包涵体复性

包涵体复性常见问题分析

1. 对于尿素和盐酸胍该怎么选择?

尿素和盐酸胍属中强度变性剂，易经透析和超滤除去。它们对包涵体氢键有较强的可逆性变性作用，所需浓度尿素8-10M，盐酸胍6-8M。尿素溶解包涵体较盐酸胍慢而弱，溶解度为70-90%，尿素在作用时间较长或温度较高时会裂解形成氰酸盐，对重组蛋白质的氨基进行共价修饰，但用尿素溶解具有不电离，呈中性，成本低，蛋白质复性后除去不会造成大量蛋白质沉淀以及溶解的包涵体可选用多种色谱法纯化等优点，故目前已被广泛采用。

盐酸胍溶解能力达95%以上，且溶解作用快而不造成重组蛋白质的共价修饰。但它也有成本高、在酸性条件下易产生沉淀、复性后除去可能造成大量蛋白质沉淀和对蛋白质离子交换色谱有干扰等缺点。

2. 怎样洗涤包涵体？

通常的洗涤方法一般是洗不干净的，可以先把包涵体用6M盐酸胍溶解充分，过滤除去未溶解的物质，注意留样跑电泳，然后用水稀释到4M,离心把沉淀和上清分别跑电泳，如此类推可以一直稀释到合适的浓度，可以找到一个合适去除杂质的办法，其实这就是梯度沉淀的方法，比通常的直接洗脱效果好。

3. 8M尿素溶解的包涵体溶液应如何保存?

在4度放置半个月，都没什么问题 。在室温放置超过48小时，可能会对目的蛋白有影响，因为尿素在碱性条件下可使一些氨基酸酰基化，所以早些处理BI溶液比较好。

4. 包涵体复性有什么原则？

低浓度，平缓梯度，低温。

5. 复性时的蛋白浓度是？

一般使用浓度为0.1-1mg/ml，太高的浓度容易形成聚体沉淀，太低的浓度不经济，而且很多蛋白在低浓度时不稳定，很容易变性。

6. 复性中蛋白析出是怎么回事？该怎么处理？

出现蛋白析出，肯定是条件变化太剧烈了。复性应该采取复性液浓度和PH值逐渐变化的方法，例如根据包涵体的溶液成分，每隔1个PH或浓度值配置一种溶液，逐步透析到正常。此外透析时必须浓度极低，条件温和，使蛋白质能够正确折叠。但是复性的比率应该很低。

若加变性剂尿素可加到2M，盐酸胍可加到1-1.5M；

另外可将甘油浓度增加，范围可在≤30%，且在复性样品中也可加适量甘油。

包涵体复性注意事项

1. 最适pH值范围为8.0-9.0之间；

2. 温度适宜选择4℃；

3. 复性过程蛋白浓度不宜过大，一般为0.1-0.2mg/mL；

4. 复性时间一般为24-36小时；

5. 低分子化合物 如L-Arg有助于增加复性中间产物的溶解度；脲、盐酸胍、烷基脲、以及碳酸酰胺类等，在非变性浓度下是很有效的促进剂，都可阻止蛋白聚集；Tris对蛋白质复性有促进作用；EDTA可以防止蛋白降解；

6. 氧化还原体系，如GSH/GSSG、DTT/GSSG、DTE/GSSG等.；

7. 首先要获得较高纯度的包涵体；

8. 包涵体溶解要彻底，一般应使溶解液体量较大，不要怕蛋白被稀释，要有助溶措施；

9. 透析前后均要离心；

10. 透析不能太快；

11. 纯化的最佳条件要摸索；

12. 包含体要彻底洗涤干净，洗涤液中加入适量Triton-X100；

13. 包含体溶解后装入透析袋在复性液中复性；

14. 复性完毕在低浓度的缓冲液中连续缓慢透析12-24h ；

15. 复性率的测定时要据变性蛋白和非变性蛋白的光学性质不同测定

16. TritionX100、SDS这一类去垢剂最后不易去除，在制药行业中一般不允许采用。用Triton洗涤有些包涵体效果不是很好。包涵体洗涤是纯化极为重要的一步，改变培养条件，再洗涤包涵体，有时可以在上柱前已经只剩下3-4条杂带，这样后续的纯化就很方便了。

包涵体的复性效率及检测

复性是一个非常复杂的过程，除与蛋白质复性的过程控制相关外，还很大程度上与蛋白质本身的性质有关，有些蛋白非常容易复性，如牛胰RNA酶有12对二硫键，在较宽松的条件下复性效率可以达到95%以上，而有一些蛋白至今没有发现能够对其进行复性的方法如IL-11，很多蛋白的复性效率只有百分之零点几。一般说来，蛋白质的复性效率在20%左右。影响复性效率的因素有蛋白质的复性浓度，变性剂的起始浓度和去除速度、温度、pH、氧化还原电势、离子强度、共溶剂和其他添加剂的存在与否等。根据具体的蛋白性质和需要，可以从生化、免疫、物理性质等方面对蛋白质的复性效率进行检测。 其效果检测方法如下：

1. 凝胶电泳：一般可以用非变性的聚丙烯酰胺凝胶电泳可以检测变性和天然状态的蛋白质，或用非还原的聚丙烯酰胺电泳检测有二硫键的蛋白复性后二硫键的配对情况。

2. 光谱学方法：可以用紫外差光谱、荧光光谱、圆二色性光谱（CD）等，利用两种状态下的光谱学特征进行复性情况的检测，但一般只用于复性研究中的过程检测。

3. 色谱方法：如IEX、RP-HPLC、CE等，由于两种状态的蛋白色谱行为不同。

4. 生物学活性及比活测定：一般用细胞方法或生化方法进行测定，较好的反映了复性蛋白的活性，值得注意的是，不同的测活方法测得的结果不同，而且常常不能完全反映体内活性。

5. 黏度和浊度测定：复性后的蛋白溶解度增加，变性状态时由于疏水残基暴露，一般水溶性很差，大多形成可见的沉淀析出。

6. 免疫学方法：如ELISA、WESTERN等，特别是对结构决定簇的抗体检验，比较真实的反映了蛋白质的折叠状态。

包涵体形成原因及减少策略

形成原因

1. 表达量过高，研究发现在低表达时很少形成包涵体，表达量越高越容易形成包涵体。原因可能是合成速度太快，以至于没有足够的时间进行折叠，二硫键不能正确配对，过多的蛋白间的非特异性结合，蛋白质无法达到足够的溶解度等。

2. 重组蛋白的氨基酸组成，一般说来含硫氨基酸越多越容易形成包涵体。

3. 重组蛋白所处的环境：发酵温度高或胞内pH接近蛋白的等电点时容易形成包涵体。

4. 重组蛋白是大肠杆菌的异源蛋白，由于缺少真核生物中翻译后修饰所需酶类，致使中间体大量积累，容易形成包涵体沉淀。

5. 有报道认为，丰富的培养基有利于活性蛋白质的表达，当培养条件不佳时，容易形成包涵体。

减少包涵体形成的策略

1. 降低重组菌的生长温度，降低培养温度是减少包涵体形成的最常用的方法，较低的生长温度降低了无活性聚集体形成的速率和疏水相互作用，从而可减少包涵体的形成。

2. 添加可促进重组蛋白质可溶性表达的生长添加剂，培养E.coli时添加高浓度的多醇类、蔗糖或非代谢糖可以阻止分泌到周质的蛋白质聚集反应，在最适浓度范围内添加这些添加剂不会影响细胞的生长、蛋白质的合成或运输，其它促重组蛋白质可溶性表达的生长添加剂还有乙醇（诱导热休克蛋白的表达）、低分子量的巯基或二硫化合物（影响细胞周质的还原态，从而影响二硫键的形成）和NaCl。

3. 供给丰富的培养基，创造最佳培养条件，如供氧、pH等。

包涵体复性原理

包涵体是外源基因在原核细胞中表达时，尤其在大肠杆菌中高效表达时，形成的由膜包裹的高密度、不溶性蛋白质颗粒，在显微镜下观察时为高折射区，与胞质中其他成分有明显区别。包涵体形成是比较复杂的，与胞质内蛋白质生成速率有关，新生成的多肽浓度较高，无充足的时间进行折叠，从而形成非结晶、无定形的蛋白质的聚集体；此外，包涵体的形成还被认为与宿主菌的培养条件，如培养基成分、温度、pH值、离子强度等因素有关。细胞中的生物学活性蛋白质常以可融性或分子复合物的形式存在，功能性的蛋白质总是折叠成特定的三维结构型。包涵体内的蛋白是非折叠状态的聚集体，不具有生物学活性，因此要获得具有生物学活性的蛋白质必须将包涵体溶解，释放出其中的蛋白质，并进行蛋白质的复性。

包涵体复性的方法

一个有效的、理想的折叠复性方法应具备以下几个特点：活性蛋白质的回收率高；正确复性的产物易于与错误折叠蛋白质分离；折叠复性后应得到浓度较高的蛋白质产品；折叠复性方法易于放大；复性过程耗时较少。

1. 透析、稀释和超滤复性法：

这三种方法是最传统也是应用最普遍的蛋白质折叠复性方法，复性活性回收率低，而且难于与杂蛋白分离。透析法耗时长，易形成无活性蛋白质聚集体；超滤法在膜上聚集变性，易造成膜污染；稀释法处理量太大，不利于工业放大。

2. 凝胶过滤层析复性

凝胶过滤层析复性又称体积排阻复性(SEC)，是一种广泛应用的层析技术。与常用的稀释复性法相比，凝胶过滤层析复性能在高的起始蛋白浓度下对蛋白进行复性，活性回收率较高，同时又能使目标蛋白得到一定程度的纯化。

凝胶过滤复性时，除了蛋白质在胶粒中的传质和扩散外，蛋白质与介质之间并不发生其它任何作用。复性过程始终发生在溶液中。蛋白质在伸展状态中，每个蛋白质分子的伸展状态都会有差别，而不同伸展状态的蛋白质分子在凝胶颗粒内部扩散所受到的限制也不相同，有的会扩散入颗粒内部深一些，有的会浅一些，这使不同伸展状态的蛋白质分子达到一定程度的分离，这样蛋白质分子问相互作用的机会就大大减少，从而起到一定抑制凝集的作用；即使发生了部分凝集，凝集的蛋白质会附着在胶粒上，而不随着溶液向下运动，这样后面的变性剂可以赶上凝集的蛋白质，使其重新溶解并变性；并且在凝胶过滤中脲等变性剂脱除得相对较慢，这对有些蛋白质的复性是有利的。

在普通凝胶过滤中，变性剂和还原剂的脱除虽较稀释复性慢，但变性蛋白质仍会经历变性剂浓度突然变化的过程。脲梯度复性是样品上柱前用复性缓冲液平衡柱子，接着使变性剂浓度递减(如从6M 盐酸胍或8M尿素下降到复性缓冲液中预先确定的变性剂的浓度)。此法为蛋白质复性提供了一个较温和的环境，实现了线性去除变性剂，对高浓度变性蛋白质的复性效果十分显著。对初始浓度为17mg／ml的还原变性溶菌酶，在40min内可以得到高达9O%的活性回收率。此外在脲梯度SEC的基础上发展了pH和脲浓度双梯度SEC法用于蛋白复性，效果很好。

在SEC复性的基础上设计的连续基质辅助蛋白复性系统能使变性蛋白定量地转换成复性的天然态蛋白。此复性方法能够将复性过程中产生的蛋白聚集体再次复性，使蛋白最大程度地得到回收。伴侣溶剂塞(Chaperon solvent plug)SEC复性法在一定程度上解决了变性蛋白进入柱顶端之前发生沉淀这一问题。此外，抗体、小分子添加剂如L一精氨酸和环糊精等共价结合到SEC固定相上也可能会提高某些蛋白的复性效率，同时又能使这些物质得以重复利用，降低生产成本。

3. 高蛋白浓度下的复性方法：

一个成功的复性过程在于能够在高蛋白浓度下仍能得到较高的复性率。一个方法是把变性蛋白缓慢连续或不连续地加入到复性液中。在两次蛋白加入之间，应有足够的时间间隔使蛋白质折叠通过了易聚集的中间体阶段。这是由于完全折叠的蛋白通常不会与正在折叠的蛋白一起聚集。第二种方法是用温度跳跃策略。变性蛋白在低温下复性折叠以减少聚集，直到易聚集的中间体大都转化为不易聚集的后期中间体后，温度快速升高来促进后期中间体快速折叠为蛋白的天然构象。第三种方法是复性在中等的变性剂浓度下进行，变性剂浓度应高到足以有效防止聚集，同时又必须低到能够引发正确复性。

4. 添加促进剂的复性方法：

包涵体蛋白质折叠复性促进剂的促进作用可以分为：稳定正确折叠蛋白质的天然结构、改变错误折叠蛋白质的稳定性、增加折叠复性中间体的溶解性、增加非折叠蛋白质的溶解性。通常使用的添加剂有：

a) 共溶剂：如PEG6000~20000，通过与中间体特异的形成非聚集的复合物，可以阻止蛋白质分子间的相互碰撞机会，减少蛋白质的聚集；

b) 去污剂及表面活性剂：如Trition X-100、CHAPs、磷脂、磺基甜菜碱等对蛋白质复性有促进作用，但它们能与蛋白质结合，很难去除；

c) 氧化-还原剂：对于含有二硫键的蛋白，复性过程中应加入氧化还原体系，如GSH/GSSG、DTT/GSSG、DTE/GSSG等，氧化还原系统通过促进不正确形成的二硫键快速交换反应，提高了正确配对的二硫键的产率；

d) 小分子的添加剂：如盐酸胍或尿素、烷基脲、碳酸酰胺类等，都可阻止蛋白聚集，它们的作用可能为：稳定蛋白的活性状态、降低非正确折叠的稳定性、增加折叠中间体的稳定性、增加解折叠状态的稳定性。e、0.4~0.6M L-Arg：L-Arg能使得不正确折叠的蛋白质结构以及不正确连接的二硫键变得不稳定，使折叠向正确方向进行，可大幅度地提高包涵体蛋白质的折叠效率。

e) 添加分子伴侣和折叠酶：分子伴侣是指能够结合和稳定另外一种蛋白质的不稳定构象，并能通过有控制的结合和释放，促进新生多肽链的折叠、多聚体的装配或降解及细胞器蛋白的跨膜运输的一类蛋白质。折叠酶有二硫键异构酶、脯氨酸异构酶等。分子伴侣和折叠酶都能在体外调节蛋白质的正确折叠，提高蛋白质的合成效率。但这类蛋白在折叠复性后要除去，而且十分昂贵，因此采用可回收利用的方法如固定化法为好。

f) 人工伴侣：为模仿分子伴侣而发展的一种方法：首先，变性蛋白被复性液中的去污剂捕获，形成蛋白-去污剂复合体，复合体的形成抑制了蛋白的聚集，然后加入环糊精从复合体中去除去污剂，使得蛋白质正确折叠。

g) 单克隆抗体：待折叠复性的蛋白质的抗体可有效协助复性，但只限于此蛋白才能获得明显的助折叠作用。

h) 其它：多聚离子化合物如肝素可以促进蛋白质的复性，具有稳定天然蛋白质的作用；甘油可以增加黏度，减少分子碰撞的机会，减少错配以提高复性效率；适量的盐浓度可以降低某些带电基团间的斥力，有利于蛋白质的折叠；辅助因子、

短链醇、高渗物等能有效的降低聚集体的形成，对蛋白有稳定的作用。

5. 液相色谱（LC）复性法：

液相色谱是一种最有效的纯化蛋白质的方法，已成为基因重组蛋白质纯化的必不可少的手段，现有报道，疏水相互作用色谱（HIC）、离子交换色谱（IEC）、凝胶排阻色谱（SEC）、亲和色谱（AFC）已成功的对变性蛋白进行了复性。与传统的稀释法和透析法相比，液相色谱复性的优点是：

a) 在进样后可很快的除去变性剂；

b) 由于色谱固定相对变性蛋白质的吸附可明显的减少、甚至完全消除变性蛋白质分子在脱离变性剂环境后的分子聚集，从而避免了沉淀的产生，提高蛋白质复性的质量和活性回收率；

【专题讨论】包涵体蛋白的纯化及复性讨论专贴！

一直以来，园子里一直有很多战友在关于包涵体蛋白的纯化以及透析复性这块存在很多疑问。我从事包涵体蛋白的纯化以及复性这块的时间比较长，有一些经验，希望能与大家一起分享、讨论。大家有什么问题和经验也可以提出来，共同探讨一下。

我先把园子里关于包涵体纯化和蛋白复性这块非常有价值的帖子整理出来供广大战友参考。

包涵体纯化与复性：

色谱柱纯化包涵体

包涵体纯化的方法

与肝素有亲合力的包涵体的纯化

包涵体纯化复性的一篇文章

HIS包涵体的NI纯化

包涵体的纯化和复性总结(精华呦)

洗涤纯化的原理

GST融合蛋白包涵体的纯化

Amersham关于包涵体蛋白复性、纯化的报告

包涵体提出、纯化、复性"必胜技"

Pet28a/Bl21plys 表达体系包涵体的纯化

GST融合蛋白的包涵体能过柱子纯化吗？

含量低的目的蛋白的纯化

包涵体的进一步处理

包涵体直接纯化效果好还是复性以后纯化效果好?

包涵体如何复性

关于包涵体蛋白的复性，浓缩，纯化

关于包涵体的提取方法

制备多克隆抗体的蛋白是否需要除去尿素

从包涵体中提纯蛋白

有关包涵体的溶解问题

包涵体的洗涤

请教：菌体超声破壁时，所用的频率及时间是怎样的？另外应该菌体完全破壁时，菌液应该是怎样的？（也就是说超声的程度）

xxz990913 wrote:

请教：菌体超声破壁时，所用的频率及时间是怎样的？另外应该菌体完全破壁时，菌液应该是怎样的？（也就是说超声的程度）

超声时所用的频率以及时间是跟你的表达菌的种类以及你目的蛋白的性质密切相关的。比如说你的表达菌的承受能力比较强的话，你就可以适当加大超声频率以及超声时间，另外，比如说你的目的蛋白是以包涵体形式存在的话那么你就要注意你的超声力度了，因为很有可能对目的蛋白有很大的影响。一般实验室的超声仪探头的最大承受频率大概也就是400W，所以可以选用300w，超声10s，停止10s，或是选用400w，超声5s，停止5s。超声如果效果较好的话，整个样品应该是比较清亮的，但是并不是十分清亮，当然这跟你在湿菌体中加入pbs的量是有关系的，加多了，就清亮些，加少了，就浑浊些。还有就是超声效果如果好的话，样品不会出现像原来的那种教粘稠的情况，因为长链核酸全部被打断了。

当然为了减小超声的负担，可以在超声前加入溶菌酶，反复冻融等步骤。这也要根据宿主菌而确定。

20021108战友辛苦了

很需要有你这样的热心战友！

请教：蛋白质复性的具体步骤，我的目的蛋白溶解在 20mM tris-hcl ,ph 7.2 0.5M Nacl, 复性缓冲液需要Tris缓冲液还是Pbs缓冲液？ 我用的是 Pbs缓冲液，老是出现沉淀

谢谢

xxz990913 wrote:

请教：蛋白质复性的具体步骤，我的目的蛋白溶解在 20mM tris-hcl ,ph 7.2 0.5M Nacl, 复性缓冲液需要Tris缓冲液还是Pbs缓冲液？ 我用的是 Pbs缓冲液，老是出现沉淀

谢谢

复性问题是表达蛋白过程中的一个很棘手的问题，因为氨基酸组成的不同，造成蛋白不同的性质，同时也使复性变得困难。

包涵体蛋白复性方法大概有如下几种：

稀释复性、透析复性、超滤复性、柱上复性、高蛋白质浓度下的复性，此外，吸附法、反胶束法和双水相萃取法等都可用蛋白质的复性。

鉴于战友的情况，我个人认为应该使用Tris缓冲液较好，因为目前普遍认为大多数蛋白复

兴使用Tris缓冲液效果较好（这可是有文献可查的哦）。至于出现沉淀这一点是不用说的，再成功的复性也会出现沉淀，而且我觉得复性也可以看作是一个纯化的过程，我们期望看到沉淀，因为沉淀的不仅仅是我们的目的蛋白，还有一些杂蛋白，即使按比例沉淀，我们的目的蛋白还是越来越纯了，不是吗？而且这一点我认为战友没有必要担心，如果目的蛋白浓度过小的话，你可以在复性结束后浓缩一下以提高浓度。当然如果目的蛋白全部沉淀的话，就说明这种缓冲液不适合你的目的蛋白，就要改变复性方案了。

影响复性效率的因素就有很多了，比如蛋白质的复性浓度、pH和温度等等等等。

这样的贴为什么不加分啊！！我强烈支持加分斑竹！！

20021108

衣带渐宽终不悔

这是个好战友，希望以后能多请教！！

biosepq wrote:

20021108战友辛苦了

很需要有你这样的热心战友！

谢谢龙版的鼓励！

vicardin wrote:

这样的贴为什么不加分啊！！我强烈支持加分斑竹！！

20021108

衣带渐宽终不悔

这是个好战友，希望以后能多请教！！

谢谢战友您的鼓励！

请教不敢当，互相学习吧。

加不加分没什么太大的关系，开设这个帖的主要目的是和大家共同探讨纯化和复性的经验、技巧等等。

斑竹也不是每时每刻都在线的，也许是还没阅帖吧，呵呵。

谢谢你们

请问Tris缓冲液如何配制?急需

谢谢你们

请问Tris缓冲液如何配制?急需

谢谢你们

请问Tris缓冲液如何配制?急需

xxz990913 wrote:

谢谢你们

请问Tris缓冲液如何配制?急需

Tris缓冲液：

50mM Tris

0.5mM EDTA

50mM Nacl

5%或10％甘油

如果有条件加入1％的甘氨酸或精氨酸和谷胱甘肽会更好些。也可以在其中

加入氧化还原系统，如双型谷胱甘肽、DTT等。

PH理论上是要根据你蛋白的等电点来确定的，应该是比等电点稍高一些。但是PH7.9、8.0我都试过，效果没区别。

我曾经使用过PH 9.5成功复性目的蛋白

天边的一片云 wrote:

我曾经使用过PH 9.5成功复性目的蛋白

如上所述,缓冲液的PH是根据你的目的蛋白的等电点而确定的,呵呵.

复性是一个十分复杂的过程，解决得方法也是多种多样。首先是选择合适的表达载体和表达菌株，尽量少产生包含体。可以先进行预实验确定表达条件，我建议采用正交分析法来进行。一般的我采用4因素3水平的正交实验，因素主要考虑培养温度、诱导物加入量、加入诱导物时的菌浓度和诱导时间。每个因素考虑小、中、大三个水平。我曾经使用这种方法，很好的选择了一个蛋白的表达条件，使其大部分以可溶形式表达。

再谈包含体的复性，在采用通常的方法不行的条件下，可以考虑加入一些化学试剂，一般报道的有PEG、丁酸和多糖。

chinna wrote:

复性是一个十分复杂的过程，解决得方法也是多种多样。首先是选择合适的表达载体和表达菌株，尽量少产生包含体。可以先进行预实验确定表达条件，我建议采用正交分析法来进行。一般的我采用4因素3水平的正交实验，因素主要考虑培养温度、诱导物加入量、加入诱导物时的菌浓度和诱导时间。每个因素考虑小、中、大三个水平。我曾经使用这种方法，很好的选择了一个蛋白的表达条件，使其大部分以可溶形式表达。

再谈包含体的复性，在采用通常的方法不行的条件下，可以考虑加入一些化学试剂，一般报道的有PEG、丁酸和多糖。

这位战友说的是正确的.

但是如果表达载体和表达菌一旦确定以后,想在根据温度、IPTG等来控制包涵体的形成我想并不是很现实，因为每次你加入的母液的浓度总是不一样的，即使是做成了，这种实验的可重复性也是比较差的。因为不稳定性因素太多了，呵呵。

谢谢你们

用Trition -100可以洗涤任何包涵体吗？会不会有什么影响？

谢谢！

xzyzb wrote:

用Trition -100可以洗涤任何包涵体吗？会不会有什么影响？

谢谢！

曲拉通是一种表面活化剂，润湿及洗涤剂。

在洗涤包涵体的时候是把它当作洗涤剂来用的，也就是主要是把它当作一种去垢剂，用它来洗涤一些杂质或是分子量很大的一些杂蛋白。不能说可以洗涤任何包涵体，因为“任何”包括的太多了。但是我想绝大多数的包涵体还是可以用曲拉通来洗涤的，我也曾经试过用PBS来当作曲拉通来洗涤，效果也还可以，所以说曲拉通的洗涤只是一个可有可无的过程，对于整个包涵体蛋白的纯化来说不是很主要的一个过程。

看了些资料，发到自己的帖子上面，呵呵。

菌体/细胞裂解法：

一、反复冻融法：

1、将细胞在-20度以下冰冻，室温融解，反复几次，由于细胞内冰粒形成和剩余细胞液的盐浓度增高引起溶胀，使细胞结构破碎。

2、至少3次以上冻溶。

3、IFCC推荐法：

收集细胞悬液，4℃低温离心（3000rpm，5min），弃上清，加入一定量PBS（200ul），轻轻吹打混匀，-200C 冷冻30 min，370C 解冻，如此反复3次，可形成细胞裂解液。 步骤如下：

1） 收集细胞悬液

2）40C 低温离心（3000rpm，5min）

3）弃上清，加入一定量PBS（200ul），轻轻吹打混匀，-200C 冷冻30 min，

370C 解冻，如此反复3次，可形成细胞裂解液。

4、用液氮冻融三四次就可以了，细胞冻住后，取出放37度水浴，溶解后震荡，再冻

二、超声波处理法

1、要设定好超声时间和间隙时间，一般超声时间不超过5秒，间隙时间最好大于超声时间，这些都有利于保护酶的活性。我的实验超声时间5秒、间隙时间10秒、工作次数20次。 注意事项：

1）、一个细胞超声仪可以配备不同尺寸的探头，根据你实验中收集细胞的容器大小选择合适规格的探头。

2）、另外冰浴非常重要，空化效应会局部产热，从而使细胞内酶失活，所以我通常将收集细胞的离心管置于冰盒中。

3）、要设定好超声时间和间隙时间，一般超声时间不超过5秒，间隙时间最好大于超声时间，这些都有利于保护酶的活性。我的实验超声时间5秒、间隙时间10秒、工作次数20次，镜下观察细胞破碎效果很好，供参考。不同细胞实验条件得具体摸索。

4）、最后好好看仪器说明书，探头到液面下的距离及与容器底部的距离都有要求。 2、每个样本超声时间5秒,每个间隔5秒,粉碎5次。

3、100ml菌液离心，用8ml缓冲液悬浮，加8mg溶菌酶，冰浴30min，然后超声处理。750W 40％功率。5秒超声，9秒间隔。超声至少90min。超声完毕后，菌液应该是澄清的，略显油状。

4、综合冻融和超声的方法：

1500g离心，弃除上清。冰上，用小体积PBS重悬细胞。

将重悬液集中，1500g离心浓缩，弃除上清。液氮骤冷。用约5倍体积的PBS缓冲液重悬细胞，并搅拌。

可选择：4℃下超声破碎细胞。加入终浓度为0.25M的KCl，15mM的DTT。4℃下111500g×60min离心裂解液。取出上清。过柱子。

三、渗透法：

冰冷的20 mmol/L Tris-Cl（pH8.0），2.5 mmol/L EDTA处理，冰浴放置10min。 《精编分子生物学实验指南》

四、裂解液处理法：

1、细胞裂解液：50 mmol/L Tris-Cl pH 6.8，100 mmol/L DTT，2% SDS，0.1%溴酚蓝，10%甘油。SDS是阴离子型表面活性剂、极易促溶、强变性作用。

2、在loading buffer加SDS，100度5分钟，是变性方法。SDS与蛋白等量结合，可以通过条带位移判断蛋白大小，考染不会影响结果。

3、如果是做小量菌液，跑PAGE胶看其表达情况的话，可以直接加蛋白loading buffer煮沸5分钟即可，需注意的是上样前要离心12000rpm至少5分钟，然后上样时，枪头别吸最底下的。

4、20毫升细胞裂解液配方:40 μL 0.5M EDTA (PH8.0)，4 ml 10% SDS，1 ml 1M Tris-cl(PH6.8)，14.96 ml 蒸馏水。可以适当加入几种蛋白酶的抑制剂，如PMSF，leupeptin等。 5、检测蛋白诱导：

从培养的不同时期各取出1ml，12000g×1min离心。将沉淀重悬于100ul 1×SDS上样缓冲液（50mM Tris-Cl（pH6.8），100mM DTT，2％SDS，0.1％溴酚蓝，10％甘油）中，100℃加热3min，然后12000g×1min离心。上样15ul，6％SDS-PAGE电泳。

《分子克隆》P826

7、5-10秒离心，弃除上清，用50ul蒸馏水重悬沉淀。加入1ul PMSF，再加入50ul热的2×SDS上样缓冲液（100℃加热）。迅速混匀后100℃加热3-5min。将样品冰上放置（或-20℃放置），然后再溶解，煮沸1min。离心30秒。上样5ul进行SDS-PAGE电泳。

2×SDS上样缓冲液：250mM Tris-Cl，6.2％（w/v）DTT，8％SDS，0.002％（w/v）溴酚蓝，40％甘油。

Purification of GST-Fusion Proteins from E. coli。

我看到你的这个专区很高兴，我正在做这方面的实验，有很多问题想请教你，谢谢。 “Tris缓冲液： 50mM Tris 0.5mM EDTA 50mM Nacl 5%或10％甘油

如果有条件加入1％的甘氨酸或精氨酸和谷胱甘肽会更好些。也可以在其中 加入氧化还原系统，如双型谷胱甘肽、DTT等。

PH理论上是要根据你蛋白的等电点来确定的，应该是比等电点稍高一些。但是PH7.9、8.0我都试过，效果没区别。 ”

关于你提到的Tris缓冲液，请问我用的是20mM Tris，没有加Nacl，有影响吗？甘油有什么作用？

我的蛋白复性后上离子交换柱，无论是阴离子还是阳离子柱，都是大部分穿透，不知是不是复性效果不好造成的。 谢谢！！！急。。。

whitewater wrote:

我看到你的这个专区很高兴，我正在做这方面的实验，有很多问题想请教你，谢谢。 “Tris缓冲液： 50mM Tris 0.5mM EDTA 50mM Nacl 5%或10％甘油

如果有条件加入1％的甘氨酸或精氨酸和谷胱甘肽会更好些。也可以在其中 加入氧化还原系统，如双型谷胱甘肽、DTT等。

PH理论上是要根据你蛋白的等电点来确定的，应该是比等电点稍高一些。但是PH7.9、8.0我都试过，效果没区别。 ”

关于你提到的Tris缓冲液，请问我用的是20mM Tris，没有加Nacl，有影响吗？甘油有什么作用？

我的蛋白复性后上离子交换柱，无论是阴离子还是阳离子柱，都是大部分穿透，不知是不是复性效果不好造成的。 谢谢！！！急。。。

请教不敢当，互相学习吧。

1、关于你提到的Tris缓冲液，请问我用的是20mM Tris，没有加Nacl，有影响吗？ 我觉得影响不会很大。

因为包含体蛋白透析主要是根据透析样品中尿素的浓度差的原理来进行的。其实有文献报道透析的复性率只能达到40％（我对这个数字表示怀疑），所以我认为透析这个过程与其说是复性的过程倒不如说是个纯化的过程。

2、甘油有什么作用？

甘油在整个缓冲体系中起到的是稳定蛋白的作用。还有就是保存蛋白的作用，就像细菌保种的时候要加入甘油一样的，如果你想长时间保存就多加点甘油，如果保存时间较短就少加点。

3、我的蛋白复性后上离子交换柱，无论是阴离子还是阳离子柱，都是大部分穿透，不知是不是复性效果不好造成的。

这个我不敢说，因为在没有纯化蛋白之前我考虑了几种纯化方法，最后选择了HIS纯化柱，没用离子交换这种方法，所以知道的不是很多。就我所知道的给您提点建议吧，希望我没有理解错。

我觉得您的这种情况肯定是跟复性的效果有关系的，而且我觉得多数是跟PH值有关，因为离子交换纯化跟缓冲液的PH值以及你蛋白的等电点有很大关系。以ph7的缓冲液为例,如果你的目标蛋白等电点小于7,呢就带负电荷,用阴离子交换的柱子,如果是大于7,那选择阳离子交换的柱子,如果等电点是7,那上样的缓冲液pH大于它的等电点用阴离子,小于7的用阳离子,如此类推就可以.

关于离子交换我只知道这么多了，呵呵。

建议你还是先看一下相关的资料和教材吧。武大赵俊芳编的＜生物化学实验技术和基本原理＞挺好挺详细的。还有一本冷泉港实验室的蛋白质提取纯化的书也挺好的。具体链接如下： >

还有，既然这种方法不理想为什么不换一种纯化方法试试呢？

谢谢20021108。

我还要摸索很多条件，谢谢你的建议。我试后再和你联系

复性成功与否，应该有特异性的方法。

总之不管是先纯化后复性，还是先复性再纯化，离子交换挂不上柱应该和复性成功与否关系不是特别大，主要原因是你的条件不合适。当然，折叠状态影响电荷分布，但不会改变的特别大。

你的等电点低，应该考虑用阴离子交换，这和你的复性buffer也比较接近。

那么你的样品电导是多少？最好不要超过5ms/cm，根据实验结果在进行调整。电导过高是binding不上的。

pH3上阳离子是不合适的。

试管试验意义不是很大，对于完全未知的蛋白，pH7.0直接挂柱，试不了几次就可以找到biniding的条件，但只是纯化的第一步，怎么分离度更好才是学问。

biosepq wrote:

复性成功与否，应该有特异性的方法。

总之不管是先纯化后复性，还是先复性再纯化，离子交换挂不上柱应该和复性成功与否关系不是特别大，主要原因是你的条件不合适。当然，折叠状态影响电荷分布，但不会改变的特别大。

你的等电点低，应该考虑用阴离子交换，这和你的复性buffer也比较接近。

那么你的样品电导是多少？最好不要超过5ms/cm，根据实验结果在进行调整。电导过高是binding不上的。

pH3上阳离子是不合适的。

试管试验意义不是很大，对于完全未知的蛋白，pH7.0直接挂柱，试不了几次就可以找到biniding的条件，但只是纯化的第一步，怎么分离度更好才是学问。

受益匪浅！

问个关于溶解浓度的问题。

一般大致上是多少的浓度？我现在采用的浓度是1g包涵体（湿重）/ml溶解缓冲液。

jingluo wrote:

问个关于溶解浓度的问题。

一般大致上是多少的浓度？我现在采用的浓度是1g包涵体（湿重）/ml溶解缓冲液。

并无文献上说明具体的比例，说说我的供你参考。

100ml大概能得到0.03－0.05g的包涵体（每次称重都特别不好称，可能是由于每次液体吸的不干净，或是由于天平的误差)。不管得到的是多少我都是加入1.5ml的溶解液（我用的是8M的尿素）后加入15ul的DTT，然后4度过夜，或是室温5小时，效果一直很好。就这样。

我觉得如果不是GST融合蛋白都可以用8M的尿素溶解，而且加多加少不会有很大影响，我们实验室的几个人表达的蛋白都是以包涵体的形式存在的，都是用我上述的方法，效果都一样。

请教：我是用PET-HIS表达蛋白和纯化的，目的蛋白分子量大小为42KD.我是在31° 1mmol/L的IPTG诱导下表达的。表达后蛋白存在于包涵体中。我用6M尿素变性后蛋白都溶解了，然后0.45um过滤后上柱，上柱时发现有结晶析出，好奇怪啊！！我的bingding buffer里也加了6M的尿素了，Elution buffer中没加，20mM咪唑浓度洗脱的，结果什么都没有。是不是我的Elution buffer中没加尿素的缘故？还有说明书上说柱中含有尿素的话低咪唑浓度就可以洗脱了，我的咪唑浓度还需要提高吗？那位战友帮帮我啊。急！谢谢！！！！

cherry126 wrote:

请教：我是用PET-HIS表达蛋白和纯化的，目的蛋白分子量大小为42KD.我是在31° 1mmol/L的IPTG诱导下表达的。表达后蛋白存在于包涵体中。我用6M尿素变性后蛋白都溶解了，然后0.45um过滤后上柱，上柱时发现有结晶析出，好奇怪啊！！我的bingding buffer里也加了6M的尿素了，Elution buffer中没加，20mM咪唑浓度洗脱的，结果什么都没有。是不是我的Elution buffer中没加尿素的缘故？还有说明书上说柱中含有尿素的话低咪唑浓度就可以洗脱了，我的咪唑浓度还需要提高吗？那位战友帮帮我啊。急！谢谢！！！！

战友有几个问题没有说清楚：

你说上柱时出现结晶，是什么地方出现呢？是在柱内还是在EP管中。如果我没记错的话，6M的尿素的冰点好像是－11度，这样如果避免低温的话，应该不会出现结晶。

你的binding里面加的咪唑浓度是多少，binding buffer的咪唑浓度一定要比最低的洗涤buffer的浓度低。

还有一个就是战友出现了重大错误就是在Elution buffer中没有加入尿素。虽然说咪唑和蛋白竞争柱中的镍离子从而达到纯化的目的，但是我试过如果洗涤液中不加入尿素的话而仅仅用PBS是洗不下来的，具体为什么不能理解，猜测可能是由于蛋白不能溶于其他溶液中，所以即使脱离了镍离子也不能被洗涤流出，而是短暂的脱离后又重新结合了。

镍柱纯化要利用一个咪唑剃度来洗脱目的蛋白，而不是仅仅用一个浓度的洗涤液来纯化。低浓度的咪唑是洗不下来的或者说洗下的非常少（没有结合牢固的蛋白）。所以你要加大咪唑浓度，而且要做一个剃度，看一下在哪个浓度你的目的蛋白的洗脱量达到最大而杂蛋白的洗脱量相对最小。 谢谢!!!!!

那洗涤包涵体的洗涤液具体是怎么配制的呢?

另外,我昨天用了盐酸胍洗了,发现用6M洗涤的沉淀和上清在加了上样缓冲液煮了之后都出

现了沉淀,为什么?

这种洗涤后我需要的蛋白到底是在上清还是在沉淀呢?我发现有的在上清,都得在沉淀.

盐酸胍会跟SDS沉淀。

可以将样品稀释6倍再加了上样缓冲液煮了会好一点。

lievans wrote: 谢谢!!!!!

那洗涤包涵体的洗涤液具体是怎么配制的呢?

另外,我昨天用了盐酸胍洗了,发现用6M洗涤的沉淀和上清在加了上样缓冲液煮了之后都出现了沉淀,为什么?

这种洗涤后我需要的蛋白到底是在上清还是在沉淀呢?我发现有的在上清,都得在沉淀.

erwinchen战友说的可以。

我们常用的洗涤液有两个，配方上面我提到了，分别是：

洗涤液A：20mM Tris-Cl(PH8.0) 5mM EDTA 0.5% TritonX-100 洗涤液B：20mM Tris-Cl(PH8.0) 5mM EDTA 2M 尿素

然后就是在8M尿素中溶解过夜，别忘了加点还原剂。之后包涵体就应该溶解了，目的蛋白在上清中，再纯化上清就可以了。

你的那种包涵体的处理方法好像不对。

谢谢战友!

但是我在前面看到过用盐酸胍来洗的啊.我点样的时候发现看不清条带,好多的沉淀沉在底部.将样品稀释6倍的话,那不是更加看不清楚了!

我今天只发现用1M的盐酸胍处理的沉淀中看到了我的目的蛋白,你们说这样的情况可能出现吗?

包含体是可以用盐酸胍来洗，但那只是低浓度的，比如说1M. 绝对不可能有人用6M的盐酸胍来洗，那样包含体都融解了。你还洗啥啊。

将样品稀释6倍的意思是：如果你已经用6M的盐酸胍融解了包含体。那样的溶液是不能直接加上样缓冲液的，因为6M的盐酸胍会跟SDS反应而沉淀掉。

那为了解决这个问题，最简单的方法就是先将样品稀释6倍，然后再加上样缓冲液，然后再煮，然后再点样，这样会好很多，不会有你那种“好多的沉淀沉在底部."现象了。

"我今天只发现用1M的盐酸胍处理的沉淀中看到了我的目的蛋白,你们说这样的情况可能出

现吗?"

本来就应该这样的！！！！！！！

20021108 wrote:

我很同意erwinchen 战友的意见，那位战友的复性方案我也觉得有不妥之处，那么高的盐浓度跟高尿素浓度有什么区别？？而且周期太长了，如果有两次没有优化好的话，半个月就没有了，不太值得试，如果有时间还可以，呵呵。

我当时就在想加盐是不是跟去掉了L-Arg有关，但是后来想应该关系也不会太大吧。还有，最终的溶液中还有EDTA这个对离子交换有影响吗？

反正昨天用含150mM NaCl的样品纯化基本上是没结合上，昨天将盐全部透析掉了，今天做了纯化，不知道结果怎么样。

jingluo wrote:

我当时就在想加盐是不是跟去掉了L-Arg有关，但是后来想应该关系也不会太大吧。还有，最终的溶液中还有EDTA这个对离子交换有影响吗？

反正昨天用含150mM NaCl的样品纯化基本上是没结合上，昨天将盐全部透析掉了，今天做了纯化，不知道结果怎么样。

edta肯定对离子交换有影响。

非常感谢erwinchen 战友,我现在终于搞明白了!!!!!!!

我这里还有个问题,就是我想用跑胶切胶的方法来纯化样品,那么切胶后,怎么样处理胶去注射兔子好呢?需要好多的胶量来注射?

lievans wrote:

非常感谢erwinchen 战友,我现在终于搞明白了!!!!!!!

我这里还有个问题,就是我想用跑胶切胶的方法来纯化样品,那么切胶后,怎么样处理胶去注射兔子好呢?需要好多的胶量来注射?

我们上面有位师兄，他就是切胶免疫的，具体做法有两种：

一个是首先跑两块胶，一块染色，一块不染，然后比对着将目的蛋白切下，然后放入PBS中，在40度左右的水浴中可以将其溶解。

还有一个就是跑一块胶，然后用1M的kcl浸泡，20min左右可见明显乳白色条带，然后将其切下，之后的步骤同上。

具体需要多少胶要根据你胶的上样量来定了，上样多就能多得到一些，上样少就得到的少了，

呵呵，还跟你的蛋白的表达量有关。

哦，我明白了。其实我们实验室有人用过这种方法，但是大部分人是将胶磨碎之后再加水或是PBS溶解，然后注射兔子。

请问你们初次免疫后多久进行加强免疫呢?我看到分子克隆实验指南上说是一个月后,但是我们实验室的好多人都是在一周后就进行加强免疫,检测效价,这样能检测出来吗?

lievans wrote:

请问你们初次免疫后多久进行加强免疫呢?我看到分子克隆实验指南上说是一个月后,但是我们实验室的好多人都是在一周后就进行加强免疫,检测效价,这样能检测出来吗?

免疫间隔时间是重要因素，特别是首次与第二次之间更应注意。一个月之后有点长了，但是一个星期之后我觉得又有点短了。我认为应该这样：

第一次免疫后，因动物机体正处于识别抗原和B细胞增殖阶段，如很快接着第二次注入抗原，极易造成免疫抑制。一般以间隔10～20天为好。二次以后每次的间隔一般为7～10天，不能太长，以防刺激变弱，抗体效价不高。

免疫抗原剂量：首次剂量为300～500μg，首次免疫用完全佐剂。加强免疫的剂量约为首次剂量为1/4左右。每隔一段时间加强免疫一次，加强免疫时用不完全佐剂。

免疫方法我想应该用多点免疫，一来因为兔子较大，二来多点免疫的效果好。是在背部多点免疫，免疫了7、8个点。

第一次后测效价肯定不可行，至少要等一个月之后才能测效价，因为免疫后先出现的时IgM，IgM消失后出现的才时IgG。

请问20021108，8M尿素的配方是怎么样的？另外，洗涤液和溶解液的量是怎么确定的呢？还原剂的量加多少啊？

请问，用8M尿素溶的包涵体以及除去尿素的包涵体溶在PBS里的，应该怎么保存？4度还是-20，蛋白是用来免疫的，要放1~2个月。反复冻融对免疫用的蛋白有影响么？ 谢谢！~

xish8612 wrote:

请问20021108，8M尿素的配方是怎么样的？另外，洗涤液和溶解液的量是怎么确定的呢？还原剂的量加多少啊？

配方的说法有很多种，我跟你说一下我们实验室的配方吧：

8M尿素：

urea：8M Nacl：0.5M Na2po4：20mM nah2po4 ：20mM 调PH值至7.4 PBS：

先配好溶液A和溶液B。

溶液A：0.2mol/LNaH2PO4（27.8g NaH2PO4；或者36.14g 2水合NaH2PO4O溶于1000ml水中）。

溶液B：0.2mol/LNa2HPO4（53.65g 7水合Na2HPO4或者71.7g 12水合Na2HPO4溶于1000ml水中）。

溶液A与B按下表比例混合后，用水稀释至终体积为200ml。

体积A（ml）－－－体积B（ml）－－－pH 87.7－－－－－－－12.3－－－－－－6.0 85.0－－－－－－－15.0－－－－－－6.1 81.5－－－－－－－18.5－－－－－－6.2 77.5－－－－－－－22.5－－－－－－6.3 73.5－－－－－－－26.5－－－－－－6.4 68.5－－－－－－－31.5－－－－－－6.5 62.5－－－－－－－37.5－－－－－－6.6 56.5－－－－－－－43.5－－－－－－6.7 51.0－－－－－－－49.0－－－－－－6.8 45.0－－－－－－－55.0－－－－－－6.9 39.0－－－－－－－61.0－－－－－－7.0 33.0－－－－－－－67.0－－－－－－7.1 28.0－－－－－－－72.0－－－－－－7.2 23.0－－－－－－－77.0－－－－－－7.3 19.0－－－－－－－81.0－－－－－－7.4 16.0－－－－－－－84.0－－－－－－7.5 13.0－－－－－－－87.0－－－－－－7.6 10.5－－－－－－－89.5－－－－－－7.7 8.5－－－－－－－－91.5－－－－－－7.8

7.0－－－－－－－－93.0－－－－－－7.9 5.3－－－－－－－－94.7－－－－－－8.0

然后按所需PH值配制即可。

little83 wrote:

请问，用8M尿素溶的包涵体以及除去尿素的包涵体溶在PBS里的，应该怎么保存？4度还是-20，蛋白是用来免疫的，要放1~2个月。反复冻融对免疫用的蛋白有影响么？ 谢谢！~

反复冻融对蛋白的影响很大，建议你放在-80度的超低温冰箱里更保险一点，而且在存放之前最好能在里面加入一定比例的甘油，如20%，这样对于蛋白的稳定有很大的帮助。还有就是免疫前几天取出一点样品跑个page看一下蛋白是否已经降解。

我用小鼠来免疫，剂量大概是多少啊？

我用小鼠来免疫，剂量大概是多少啊？

红红的小辣椒 wrote:

我用小鼠来免疫，剂量大概是多少啊？

如果是免疫小鼠的话，不论是用来制备单克隆抗体还是检测目的蛋白的抗原性都可以使用与制备单抗一样的免疫方案，当然如果免疫方法不同的话免疫剂量也会随之产生相应的变化。下面简单介绍一下腹腔免疫的免疫剂量：

首次免疫用50ug抗原（可溶性的）溶解于100或150ul的生理盐水或是PBS中然后加入等量的弗氏完全佐剂充分乳化后行小鼠腹腔注射。

两周后，用同样的剂量和同样的抗原行腹腔免疫。有的说这次免疫可以换为弗氏不完全佐剂，个人认为还是完全佐剂好。

三周后用50ug抗原溶解于100或150ul的生理盐水或是PBS中然后加入等量的弗氏不完全佐剂充分乳化后腹腔注射。

两周后50－80ug的抗原加入生理盐水到200ul行腹腔注射，三天后尾静脉取血测效价确定下一步实验方案。

我按着如上配方配的8M尿素，极难溶，怎么回事啊？可以高压吗？

请问：听说疏水填料能够在不去除盐酸胍的情况下纯化蛋白，请问大侠们，这种填料要用什么样的洗脱液洗脱蛋白？

高盐上柱，低盐洗脱

这里的盐可以是NACL，一般为硫氨

红红的小辣椒 wrote:

我按着如上配方配的8M尿素，极难溶，怎么回事啊？可以高压吗？

加入DTT试试，如果实在还是溶不了，试试提高尿素浓度到10M。

试试用6M盐酸胍溶解，效果可能会好一些。

红红的小辣椒 wrote:

我按着如上配方配的8M尿素，极难溶，怎么回事啊？可以高压吗？

红红的小辣椒 wrote:

我按着如上配方配的8M尿素，极难溶，怎么回事啊？可以高压吗？

请试着将溶液置于37度水浴，因为尿素溶解会吸热

有谁做过链亲和素（streptavidin)复性，可以交流一下么，我做3个月了，怎不能成功，***有经验的高手指导，否则毕不了业了。

QQ 78300056

E-mail: [email protected]

mb: [1**********]

majunshuang wrote:

有谁做过链亲和素（streptavidin)复性，可以交流一下么，我做3个月了，怎不能成功，***有经验的高手指导，否则毕不了业了。

QQ 78300056

E-mail: [email protected]

mb: [1**********]

这个确实没做过，期待高手加入讨论。

最近又尝试了新的透析方法，好像问题还是出在除盐这个步骤。

本来已经将最终的透析体系降低到20mM Tris-HCl，而且透析近24小时后检测得率在50％左右。但是在放置了4－5天后再用SDS-PAGE电泳，发现居然蛋白又少了许多，基本上只有之前的1/10，也就是说总得率变成了5％，损失的蛋白大部分都以沉淀出现。难道透析24

小时都不算长吗？

郁闷死了，还没上柱样品就已经稀的要命，再用离子柱能纯化下来多少啊～

majunshuang wrote:

有谁做过链亲和素（streptavidin)复性，可以交流一下么，我做3个月了，怎不能成功，***有经验的高手指导，否则毕不了业了。

QQ 78300056

E-mail: [email protected]

mb: [1**********]

我作过，可以讨论一下，但不知道你复性的要求高不高，活性要达到多少单位？理论活性16.8，如果你要求很高，那真的要毕不了业了

jingluo wrote:

最近又尝试了新的透析方法，好像问题还是出在除盐这个步骤。

本来已经将最终的透析体系降低到20mM Tris-HCl，而且透析近24小时后检测得率在50％左右。但是在放置了4－5天后再用SDS-PAGE电泳，发现居然蛋白又少了许多，基本上只有之前的1/10，也就是说总得率变成了5％，损失的蛋白大部分都以沉淀出现。难道透析24小时都不算长吗？

郁闷死了，还没上柱样品就已经稀的要命，再用离子柱能纯化下来多少啊～

应该还是复性的方案没有优化好，经常会有你说的这种情况，以为复性好了。但其实蛋白很不稳定，放置几天就沉淀

蛋白不稳定是由哪些因素造成的？

因为我是在透析结束后一天做的浓度检测，当时得率是50％，再后面一天也没有很明显的沉淀。

难道沉淀的出现是一个每天积累的过程？

jingluo wrote:

最近又尝试了新的透析方法，好像问题还是出在除盐这个步骤。

本来已经将最终的透析体系降低到20mM Tris-HCl，而且透析近24小时后检测得率在50％左右。但是在放置了4－5天后再用SDS-PAGE电泳，发现居然蛋白又少了许多，基本上只有之前的1/10，也就是说总得率变成了5％，损失的蛋白大部分都以沉淀出现。难道透析24小时都不算长吗？

郁闷死了，还没上柱样品就已经稀的要命，再用离子柱能纯化下来多少啊～

jingluo wrote:

蛋白不稳定是由哪些因素造成的？

因为我是在透析结束后一天做的浓度检测，当时得率是50％，再后面一天也没有很明显的沉淀。

难道沉淀的出现是一个每天积累的过程？

一般复性从24－72小时不等，但是我觉得24小时足够了。透析结束候得到50％左右也属于正常，但是蛋白降解如此快就不正常了。

蛋白的降解因素太多了，包括知道的还有一些不知道的。

我建议你在蛋白的透析液中加入一定体积的甘油，加入多少视保存时间长短而定，如果想长时间保存如6个月或更多，就多加一点，可以加到透析液总体积的50％，相反，如果想短时间保存就少加点，最少也要加到透析液总体积的5％。还有就是一定要在超低温冰箱中保存。我的亲身经历：2006年1月20日透析的蛋白，在－20度的昨天跑胶时已经完全降解，但是同一天透析的蛋白-80度一点没有降解。

透析液总体积的50％？是不是在透析结束后往蛋白溶液里加甘油？

最近实验遇到了大麻烦，说出来大伙帮忙想想法。

实验所用菌株为BL21，载体pMAL-p2X，与MBP融合表达，目的蛋白有三对二硫键。最初的设计思想是想通过MBP的信号肽实现可分泌表达，但实验发现主要是包涵体表达。 菌体超声破碎后12000rpm离心，所获得的沉淀不能很好的贴在离心管底，而是处于部分溶解状态，对沉淀再作如下处理：

1、2M尿素洗涤，pH8.5，12000rpm离心，获得的上清不是澄清透明而是略显混浊，这次的沉淀能够牢固的贴在管底。

2、4M尿素洗涤，pH9.0，12000rpm离心，获得的上清不是澄清透明而是略显混浊，这次的沉淀为半溶状态的冻状物。

3、8M尿素溶解上述2中的沉淀，几乎不见不溶的颗粒，但溶液还是略显混浊。 上述三溶液取样电泳，均见较多的目的蛋白。

对3中的溶液取样调pH至12溶液依然混浊。

0.22um过滤，无法去除混浊物。

考虑到混浊物是多聚体，样品中加入1％SDS和0.2％β-Me，都无法改善。

做上述处理，主要考虑到混浊物是目的蛋白，因为目的蛋白设计了6HIS但不能成功的结合Ni柱。

主要想请教这样几个问题：

1、有没有那位战友也碰上我上述的问题，这种问题是如何解决的？

2、我所描述的包涵体的状态说明了什么问题？

3、对与蛋白溶液混浊有什么好的处理方法？

包涵体形成的机理

包涵体的形成是一个由许多蛋白质参与的极端复杂的动力学过程，依赖于蛋白质的折叠速率和聚集速率，并且与蛋白质的合成和降解程度相关。强的表达系统，高的诱导剂浓度，相对较高的培养温度常常造成包涵体的形成。除了外界因素，包涵体的形成依赖于蛋白质特异的折叠行为，而不是蛋白的通常特性，如大小，融合标签，相对的疏水性。

尽管如此，限制折叠速率的结构特性，如二硫键的形成常常是含有二硫键蛋白质正确折叠的限速步骤（并不绝对，因为有些蛋白质二硫键的破坏并不影响其功能），富含二硫键的蛋白质具有更为复杂的结构，当高水平表达时，由于大肠杆菌细胞质是一个偏还原性的环境，蛋白质容易形成错配的二硫键，这常常是包涵体形成的主要原因。

膜蛋白具有暴露的疏水区，表达时易于聚集形成包涵体，也有可能由于降解或对细胞的毒性作用使得表达水平极低。蛋白质的糖基化可以影响到蛋白质的折叠行为和溶解性，当它们在原核系统进行表达时，也容易聚集。

防止包涵体常用的方法

使用中等强度或弱的启动子，低温培养，有限的诱导，优化培养基条件，进行融合表达，与伴侣分子和折叠酶共表达，表达定位于不同的空间，选择突变的菌株或其他的原核表达系统。

需要强调的是在培养细菌时，在培养基中加入5％的乙醇可以起到一定的防止包涵体产生的作用。

对比另外一篇文章：

减少包涵体形成的策略

1. 降低重组菌的生长温度，降低培养温度是减少包涵体形成的最常用的方法，较低的生长温度降低了无活性聚集体形成的速率和疏水相互作用，从而可减少包涵体的形成。

2. 添加可促进重组蛋白质可溶性表达的生长添加剂，培养E.coli时添加高浓度的多醇 类、蔗糖或非代谢糖可以阻止分泌到周质的蛋白质聚集反应，在最适浓度范围内添加这些添加剂不会影响细胞的生长、蛋白质的合成或运输，其它促重组蛋白质可溶性表达的生长添加剂还有乙醇（诱导热休克蛋白的表达）、低分子量的巯基或二硫化合物（影响细胞周质的还原态，从而影响二硫键的形成）和NaCl。

3. 供给丰富的培养基，创造最佳培养条件，如供氧、pH等。

用原核表达系统表达蛋白，很容易遇到包涵体问题。了解包涵体的性质及显微镜照片，请参考“蛋白纯化专题：包涵体产生及性质介绍”。

要解决包涵体问题，无非是有以下几种选择：

①表达系统不变，尝试不同的诱导表达条件，比如降低IPTG浓度（0.1mM~1mM），降低培养温度（25℃、16℃、12℃、4℃？），缩短培养时间，在菌液OD值偏低时就加入IPTG进行诱导等等；

②重新构建表达载体，包括换载体和改变蛋白标签的位置，一般来讲换载体的成功率不高，如pET20b换成pET22b或pET28a，换来换去不会有明显改善，可以尝试用共表达载体，也可以尝试将比如His标签从蛋白的N端转移到C端（或是C端到N端）；

③培养、诱导、表达时加入添加剂（如蔗糖、醇类，eg. 乙醇1%~5%，聚乙二醇，甘油等）或改变培养基（如TB培养基、2×YT培养基）；

④更换表达系统，如用酵母表达系统或昆虫细胞表达系统；

⑤在包涵体情况严重但上清中也存在可溶的目的蛋白时，不如扩大培养量，从上清中提取比重较低的上清；

⑥放弃。

关于蛋白诱导表达、蛋白纯化、和避免包涵体的方法，可以参考下面两篇文章： 蛋白表达与纯化总结PPT 包涵体形成的机理及防止办法

当上面介绍的这些方法都不奏效时，就只好采用从包涵体复性的方法来纯化蛋白了。复性的实验做起来比较繁琐，而且最终产率比较低。如果是新手，一切都要从头摸索，这将是一件费时费力且未必有满意结果的事情。其实，可能你要复性的这个蛋白，已经有人做过了，方法也成熟了，你完全可以“拿来主义”踩前人的肩膀。就算你要做的蛋白还没有人做过，跟它类似的蛋白或许已经有人做了，那么他的方法对你而言也会有较大的参考价值。怎么知道自己手上的蛋白有没有人做过呢？用的什么方法？结果怎么样？

下面就推荐一个从包涵体复性实验的Protocol库——REFOLD。这个库是澳大利亚MONASH University提供的，包含了1156（截止到2009.1.15）个条目，其中蛋白755种。检索这个库时，可以通过“蛋白家族”“结构分类”“物种”“复性方法”来分类细筛。如果不是很清楚自己蛋白的家族或结构，可以选择直接Blast，来找到和自己蛋白最相似的蛋白的复性Protocol。REFOLD可以免费注册，注册后你可以保存自己的检索历史等。

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蛋白纯化专题：包涵体产生和性质介绍及电镜照片

蛋白质在大肠杆菌中高水平的表达，常常导致形成相差显微镜下可见的细胞质颗粒或包涵体。不单是外源真核蛋白在大肠杆菌中表达时会遇到这种情况，大肠杆菌自身可溶的蛋白过量表达时也会出现包涵体的情况。包涵体产生一般认为是蛋白的不正确折叠折造成的。

最难表达的两组蛋白质是：

1. 胞质蛋白长度大于100个氨基酸残基，有些是有毒性的，通常不稳定；

2. 大的细胞表面蛋白和分泌蛋白跨过大肠杆菌内膜的转运效率不高。

Overexpression of recombinant proteins from strong promoters on multiple-copy plasmids can result in expression levels of up to 40% of the total cell protein. However, in most cases, this results in the formation of insoluble protein aggregates known as inclusion bodies, which require further extraction. Inclusion bodies are cytoplasmic granules seen as phase bright under the light microscope, and can contain most or all of the protein of interest. Scanning electron micrographs of E. coli containing inclusion bodies and isolated inclusions ar

e shown below.

(A) Scanning electron micrograph of E. coli containing inclusion bodies. The preparative techniques for electron micrographs have caused the cells to shrink. However, regions of the cells containing rigid inclusion bodies have not been able to shrink, showing clearly the outline of the inclusion bodies. (B) Scanning EM of isolated washed inclusion bodies. Again, it can be seen that the inclusions retain a rigid cylindrical shape.

Inclusion bodies were first reported by Williams et al. on overexpression of promsulm in E. coil. It is not known exactly how they are formed, but it is thought that the protein is partially or incorrectly folded. Formation of inclusion bodies is not only found on overexpression of foreign eukaryotic proteins, but is also seen on overexpression of bacterial proteins that are normally soluble.

The advantage of inclusion bodies is that they generally allow greater levels of expression, and they can be easily separated from a large-proportion of bacterial cytoplasmic proteins by centrifugation giving an effective purification step. Some contaminating proteins are always present that may be associated with inclusion body formation. The major disadvantage of inclusion bodies is that extraction of the protein of interest generally requires the use of denaturing agents. This can cause problems where native folded protein is required, since refolding methods are not always 100% effective and may be difficult to scale-up.

Some inclusion bodies can be solubilized by extremes of pH and temperature, but most require strong denaturing agents. Certain proteins, such as DNase I, can be refolded after solubilization with SDS, but detergents are difficult to remove from most proteins and can interfere with subsequent refolding. The most commonly used solubilizing agents are water-soluble chaotropic agents, such as urea and guanidin

ium hydro-chloride, which are more compatible with protein refolding. Most inclusions will be soluble in 8M urea, and a reducing agent, such as DTT, is generally required in order to prevent the formation of disulfide bonds between aggregates or denatured polypeptide chains.

以上英文资料摘自：

Methods of Molecular Biology. Vol.59. Protein Purification Protocols