分子实验报告

分子生物学基础实验报告

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姓名：贺选

班级：生信基地1101

学号：U201112592

2013-9-3

分子生物学基础实验

分子生物学实验技术已成为生物化学及分子生物学以及相关学科院系教学科研不可缺少的一部分。为提高学生在分子生物学技术方面的动手能力，生物技术综合实验室主要开设常用而基本的分子生物学实验技术。它的内容包括质粒DNA 的制备；DNA 的重组；PCR 基因扩增等等。

实验一 质粒DNA 的小量制备

一、实验原理

要把一个有用的外源基因通过基因工程手段，送进细胞中去进行繁殖和表达，需要运载工具，携带外源基因进入受体细胞的这种工具就叫载体（vector ）。载体的设计和应用是DNA 体外重组的重要条件。作为基因工程的载体必须具备下列条件:(1)是一个复制子，载体有复制点才能使与它结合的外源基因复制繁殖；（2）载体在受体细胞中能大量增殖，只有高复制率才能使外源基因在受体细胞中大量扩增；（3）载体DNA 链上有1到几个限制性内切酶的单一识别与切割位点，便于外源基因的插入；（4）载体具有选择性的遗传标记，如有抗四环素基因（Tc r ），抗新霉素基因（Ne r ）等，以此知道它是否已进入受体细胞，也可根据这个标记将受体细胞从其他细胞中分离筛选出来。细菌质粒具备上述条件，它是基因工程中常用的载体之一。

质粒（plasmid ）是一种染色体外的稳定遗传因子，大小在1～120kb 之间，具有双链闭合环状结构的DNA 分子，主要发现于细菌、放线菌和真菌细胞中。质粒具有自主复制和转录能力，能使子代细胞保持它们恒定的拷贝数，可表达它携带的遗传信息。它可独立游离在细胞质内，也可以整合到细菌染色体中，它离开宿主的细胞就不能存活，而它控制的许多生物学功能也是对宿主细胞的补偿。

质粒在细胞内的复制，一般分为两种类型：严密控制型（stringent control）和松弛控制型（relaxed control ）。前者只在细胞周期的一定阶段进行复制，染色体不复制时，它也不复制。每个细胞内只含有1个或几个质粒分子。后者的质粒在整个细胞周期中随时复制，在细胞里，它有许多拷贝，一般在20个以上。通常大的质粒如F 因子等，拷贝数较少，复制受到严格控制。小的质粒，如ColE Ⅰ质粒（含有产生大肠杆菌素E1基因），拷贝数较多，复制不受严格控制。在使用蛋白质合成抑制剂－氯霉素时，染色体DNA 复制受阻，而松弛型ColE Ⅰ质粒继续复制12－16h ，由原来20多个拷贝可扩增至1000－3000个拷贝，此时质粒DNA 占总DNA 的含量由原来的2％增加到40％－50％。本实验分离提纯化的质粒pBR322、pUC19就是由ColE Ⅰ衍生的质粒。

所有分离质粒DNA 的方法都包括三个基本步骤:培养细菌使质粒扩增；收集和裂解细菌；分离和纯化质粒DNA 。采用溶菌酶可破坏菌体细胞壁，十二烷基硫酸钠（SDS ）可使细胞壁解，经溶菌酶和阴离子去污剂（SDS ）处理后，细菌染色体DNA 缠绕附着在细胞壁碎片上，离心时易被沉淀出来，而质粒DNA 则留在清液中。用乙醇沉淀、洗涤，可得到质粒DNA 。

质粒DNA 的相对分子量一般在106－107范围内，如质粒pBR322的相对分子质量为2.8×106，质粒pUC19的相对分子质量为1.7×106。在细胞内，共价闭环DNA （covalently closed circular DNA ，简称cccDNA ）常以超螺旋形式存在。如果两条链中有一条链发生一处或多处断裂，分子就能旋转而消除链的张力，这种松弛型的分子叫做开环DNA （open circular DNA ，简称ocDNA ）。在电泳时，同一质粒如以cccDNA 形式存在，它比其开环和线状DNA 的泳动速度快，因此在本实验中，自制质粒DNA 在电泳凝胶中呈现3条区带。

二、实验目的

1．掌握最常用的提取质粒DNA 的方法和检测方法。

2．了解制备原理及各种试剂的作用。

三、实验材料和试剂

材料：大肠杆菌E.coli ，含pET-28质粒。

试剂：

1. LB 培养基：10g/L胰蛋白胨，5g/L酵母提取物，10g/L NaCl，用NaOH 调pH 至7.3左右。如

固体培养基则添加15g/L琼脂。

2. 溶液Ⅰ（pH8.0G.E.T 缓冲液）：50 mmol/L葡萄糖，25mmol/LTris-HCl，10mmol/L EDTA。

灭菌后存放。

3. 溶液Ⅱ（0.2mol/LNaOH(内含1％SDS) ）：预先配制1％SDS 母液，临用前一天晚上加入

0.2mol/LNaOH，4℃保存。（不要SDS 和NaOH 一起配，这样4℃条件下SDS 会析出使溶液浑浊）

4. 溶液Ⅲ（pH4.8乙酸钾溶液）：5mol/L乙酸钾60mL 、冰乙酸11.5mL 、双蒸馏水28.5mL 。（冰

乙酸要在通风橱里面加，配好后要严格测定其pH 值）

5. 酚/氯仿液(V/V＝1/1)：酚为重蒸酚，配制时，先将氯仿中加入异戊醇，使其体积比为24:1，然后

等量的加入重蒸酚，混匀，并用0.1mol/LTris-HCl (pH7.6)抽提几次以平衡这一混合物，于棕色瓶中存放，并在上面覆盖等体积的0.01 mol/LTris-HCl(pH7.6)，4℃保存。（配制酚/氯仿时要小心，不要洒出来，也不要溅到手上，用过的枪头要迅速的换掉，避免污染。取用时，要取下层！）

6. 无水乙醇

7. 70％乙醇

8. pH8.0 TE缓冲液：10mmol/LTris-HCl、1mmol/LEDTA，其中含RNA 酶20μg/mL 。 仪器：

恒温培养箱、恒温摇床、超净工作台、高压蒸汽灭菌锅、台式高速离心机、台式小型振荡器、EP 管(1.5mL微量离心管) 、加样器(20uL～lmL) 、吸头。

关于微量移液器的操作：

1) 将微量移液器按钮轻轻压至第一停靠点；

2) 垂直握持微量移液器，将吸嘴浸入液面下几毫米，不要插入到液体底部；

3) 缓慢，平稳的松开控制按钮，吸上样液。千万不要松的太快；

4) 等一秒钟后将吸嘴提离液面；

5) 平稳的把按钮压到第一停靠点，再把按钮压到第二停靠点以排出剩余的液体；

6) 提起微量移液器，让吸嘴轻轻靠容器内壁，松开按钮；

7) 剔除吸嘴。

四、操作步骤

（一）培养细菌

将带有质粒pET-28的大肠杆菌接种在含50μg/mL 卡那霉素(Kan)的LB 液体培养基中，37℃振荡培养过夜。注意：添加Kan 时，须待LB 培养基冷却到50℃左右方可加入。

接种操作：

1) 首先准备好10ul 量程的移液枪，枪架，70%酒精和棉球，镊子，枪头盒子（灭过菌的，

含枪头）还有Ep 管架，放到超净工作台，打开紫外灯灭菌20-30min.

2) 关掉紫外灯，把装有10ml LB 培养基的锥形瓶，菌液（菌种：pET-28）和卡那霉素放到

超净工作台上，点燃酒精灯。

3) 用酒精棉球擦拭双手以及超净台面（若枪，枪架，枪头盒子等未在酒精灯下灭菌则使用前

要用酒精棉球擦拭）。

4) 拆掉装培养基的锥形瓶的棉线，打开棉塞，将瓶口和棉塞置于酒精灯上方作灭菌杀毒处理，

迅速盖紧棉塞。把移液枪的量程调到10ul ，用酒精棉球轻轻擦拭枪管，甩干酒精，取枪头

时，手侧面打开枪头盒子，迅速取出枪头并顺手关好盒子，注意手不能碰到枪头。

5) 取10ul 卡那霉素，注意取的时候，用大拇指顶开pE 管的盖子，不要让手接触到管口内。

取完后，迅速加入到锥形瓶内，注意加的时候，拿枪的那只手的食指和中指的根部夹紧棉

塞，并且棉塞和锥形瓶口不要离开火焰太远，枪头要始终朝下。加完剃掉枪头。

6) 调节枪的量程到2ul ，按上述方法取2ul 菌液，加入到锥形瓶内，剃掉枪头，枪归还到架子

上，然后包好锥形瓶，做好标记。

7) 清理好超净工作台。把接种好的菌放在摇床上培养过夜。

（二）从菌落中快速提取制备质粒DNA

1．取1.4mL 菌液置于1.5mL Ep管中，10000rpm 离心1min 。

2．弃上清，加入150μL GET 缓冲液，在涡旋混合器上充分混匀，在室温下放置10min 。

3．加入200μL新配制的0.2mol/L NaOH(内含1％SDS) ，加盖，颠倒（不要振荡）2～3次，使之混匀，冰上放置4min ，最多不能超过5min 。

4．加入150μL15min 。

5．在10000rpm 离心5min ，上清液吸至另一干净的1.5mL Ep中，如上清液浑浊则需重新离心一次。

6．于上清液中加等体积酚/氯仿液，振荡混匀，12000rpm 离心2min ，小心吸取上清液，转移至另一1.5mL Ep管中，注意勿将两液相中间的白色蛋白薄层吸出。

7．向上清液加入2倍体积无水乙醇，混匀，室温放置3min 。用离心机于12000rpm 离心5min 。小心吸去上清液，将离心管倒置于一张纸巾上，以使所有液体流出。

8．用0.5mL 70％乙醇洗涤沉淀一次，10000rpm 离心3min ，除尽乙醇，室温自然干燥(将离心管倒置于一张纸巾上) ，备用。

9．用25uL 含无DNA 酶的胰RNase(20 ug／mL) 的TE 重新溶解DNA ，置于使用。贮存于-20℃备用，可长期保存。

五．质粒的检测

1. 制琼脂糖凝胶（详细内容见下节）；

2. 取1ul loading buffer和9ul 上述提取的质粒，混合均匀后加样；

3. 在60V 的电压下，跑胶50min(距胶板末端1~2cm处) ，关闭电源，取出胶块放到EB 中染色20min;

4. 取出后，在蒸馏水中清洗后，拿到凝胶成像仪下观测图谱；

5. 图谱结果：

1 2 3 4 5 M 7 8

1. 翟天龙 2. 贺选

3. 徐鸿琛 4. 程锦明

5. 李墨 6.Marker

7. 胡慧 8. 张良春

质粒电泳图

由上图可以清楚的看到，位于marker 的第三条带对应的位置有带存在，说明质粒提取成功。

六、注意事项

1．收集菌体提质粒前，培养基要去除干净，同时保证菌体在悬浮液中充分悬浮。

2．在添加溶液Ⅱ与溶液Ⅲ后溶液的混合一定要柔和，采用上下颠倒的方法，千万不能在旋转器上剧烈

振荡。其中加入溶液Ⅱ后，溶液变成澄清，并有黏性；加入溶液Ⅲ后，出现絮状沉淀。

3．苯酚具有腐蚀性，能造成皮肤的严重烧伤及衣物损坏，使用时应注意。如不小心皮肤上碰到苯酚则

应用碱性溶液、肥皂及大量的清水冲洗。

4．苯酚可以用于抽提纯化DNA ，由于苯酚的氧化产物可以使核酸链发生断裂。所使用的苯酚在使用前

必须经过重蒸，且都必须用0.1mol/LTris-HCl (pH7.6)进行平衡。所以取酚/氯仿/异戊醇时应取下层溶液，因为上层是Tris-HCl 液隔绝空气层。

5．酚/氯仿/异戊醇抽提时，应充分混匀。经酚/氯仿/异戊醇抽提后，吸取上清液时注意不要把中间的白

色层吸入，其中含有蛋白质等杂质。

6．实验中，涉及酚/氯仿溶液的操作要格外小心，而且与之接触的吸头、Ep 管，全部弃用，不回收。

7．有些质粒本身可能在某些菌种中稳定存在，但经过多次移接有可能造成质粒丢失。因此不要频繁转

接，每次接种时应挑单菌落。

七、思考题

1．裂解细菌时需注意的事项有哪些？

答:要防止剧烈的震荡破坏质粒，并且防止细菌DNA 裂解混入质粒。

2．质粒的基本性质有哪些？

答：是一种能进行自主复制的双链环状DNA ，可遗传给子代；常常携带有抗性基因；质粒融进细胞之后可以整合进细胞的染色体，随细胞一起复制翻译，也能从细胞中游离出来而成为独立的DNA 分子。

3．碱裂解法提取质粒DNA 中各溶液的作用是什么？

答：溶液Ⅰ（50mM 葡萄糖/10mM EDTA/25mM Tris-HCl,pH 8.0）中，葡萄糖的作用是使悬浮的大肠杆菌不会快速的沉积到管底；EDTA 是用于抑制DNase 的活性。缓冲液则用于控制溶液的酸碱性和渗透压。溶液Ⅱ（0.2M NaOH/1%SDS）中，NaOH 的作用是使细胞破裂，使细胞膜崩解。SDS 则是用于共沉淀蛋白质和基因组DNA 。溶液Ⅲ（3M 醋酸钾/2M 醋酸）中，醋酸钾是用于置换SDS 中的Na ，形成PDS 沉淀，从而使蛋白质和基因组DNA 沉淀而除去。醋酸是用于维持溶液酸碱性避免溶液pH 过高。

4．抽提质粒DNA 的方法包括哪几个步骤？

答：首先，用物理的或者化学的方法使细菌细胞破裂，加入蛋白酶，醋酸盐沉淀或者酚/氯仿抽提，除掉蛋白质；其次，加入SDS 和醋酸钾，也可除去蛋白质和基因组DNA ；然后加入RNase 酶除掉RNA 。

5．如何提高质粒DNA 的产量？

答：增加菌液的量或浓度，多次离心一次收集

6．为什么质粒DNA 不能反复在4℃、-20℃、室温中放置？为达到这一目的，需要注意些什么？ 答：反复的冷冻融化，会降低质粒DNA 的活性或者使其受到破坏，不利于后面的酶切实验。

实验二 DNA 的含量、纯度与分子量的电泳法测定

一、 实验原理

测定核酸通常采用两种方法：即紫外分光光度法与琼脂糖凝胶电泳法。

1．紫外分光光度法

DNA 或RNA 定量时，应在260nm 和280nm 两个波长下读数。根据计算在260nm 波长下，每1ug/mL DNA 钠盐的A 值为0.20，即在A 260=1时，双链DNA 含量为50ug/mL，单链DNA 与RNA 含量为40ug/mL，单链寡核苷酸的含量为33 ug/mL。

双链DNA 含量＝A 260×50×稀释倍数（ug/mL）

RNA 含量＝A 260×40×稀释倍数（ug/mL）

单链DNA 含量＝A 260×33×稀释倍数（ug/mL）

此外还可以根据260nm 和280nm 的读数间的比值（A 260/A280）估计核酸的纯度。

2．琼脂糖凝胶电泳法

根据DNA 分子量不同，采用外加电场使其分开，用EB 嵌入DNA 分子后在紫外下显荧光。而荧光强度正比于DNA 的含量，如将已知浓度的标准样品表2－1作为电泳对照，就可以估计出待测样品的浓度。电泳后的琼脂凝胶糖直接在紫外灯下拍照，只需要5－10ngDNA ，就可以从照片上比较鉴别。

由于电泳时所用的样品量非常少，只要将浓度控制在几十纳克即可，所以在基因工程中经常被用做检测DNA 样品。

表2－1 λDNA/ Hind Ⅲ中DNA 片断

二、实验目的

1．从以上实验中提取到的质粒DNA ，为了能作下一步的酶切，连接及转化实验，必须测定DNA 的纯

度、含量以及分子量大小。

2．本实验旨在学习水平式琼脂糖凝胶电泳，学习检测DNA 、含量与相对分子质量大小。

三、实验材料和试剂

材料：自制的质粒DNA 、λDNA/ Hind Ⅲ、。

试剂：

1．标准DNAmarker(λDNA/ Hind Ⅲ)

2．限制性内切酶Not Ⅰ和10XH Buffer

3．酶反应中止液：0.2 5％溴酚蓝(含40％蔗糖) ，已配好。

4．溴化乙锭染液（EB ）：使用前稀释1000倍，母液已配好。注意：EB 是一种诱变剂，配制和使用时

应戴好手套，并且不能将该染液洒在桌面或地面上！使用后立即用大量的水冲洗干净。

5．0.5×TBE 缓冲液：Tris 2.18g、硼酸1.10g 、EDTA-Na 20.14g 用蒸馏水定容至400mL 。可配成5×TBE 母液，使用时稀释10倍即可。

6．0.7％琼脂糖

仪器：

37℃水浴锅、微波炉、稳压电泳仪、凝胶成像系统、电泳槽、Eppendorf 架、恒温摇床、台式小型振荡器、Ep 管(1.5mL)、加样器(20uL～lmL) 、吸头。

四、实验操作

（一）琼脂糖凝胶板的制备

1．琼脂糖凝胶的制备

称取0.175g 琼脂糖，置于锥形瓶中，加入25mL TBE 缓冲液，瓶口倒扣一小烧杯，于电炉上加热，注意：防止溢出，由于琼脂糖较难溶解，如果水分损失较大，则补充一定量的蒸馏水，使其终浓度为0.7％。（TBE 缓冲液是先配好的5X 的，稀释10倍后为0.5X ）

2．胶板的制备

将有机玻璃内槽洗净、晾干。取胶带纸将有机玻璃内槽的两端边缘封好，形成一个边脚模子。注意：将橡皮膏紧贴在有机玻璃内槽两端边上，不能留空隙。

将有机玻璃内槽置于水平位置，放好样品槽模板(一般称之为梳子) ，将冷却至65℃左右的琼脂糖凝胶，小心地倒在内槽上，控制灌胶速度，使胶液缓慢地展开，直到整个有机玻璃板表面形成均匀的胶层。室温下静置1h 左右，待凝固完全后，轻轻拔出样品槽模板，撕去胶带纸，胶板上即形成相互隔开的样品槽。（胶板有黑色线条的一侧为加样的一侧，电泳时连负极。）

将有机玻璃内槽放入电泳槽中，加入0.5×TBE 电泳缓冲液，以盖过胶板为宜。

胶板内的样品小槽

质粒DNA 的酶解:

1) 新提的质粒，在20uL 的体系中用单一酶Not Ⅰ进行处理，即：

质粒DNA 8μL

10×H Buffer 2μL

Not Ⅰ 1μL

无菌水 5μL

0.1% BSA 2ul

0.1% Tritonx-100 2ul

注意：以上物质的加入顺序：无菌水——质粒——Tritonx ——BSA ——H Buffer ——Not Ⅰ，酶一定要最后再加！试剂的加入量甚微，所以要确保试剂加入到了体系中。

2) 37℃，保温3-4小时。

3．加样

用微量加样器将上述样品分别加入胶板的样品小槽内，每次加完一个样品为了避免交叉污染，各样品用不同的吸头，以免造成限制酶被污染。加样时，吸头不要插入胶板内，防止碰坏样品槽周围的凝胶面，每个样品槽的加样量不宜过多，本实验加样量为:18ul样品+2ul Loading Buffer 。(每块胶板需点一个Marker ，这里即为λDNA/ Hind Ⅲ)

加样要注意加样器不要戳胶，尽量不要有气泡，如果有气泡可以用加样器轻轻的吸出。

4．电泳

加完样品后应立即通电，进行恒压电泳。在低压条件下，线形DNA 片段的迁移速度与电压成比例关系，为了获得电泳分离DNA 片段的最大分辨率，电场强度不应高于5V/cm。此实验中用到的电压为80V ，电流26mA.

当溴酚蓝染料（蓝色）移动到距离胶板下沿约1～2cm 处，停止电泳。

5．染色

将电泳后的凝胶浸入EB 染液中，进行染色以观察在琼脂糖凝胶中的DNA 带。染色20min 后，用大量水冲洗。注意要带手套，防止EB 污染和毒害作用，凝胶放入染液中时动作要轻，不要把胶弄破，

也不要让染液溅出。

6．观察

在波长为254nm 的紫外灯下，观察染色后的电泳凝胶。DNA 存在处显示出红色荧光条带。 用凝胶自动成像仪处理代替。

7. 成像结果：

1 2 3 M 5 6 7 8 9 10 11

Not Ⅰ酶切结果

1. 姚雨竹 2. 王远馨 3. 甘广丽 4.Marker 5.李墨 6. 贺选 7. 胡慧 8. 徐鸿琛 9. 严安(10μl)

10曾雪 (10μl) 11. 对照

由上图可以看到，对应于marker 和质粒对照的图谱，在第四条带处有很明显的条带出现，说明环状的质粒DNA 被切成线性的DNA 链。

五、注意事项

1．基因工程是微量操作技术，DNA 样品与限制性内切酶的用量都极少，必须严格注意吸样量的正确性，确认样品确实被加入反应体系。

2．酶应在－20℃冰箱中保存，取酶的操作必须严格在冰浴条件下进行，用完后立即放回－20℃冰箱，不要将酶在冰浴中放置过久，或放在高于0℃以上的环境中，以防止酶失活。

3．酶切加样次序为水、缓冲液和DNA ，然后混匀。酶永远是最后加入的，如将酶直接加入浓缩的缓冲液中会引起严重的失水。酶切反应体系的溶液加完后，用手指轻弹管壁使溶液混匀，也可用微量离心机甩一下，使溶液集中在管底，不要用振荡器。此步操作是整个实验成败的关键，注意防止错加、漏加。

4．为了避免交叉污染，各样品用不同的吸头，且每次取酶时务必换吸头，以免造成限制酶被污染。

5．溴化乙锭是一种强烈的诱变剂，有毒性，使用含有这种染料的溶液时，应戴手套进行操作。

勿将溶液

滴洒在台面或地面上，用后用水彻底冲洗干净。 六、思考题

1．简述EB 显色的原理。

答：EB 含有一个可以嵌入DNA 堆积碱基之间的一个三环平面基团，它与DNA 结合几乎没有碱基序列特异性，在高离子强度的饱和溶液中，大约每2.5个碱基插入一个EB 分子，当染料分子插入后，其平面基团与DNA 螺旋的轴线垂直并通过范德华力与上下碱基相互作用，该基团的固定位置以及与碱基的密切接近，导致与DNA 结合的染料呈现荧光，并且荧光产率比游离的染料有所增加。 2．使用溴化乙锭时应注意什么？

答：溴化乙锭具有高致癌性，使用时不能沾在手上或身体上，也不能溅在实验台上，要小心使用，带戴上手套。

3．说明不同电压对电泳结果的影响是什么

答：电压越大，跑胶越快，条带之间就难于分辨；电压越小，跑胶越慢，条带分开的距离就越大越清晰。 4．如何判断DNA 的纯度？

答：测定260nm 处的吸光值，并与280nm 处的吸光值进行比较，根据比值大小判断纯度。

实验三 感受态细胞的制备及转化

一、实验原理

感受态就是细菌吸收转化因子的生理状态，只有发展为感受态的细胞才能稳定摄取外来的DNA 分子。转化是将外源DNA 分子引入受体细胞，使之获得新的遗传性状的一种手段。转化的基本原理是细胞处于0℃，CaCl 2低渗溶液中，细胞膨胀成球形，转化混合物中的DNA 形成抗DNase 的羟基－钙磷酸混合物粘附于细胞表面，经42℃短时间热冲击处理，促使细胞吸收DNA 复合物，在选择性培养基平板上培养，可选出所需的转化子。

二、实验目的

1．学习和理解影响细胞感受态的因素，掌握感受态细胞的制备方法。

2．掌握质粒的转化方法。把体外DNA 引入受体细胞，使受体菌具有新遗传性，并从中选择出转化子。 三、实验材料和用具

材料：自制的质粒DNA 、大肠杆菌(E.coli ) 菌种(DH5α菌株) 。 试剂：

LB 琼脂平板 (无抗生素) 、

LB 琼脂平板 (含50μg/L氨苄青霉素) 、 LB 液体培养基5mL(无抗生素) 、 LB 液体培养基100mL(无抗生素) 、

LB 液体培养基5mL(含50μg/L氨苄青霉素) 、

0.1mol/LCaCl2溶液(灭菌备用) 。 仪器：

恒温培养箱、恒温摇床、接种环、涂布器、冷冻离心机、离心管、超净工作台、高压蒸汽灭菌锅。

四、操作步骤

(一) 大肠杆菌感受态细胞的制备

1．从新活化的E.coli DH5α菌平板上挑取一单菌落，接种于5mL 液体培养基中，37℃振荡培养过夜，

直至对数生长期。将该菌悬液以1：50接种于50mL LB 液体培养基中，37℃快速振荡培养3～4h 。 2．取1.4ml 上述培养的菌液放入离心管中，在冰上放置10min ，于4℃5000r/min离心10min ，再取1.4ml 菌液，冰上放置10min 后在相同的条件下离心10min 。

3．可用加样器将残余液体尽量去净，用1mL 预冷的0.1mol/LCaCl2溶液轻轻悬浮细胞，冰上放置15～

30min 。（用加样器反复小心的吹打，使细胞悬浮） 4．于4℃，5000rpm 离心10min 。

5．弃上清，加入200μL预冷的0.1mol/LCaCl2溶液，小心悬浮细胞，冰上放置片刻，即制成了感受

态细胞悬液。

6．制好的感受态细胞可在冰上放置，24h 内直接用于转化实验，也可加入占总体积95％左右高压灭菌

过的甘油，混匀后分装于Ep 管中，-70℃条件下可保存半年至一年。

(二) 平板培养基制备（倒平板）

将配制好的120ml 每瓶的两瓶培养基放到微波炉中加热融化（此过程中要时时摇动培养基，避免冲塞和融化不匀），待培养基冷却到50℃左右时，取出其中一瓶加入120ul 的卡那霉素，摇匀后从下往上分装到8个培养皿中，分装要尽量均匀，培养基以浸没皿地的量为准，倒完后轻轻晃动培养皿，使培养基分散均匀；另一瓶不加抗生素，直接分装到8个培养皿中，做好标记后用保鲜膜包好，整个过程在超净工作台内完成。

(三) 细胞转化

取200μL摇匀后的感受态细胞悬液，进行下一步的转化，转化如下（单位：μL）：

样品组即为我们的转化组：100μL感受态细胞＋2μL质粒DNA 对照1为受体菌对照组：100μL感受态细胞＋2μL无菌水

对照2为质粒DNA 对照组：100μL0.1mol/LCaCl2＋2μL质粒DNA

将以上各样品轻轻摇匀，冰上放置30min 后，于42℃水浴中保温90s （此过程中不要晃动样品），然后迅速在冰上冷却3～5min 。上述各管中分别加入300μL LB液体培养基，使总体积为400μL，该溶液称为转化反应原液，摇匀后于37℃振荡培养30min ，使受体细胞恢复正常生长状态，并使转化体产生抗药性。 (四) 平板培养

先取100ul 样品培养液，加到一个不加抗生素的培养皿上，盖好，再另取100ul 样品培养液加到含有抗生素的培养皿上，盖好；取出涂布棒，先均匀的涂开加到不含抗生素的培养皿上的培养液，再涂开加到含有抗生素的培养皿上的培养液，这样，一根涂布棒就可以涂两个皿（注意涂的顺序），再取对照1和对照2的培养液，按照上述操作分别涂到另外四个培养皿上，做好标记！放到37℃的培养箱中倒扣培养24h ，待菌落生长良好且未相互重叠时停止培养。 (五) 检出转化

受体菌对照组 质粒对照组 转化实验组 （六）实验结果

不含抗生素培养基 有大量菌落长出 无菌落长出 有大量菌落长出

含抗生素培养基 无菌落长出 无菌落长出 有菌落长出

结果分析

本实验未产生抗药性菌株 质粒DNA 不含杂菌 质粒进入受体菌中产生抗药性

如下图所示，从左到右分别为样品组，对照1，对照2，上面一排为不含卡那霉素的，下面为含有卡那霉素的，经观察发现样品组加了抗生素的培养基中有许多圆斑状菌落，而未加抗生素的培养基中则为重叠成片的菌苔，对照1中加了抗生素的培养基中没有细菌生长，而没加抗生素的培养基中长了大量的菌苔，对照2中两组均没有细菌生长说明含有抗生素抗性基因已经成功的导入了细菌细胞，并且表达成功。（在对照2中由于拍照的问题，反光太强烈了，效果不是很好，另外上面的一个有较多地水珠。）

五、注意事项

1．这一个实验中的所有操作均要为无菌操作，在超净工作台内进行。 2．细胞转化中，42℃水浴90s 要准确操作。

3．制备感受态细胞过程中，需要在冰上放置的一定不要在室温中放置。 思考题

1． 感受态细胞制备好后，为什么在转化前还要在冰上放置？

答：在冰上放置后，转化时从低温突然提高到42℃短时间热刺激，细胞在应激反应下可产生大量的cAMP ，而cAMP 可改变细胞膜的通透性，促使细胞吸收DNA 复合物，从而提高转化率。 2．思考转化后平板培养应有的结果、分析自己培养的情况。 答：应有的结果：

受体菌对照组 质粒对照组 转化实验组

不含抗生素培养基 有大量菌落长出 无菌落长出 有大量菌落长出

含抗生素培养基 无菌落长出 无菌落长出 有菌落长出

结果分析

本实验未产生抗药性菌株 质粒DNA 不含杂菌 质粒进入受体菌中产生抗药性

自己的培养情况完全符合以上结果。

附录：

1. pH8.0 G.E.T. 缓冲液 (灭菌后使用) ：

葡萄糖 0.991g EDTA-Na 2 0.372g Tris-HCl 0.303g H 2O 100mL

2. 5mol/L KAc：49.08g KAc 溶于100mL H2O 。

3. PH4.8乙酸钾溶液：取60mL 5mol/L KAc,11.5mL 冰醋酸，28.5mL H2O 即可。 4. 0.2mol/LTris-Cl：2.422g 溶于100mL H2O 。 5. 0.2mol/LHCl：取1.724mL 浓HCl 稀释到100mL 。

6. pH8.0 0.1mol/L Tris-HCl：取0.2mol/LTris-Cl 50mL加入29.2mL 0.2mol/LHCl，补H 2O 至

100mL 即可。

7．pH8.0 10mmol/LEDTA-Na2：3.722g EDTA-Na2溶于一定量的 H 2O 中，用固体NaOH 调节其

pH 值，最后定容至100mL 。

8．pH8.0TE ：取10mL pH8.0 0.1mol/L Tris-HCl，10mL pH8.0 10mmol/L EDTA -Na2，最后

定容至100mL ，调节pH 至8.0。含RNA 酶（RNaseA ）20ug/mL。

9．pH7.6 0.1mol/L Tris-HCl：取0.2mol/LTris-Cl 50mL加入38.5mL 0.2mol/L HCl，补H 2O

至100mL 即可。用于饱和酚/仿混合物。 10．酚/仿溶液（按如下体积和顺序加入试剂）

饱和酚：重蒸酚 12.5mL 三氯甲烷 12mL 异戊醇 0.5mL

用pH7.6 0.1mol/L Tris-Cl 平衡2～3次，在饱和酚/仿上，加入等体积的pH7.6 0.01mol/L Tris-Cl 保护，棕色瓶保存，4℃存放。

11．5×TBE ： 称取Tris-Cl 21.8g，硼酸11.0g 和EDTA-Na 2 1.4g 用蒸馏水溶解，定容至400mL 。

临用时稀释为0 .5×TBE 。

12．0.1 mol/LCaCl2：5.5g CaCl2溶于500mL H2O 。灭菌后备用。 13．无菌水。

菌液或菌落PCR 实验设计

实验设计原理：

直接挑取菌落在95℃的条件下可以使细菌的细胞破裂，释放基因组DNA 或质粒，成为PCR 体系的模板，然后进行链式扩增。通过双向引物的设计，可以使目的基因得到特异性扩增，从而可以快速检验菌落的阳性。

实验设计思路：

用高压灭菌的牙签或是枪头挑取转化后的DH5a 单一菌落加入到装有20ul 双蒸水的离心管中，加热至95℃（此处温度并不限定，只要足够使细胞破裂就行并且使细胞内的酶被破坏掉），同时要设置未转化的DH5a 菌对照，便于判断假阳性，再取适当的上述样品液加入到PCR 反应体系中，进行扩增，同时设置阴性对照（便于判断污染带来的假阳性）。扩增完之后通过琼脂糖凝胶电泳进行阳性检测和分析。（实验共分为三组：未转化组，转化组，不加菌的阴性对照组）

PCR 体系： 50ul 体系

未转化和转化组 阴性对照组

ddH2O 25ul 35ul 10Xbuffer 5ul 5ul 10mMdNTPs 4ul 4ul (2.5mM each)

上游引物 2ul 2ul 下游引物 2ul 2ul 模板DNA 10ul - Taq 酶 2ul 2ul

PCR 程序：变性95℃ 10min，退火55℃ 40s，复性 72℃ 1min 循环30次

产物检测： 双酶切体系(20ul)： 1XK buffer 2ul DNA 10ul

Ecor Ⅰ 1ul BamH Ⅰ 1ul ddH2O 6ul 电泳： 琼脂糖凝胶电泳

点样：1ul loading buffer + 9ul样品

注：该设计中主要目的在于阐述实验思路，所以具体的细节性的操作方法并没有包含其中。

实验感悟

本次实验虽然做的时间很短，但是学到的东西感觉还是蛮多的，最主要的是一些细节方面的习惯性

的东西。以前做生化实验和细胞实验中所没有注意的问题，在本次实验中基本都显露出来了，尤其是微量操作方面的，分子实验注重精确，严禁污染，一个很不起眼的不规范的操作都有可能使整个实验失败，所以细节方面的东西必须注重，比如离心管开盖的方式，移液枪的规范使用，取枪头及时关闭枪头盒子等等。在这次实验中，做的好的地方有，但是做的不好的地方也不少，由于没有做过微生物的实验，所以在菌的接种和培养上做的不是很好，另外由于之前没有搞懂整个实验的全部流程，所以做实验时比较被动，这些都是需要改进的地方，还有一个就是和同学们交流上的问题了，这方面不太积极，所以很多事情做起来有点吃力，这也是有待提高的地方。总之，这次实验不仅让我学会了一些分子生物学方面的知识，更是让我认识到了许多不足的有待加强的方面。