的真菌孢子分别用DEPC--H2O和1×PBS清洗一次,8000rpm离心。
2, CSK Buffer处理。加入CSK Buffer(0.5%TritonX-100,,10 mM VRC或RRI)于4℃处理10~12min。
第三步:样品的酶解与固定。
1, 用4%的多聚甲醛浸泡,于4℃暗处理1-4h。
2, 挑取菌丝或吸取孢子均匀涂与PE玻片上,风干使样品固定于玻片上。 3, 用DEPC-treated水洗两次,风干。
用1×PBS渗透缓冲液覆盖(1%SDS,1% 裂解酶,0.1% 蜗牛酶),30°C ,10min
(实验中发现如果30min,菌丝降解的比较严重,因此可能应该减少酶解时间,15min),用DEPC处理的水冲洗,晾干。然后用50%,80%和100%的乙醇进行脱水处理,每次5min。(参考文献:Alpine Stream by New
Taxon-Specific In Situ Detection of Freshwater Fungi) .
第四步:杂交
1, 杂交液准备。2×hybridization buffer:4×SSC,40%硫酸葡聚糖,2mg/ml BSA,50%甲酰胺。将探针于95~98℃变性5min后立即冰浴3min,以探针终浓度为0.56~5ng/μl的浓度加入冰上预冷的杂交缓冲液中。探针浓度可以降低到2.5ng/ul(经过实验,该浓度的探针还是高,不过没有检测探针的质量,可以先检测探针的质量,200-500bp)。
2, 50μl体积 1片 2片 4片 8片
①100%去离子甲酰胺 25 μl 50μl 100μl 200μl ②20×SSC 5 μl 10μl 20μl 40μl ③5%BSA(SS) 0.5μl 1 μl 2 μl 4μl
④10×SDS 2.5 μl 5 μl 10μl 20μl ⑤50%硫酸葡聚糖 10 μl 20μl 40μl 80μl 混匀,离心,然后加入
3, ⑥Bio-11-dUTP标记的探针 50-100ng/片 10μl 20μl 4, ⑦Dig-11-dUTP标记的探针 50-100ng/片 10μl 20μl 5,
6, 杂交。每玻片100~150μl杂交液滴加于样品上,盖膜与46℃暗盒(底部加入浸有2×SSC的吸水纸)中孵育过夜(16~20h)。
第五步:杂交后洗脱。
1, 用2×SSC配制50%的甲酰胺溶液,42℃水浴预热,同时预热两份2×SSC溶液,预热20min以上。
2, 把玻片从湿盒中拿出,于2×SSC揭膜。
3, 于预热的甲酰胺中,42℃摇床摇10min,转入预热的2×SSC中摇两次,每
次5 min。
第六步:标抗及结合链霉亲和素。
1, 地高辛标抗。
①室温的2×SSC摇一次,5 min。
②4×SSC/Tween 20(0.2%)摇一次,5 min,(配制:1L 4×SSC加Tween 2ml)。
③每片加新鲜的5%BSA(4片配制:0.1gBSA + 2ml1×PBS)100μl盖膜,室温放置5 min,直接用镊子揭去盖膜。(以后每步避光)
④配制anti-dig FITC溶液(用5%BSA稀释75倍),每片加100μl,盖膜后湿盒中37℃温育1h。
⑤4×SSC/Tween 20(0.2%)摇洗3次,每次5min,1×PBS缓冲液中洗1次5 min。
2, 生物素结合链霉亲和素。
①1×PBS漂洗一次,5min。
②5%的BSA100μl每片,盖膜,室温放置5min, 揭膜。
③用1:40配置Cy3耦联的链亲和素。每片50μl,盖膜,湿盒37度温育30 min
④1×PBS洗三次,每次5 min
第七步:DAPI负染与荧光信号检测
1,5μg/ml的DAPI每片100μl。
7, 盖膜室温放置15 min,1×PBS揭膜。
8, 每片加抗荧光猝灭剂一滴(10μl枪)。
3, 用干净的盖片盖好,于荧光显微镜下检测。
4℃避光保存,完想保留玻片时:2×SSC 摇10min,70%乙醇摇3min,100%乙
醇摇3min,空气干燥。
所需试剂准备
20×SSC:0.3M sodium citrate, 3M NaCl(pH 7.0) CSK Buffer:100 mMNaCl, 300 mM sucrose,3 mM MgCl2,10 mM PIPES (pH 6.8)Store at 4°C. 1×PBS:NaCl 137mM,KCl 2.7mM,Na2HPO4 10mM, KH2PO4 2mM(pH7.2~
7.4)
4%多聚甲醛:2g多聚甲醛加入30ml1×PBS中,60℃加热10min后加入少量0.1M NaOH摇匀至多聚甲醛完全溶解后1×PBS定容至50ml。
10ml:0.4g多聚甲醛 加7ml水,加40ul 5M NaOH,在定容至10ml 注意事项
1、做RNA FISH实验,首先要防止RNA酶的污染。操作过程中应自始至终佩戴抛弃式橡胶或乳胶手套,并经常更换。所有实验用到玻璃制品都要高温灭菌,且各种溶液要用DEPC水配制。
2、去污剂triton X-100处理的目的是增加细胞的通透性,利于杂交探针进入细胞,其处理时间因应不同的细胞而有所不同。注意:过度的去污剂处可能会引起靶核酸的丢失。
3、荧光见光就会淬灭,因此操作过程要做好避光。
4、实验所用探针是双链DNA探针,而杂交反应进行时,探针和靶核酸都必须是单链的。因此在做RNA FISH杂交前,探针必须进行变性。探针变性后要立即进行杂交反应,不然解链的探针又会重新复性。
5、探针的浓度因其种类和实验要求而有所不同,一般为0.5-5ng/ul。合适的探针浓度要通过实验才能确定。
6、杂交反应时,盖玻片不可有气泡,不然妨碍探针与细胞的接触。
7、玻片经antifade reagent封片后可在4℃暗处保存2-3星期而不失去
全部荧光,但FISH操作完成后要及时观察采图,地高辛标记的隔夜观察效果较好。
8、如果镜检时,观察到有非特异结合造成的高背景。可能原因有:不合适的探针量,不适合的杂交后洗涤,又或者是样本中有过多的重复序列。解决方法:1)使用合适的探针量;2)改善杂交后的洗涤,如洗涤液要新鲜配制,增加洗涤液的量,延长洗涤时间等;3)使用DNA阻断剂,在探针中加入一定量的DNA竞争性阻断剂如COT-1 DNA或鲑精DNA来竞争性结合基因组中重复性片段。