丝状真菌产凝乳酶生物特性的研究

　　摘 要：微小毛霉var Linta。是最早发现的产凝乳酶丝状真菌，且其蛋白酶活力较低；米黑毛霉NR RL3420高产凝乳酶菌株在1971年也被报道，随后人们还发现黑曲霉等菌株产蛋白酶也有凝乳酶的性质。由于利用丝状真菌生产凝乳酶具有C/P值（凝乳酶活力/蛋白酶活力）高且不易受杂菌污染等优势，因此本章对丝状真菌在。0-5天发酵周期中各因素的动态特性进行研究，做了系统的比较试验。探讨不同发酵时间下菌株种类、生物量、发酵液蛋白含量、发酵液pH值以及凝乳酶活和C/P值的变化规律。

　　关键词：真菌；酶；温度

　　中图分类号：Q81 文献标识码：A

　　一、材料与方法

　　1.1菌株

　　（1）两株微小毛霉（Mucor Pusillus）菌购买自中国普通微生物菌种保藏中心，编号分别为CGMCC 3.3445 和CGMCC 3.204；

　　（2）米黑毛霉（Mucor miehei）ATCC 16457；

　　1.2试剂

　　脱脂奶粉为新西兰进口；考马斯亮蓝、福林-酚以及牛血清蛋白（BSA）试剂购自Sigma；葡萄糖、蛋白陈、琼脂、蔗糖等试剂均为生化纯或分析纯。

　　1.3培养基

　　（1）PDA固体培养基：称取去皮的马铃薯200 g并切成块状，1000mL沸水煮30 min后过滤滤渣；保存过滤液定容至1L后，趁热加入20 g蔗糖，搅拌均匀至全部溶解，分装到250 mL锥形瓶中，每瓶加入量不超过100 mL；慢慢加入20g琼脂，迅速搅拌使其溶解，并继续加热至溶液澄清，115℃灭菌30 min；在紫外超净工作台中，按无菌操作方法趁热倒平板（或斜面），冷却凝固后接种或放入4℃冰箱保藏待用。

　　（2）沙氏固体培养基（种子培养基）：葡萄糖4%，蛋白陈1% ，琼脂2%。

　　（3）发酵培养基：配置各成分浓度分别为蔗糖50 g・L-1、玉米浆40 g・L-1、胰蛋白陈0.5 g・L-1、Na2HPO4-12H2O4 g・L-1、Na2CO3 1 g・L-1以及CaC12 1 g・L-1，每250 mL锥形瓶中装液量为50 mL，自然pH；115℃灭菌30 min待用。

　　1.4菌株的活化及发酵培养

　　（1）菌株的活化：取保存在4℃的PDA斜面菌株，无菌条件下，划线接种到新鲜沙氏斜面培养基上，28℃恒温培养2天。

　　（2）发酵培养：挑取两环已活化的孢子在发酵培养基中，28℃，160 rpm摇瓶培养5天，分别测定菌株的生物量、发酵液的pH、蛋白含量、凝乳酶活力以及蛋白酶活力，每隔24h记录一次。

　　二、结果与讨论

　　2.1低浓度BSA标准曲线的绘制

　　用Bradford法测定发酵粗酶液蛋白含量。

　　由低浓度标准曲线得到蛋白含量计算公式：y=144.85x........................（式2-1）

　　R2为0.9917

　　其中y-蛋白含量（μg/mL） ；

　　X-595nm下吸光度值。

　　2.2发酵液pH与凝乳酶活力的变化

　　产凝乳酶活力大小顺序为米黑毛霉ATCC 16457（21 SU/mL）>微小毛霉CGMCC 3.3445 （12 SU/mL）>微小毛霉CGMCC 3.204（11.7 SU/mL）。由于米黑毛霉产凝乳酶活力明显偏高，确定作为生产菌株进行进一步研究。

　　发酵周期，发酵液的pH值呈不断下降的趋势，之后趋十稳定。其中微小毛霉CGMCC 3.3445发酵72 h后pH稳定在4左右，米黑毛霉最终pH为2.5，微小毛霉为CGMCC 3.204为3.3。

　　2.3不同菌株凝乳酶合成曲线

　　不同丝状菌株凝乳酶合成模式相同，为滞后合成型。凝乳酶合成时间为菌株生长处于平衡期后，到生物量趋十稳定后一段时间。其中，微小毛霉CGMCC 3.204滞后期达到72 h，其他两种菌株均为48 h左右后凝乳酶开始合成。

　　凝乳酶的滞后合成说明丝状真菌产凝乳酶受阻遏物影响较大，当生长代谢处十平衡期，阻遏物被分解代谢完全，凝乳酶才开始合成。

　　2.4发酵过程蛋白含量的变化

　　不同菌株产蛋白含量随时间变化差异较大，其中米黑毛霉蛋白含量较高，两株微小毛霉胞外蛋白含量较低。发酵120 h，米黑毛霉蛋白含量为0.05 g/L，凝乳酶活力为166 SU/mL；微小毛霉CGMCC 3.3445为0.02 g/L，凝乳酶活力为12 SU/mL；说明凝乳酶活力随蛋白含量的升高而升高，可能当生物量趋十稳定后，凝乳酶活力和胞外蛋白含量成正比。

　　米黑毛霉的粗发酵酶液蛋白含量随时间变化较大，发酵 48-96 h，发酵液蛋白含量显著升高，96 h后随着蛋白含量的显著下降，发酵液凝乳酶活性也显著下降，可能是受pH影响，导致蛋白不稳定而降解，使胞外蛋白含量和凝乳酶活性都急剧降低。

　　结语

　　（1）利用三株丝状真菌米黑毛霉（M.miehei）ATCC 16457，微小毛霉（M. pusillus）CGMCC 3.3445，微小毛霉（M. pusillus）CGMCC 3.204发酵，凝乳酶均为滞后合成型。摇瓶发酵凝乳酶主要合成时间在发酵48-96 h。

　　（2）丝状真菌产凝乳酶活力大小顺序为米黑毛霉ATCC 16457最高，发酵96 h，凝乳酶活力达到21 SU/mL；确定米黑毛霉ATCC 16457作为下一步诱变育种的菌株。

　　参考文献

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