组织灌流固定技术
动物灌注固定
一、准备
1、手术器械一套(可不高压消毒)、针头
2、试剂瓶三个,烧杯一个,漏斗、磁力搅拌子一个
3、所有进入老鼠体内的液体都要过滤
二、方法
1、提前配制4%多聚甲醛(称量4g ,放置于100ml 0.1M PB 中,55度加热搅拌至充分溶解,搅拌子速度从低到高,慢慢增加,滤纸过滤,4度保存)、温生理盐水或PBS (滤纸过滤,40ml/只或快速滴5min ,流出液变白即可,盐水过多细胞死亡多);
2、装好多聚甲醛、温生理盐水吊瓶,排空气泡,确保一定液体压力。10%水合氯醛麻醉(20g 小鼠约0.2ml ;大鼠:10% 0.3ml/100g ; 4% 1ml/100g; 7% 0.5ml/100g),反向固定好老鼠;
3、沿腹腔打开老鼠的胸腔,充分显露心脏(插针)和肝脏(判断),尽可能多暴露心脏,利于操作,进液。
4、找到鼠心尖,用止血钳(选把好的很关键)预夹住心尖少部,持针从心尖略偏左下进,插入有突破感即停(小鼠室壁厚约1mm ),打开生理盐水的输液器。
大鼠直接进到主动脉内。
5、若正确进入,右房充盈,剪破右房,此时液体较快下滴(调整针头朝向),红色血液从右房流出,快速冲尽全身血液(否则影响免疫反应),时间约4-5min ,40ml/只小鼠,80ml/只大鼠。(取水冲洗切口,防血液凝固)
正确进入指标:
右房充盈(但不是迅速充盈-此示针进右房),肝脏逐渐变白,口鼻干燥
4、换4%多聚甲醛灌注30min 左右。多聚甲醛要偏快。100ml/只小鼠,200ml/只大鼠 用灌注机:先排空管中空气,再行灌注
灌注正确标准:
换多聚甲醛后身体反应,尤其尾巴竖起、四肢伸直变硬。
5、取脑组织,正确脑变白,无红色血管。继续后固定12h ,沉糖切片。如不立即切片,可保存高压灭菌PB 中。
注意:
1、心脏很脆,尽量一次成功,不要反复卡紧——松开,心脏破了就失败了。
2、进针偏右,进到右室:肺水肿;
进针太深,进到左房:左房大,肺水肿
取材:
一、 准备:
1、提取蛋白:碾磨器、EP 管、培养皿、细胞裂解液、蛋白酶抑制剂、组织冻存
管(高压,标记)、一次性手套、口罩、冰盆
2、提取核酸:见前面
二、方法:
3、鼠内脏:心、肝、脾、胰腺、肾、肾上腺、睾丸-卵巢(雌鼠Y 形上端;雄
鼠Y 形下方)、胸腺、膀胱
4、鼠脑:皮质、海马、纹状体、小脑、下丘脑、垂体、脑室周围区、脊髓 一半全脑