猪肉中瘦肉精的检测

猪肉中瘦肉精的检测

摘 要

鉴于盐酸克伦特罗(瘦肉精) 在动物性食品中的残留对人体和国民经济造成了巨大的危害，本文介绍了动物肌肉组织中残留盐酸克伦特罗(瘦肉精) 的几种分析检测方法，并对未来的发展方向作了展望。

关键词：瘦肉精 GC-MS HPLC ELISA

1 引言

瘦肉精是一类药物，而不是某一种特定的药物，任何能够促进瘦肉生长、抑制肥肉生长的物质都可以叫做“瘦肉精”。在中国，通常所说的瘦肉精是指克伦特罗(Clenbuterol，CLB) 【1】，而普通消费者则把此类药物统称为瘦肉精。当它们以超过治疗剂量5—10倍的用量用于家畜饲养时，即有显著的营养“再分配效应”——促进动物体蛋白质沉积、促进脂肪分解抑制脂肪沉积，能显著提高胴体的瘦肉率、增重和提高饲料转化率，因此，β—受体激动剂被大量非法用于畜牧生产，其中最常用的有克伦特罗、莱克多巴胺、沙丁胺醇等。长期食用含有β—受体激动剂残留的食品将对人体健康产生极大的危害，可诱发和加重心率失常病人的病情，引起心室早搏，四肢、脸、颈部骨骼肌震颤；另外还能引起代谢紊乱，对糖尿病人可发生酸中毒或酮中毒【2】。

盐酸克伦特罗(Clenbuteerol，CLB) ，又名克喘素、氨哮素、双氯醇胺，俗名瘦肉精，化学名为α—[ (叔丁氨基) 甲基]—4—氨基—3，5—二氯苯甲醇盐酸盐，分子式为C 12 H18Cl 12N 2O•HCl ，相对分子质量为313.65。

目前，检测瘦肉精残留常用的色谱技术有高效液相色谱(HPLC)、气相色谱—质谱联用法(GC—MS) 、高效液相色谱—质谱联用法(HPLC—MS) 、毛细管电泳法(CE)等。中国已将高效液相色谱法（HPLC ）作为检测饲料中盐酸克伦特罗残留的半确证法， 将GC —MS 法定为确证性方法，主要用于最后确认和仲裁。对于动物性食品，GB/T 5009.192—2003 “动物性食品中克伦特罗残留量的测定”规定的第一法为气相色谱—质谱法，第二法为高效液相色谱法，第三法为酶联免疫法。下面将会对这三种方法逐一进行说明，并简单介绍毛细管电泳法（CE ）【3】。 2 动物性食品（猪肉）中盐酸克伦特罗的检测方法

2.1 气相色谱—质谱法(GC—MS)

GC —MS 法优点是把色谱高效快速的分离效果和质谱高灵敏度的定性分析有机结合起来，能在多种残留物同时存在的情况下对某种特定的残留物进行定性、定量分析，而且具更高的检测极限。GC —MS 法与HPLC 法相比，检测灵敏度更高，假阳性率更低【4】。下面将以岛津公司采用的GC —MS 法检测瘦肉精为例，对仪器与试剂的选择、样品的处理方法等方面进行介绍。

2.1.1仪器与试剂

仪器：岛津GCMS —QP2010 Plus；

试剂：盐酸克伦特罗（Clenbuterol ，CLB ）标准品，内标（Clenbuterol —D9， CLB —D9），N ，O —双三甲基硅基三氟乙酰胺（BSTFA ），C18固相萃取小柱（100 mg ， 3 mL）标准溶液的配制：准确称取盐酸克伦特罗和内标的标准品，用甲醇配成浓度为1 mg/mL的标准储备液，放置于4℃冰箱中避光保存，使用时用甲醇稀释成1μg/mL的标准使用液和内标使用液。

2.1.2 分析条件

色谱柱：Rtx —5MS (30 m×0.25 mm×0.25 μm)

进样口温度：220℃

柱温程序：70℃(0.6 min)—25℃/min—220℃(6 min)—25℃/min—280℃(5 min) 恒线速度方式， 柱流量0.9 mL/min

不分流进样，进样时间1 min

接口温度：280 ℃

离子源温度：200 ℃

溶剂切割时间：8 min

检测离子：

CLB ：检测 m/z 86， 187， 243， 262，

CLB —D9：检测 m/z 95， 187， 262

以克伦特罗 (m/z86) 与内标峰 (m/z 95) 的峰面积比校准定量。

2.1.3 样品制备

精密称取(2 ± 0.01) g 己绞碎的猪肉于具塞离心管中，加入4 mL 0.1 mol/L 盐酸溶液，旋涡振荡5 min，超声10 min， 12000 r/min 离心5 min后，倾出上清液，沉淀再分别用0.1 mol/L 盐酸4 mL，2 mL 两次提取，提取方法同上，合并上清液。

将上清液全部上样至C 18 柱，用5 mL 水清洗小柱后，使用0.8 mL 甲醇：20 mmol/L 磷酸溶液=1：1(v/v)的酸化甲醇解析，加磷酸缓冲液调至pH=7，定容至2 mL。将该溶液以0.1 mL/min的流速推过聚（甲基丙烯酸－乙二醇二甲基丙烯酸酯）毛细管整体柱萃取后，用0.2 mL 的甲醇解析，加50 μL 的内标使用液后以氮吹仪浓缩至干。加入100 μL 甲苯和100 μLBSTFA，涡旋混匀30 s，置于微波炉中小火衍生5 min 。衍生反应完成后取出冷却至室温后再加入300 μL 甲苯，充分混匀，待气质联用仪进样。

2.1.4 结论

该法在样品提取后，用C 18 小柱和聚（甲基丙烯酸－乙二醇二甲基丙烯酸酯）

整体柱进一步富集净化，经N ，O —双三甲基硅烷三氟乙酰胺 (BSTFA) 衍生，选择离子监测方式进行气相色谱质谱测定。

该方法具有检测限低、重现性好、回收率高、样品用量少等特点，适合于猪肉样品中盐酸克伦特罗的定性、定量测定。但GC —MS 的缺点是检测过程烦琐、检测时间长、需贵重仪器、难于操作、价格昂贵。

2.2 高效液相色谱法(HPLC) 【5】

HPLC 适合测定热不稳定和强极性的β—激动剂及其代谢产物，而且HPLC 可以与柱前提取、纯化及柱后荧光衍生化反应和质谱(MS)等系统联用，容易实现分析过程的自动化。

HPLC 法【6】中常用的检测器有电化学检测器、紫外检测器。

2.2.1 材料与仪器

甲醇：色谱纯；

试验用水：均为超纯水；

其余试剂：均为分析纯；

盐酸克伦特罗标准品：中国药品生物制品检定所；

盐酸克伦特罗标准溶液： 取盐酸克伦特罗标准品24. 98 mg置于25 mL容量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，配成含盐酸克伦特罗1 mg/mL的标准贮备液，贮于冰箱中，不同浓度的系列标准溶液由标准储备液稀释而得；

Dionex AT330 (美国) 高效液相色谱仪：由P680四元泵、UVD170U 紫外检测器和AT330恒温箱组成；

超声波提取器( SB25200BTD) ；

离心机(6 000 r/min) ；

DSY22型电热恒温水浴锅。

2.2.2 色谱条件

色谱柱采用Diamonsil ODS2C18 柱( 5 μm ， 150 mm ×4. 6 mm I. D) ；检测波长为244 nm； 流动相甲醇∶水=26 ∶74；流速1. 0 mL /min； 柱温30 ℃；进样量20μL 。

2.2.3 样品制备

取10 g绞碎肉试样，加0. 1 mol/L高氯酸20 mL 匀浆，超声提取20 min， 80℃ 加热30 min， 冷却后离心(4 000 r/min) 15 min。沉淀加0. 1 mol/L高氯酸5 mL 洗涤、离心，将上清液合并，用1 mol/L氢氧化钠调pH 至11，加入25 mL 乙醚，振荡提取20 min ，回收有机相，再用20 mL 乙醚重复萃取2次，合并有机相，蒸发至干。用0. 1 mol/L HC1溶解，纯水定容至10 mL。

2.2.4 结论

目前，中国已将HPLC 法作为检测CLB 残留的半确证性方法，最低检测限范围为1～15ng/g，其优点是专属性好、选择性强、检测精确度较高，而且假阳性率低，与GC —MS 法相比样品不必衍生【7】；缺点是样品处理时间长，检测

过程烦琐、难于操作，需贵重仪器，在实际应用中受到一定的限制【8】。

2.3 酶联免疫吸附法(ELISA）

目前，检测CLB 较高效的免疫分析技术是ELISA 技术。早在1992年，Oriundi 就通过ELISA 法对尿液和血清中的β—兴奋剂残留进行直接分析，该方法既适于实验室大量样品的检测，也适于屠宰场地少量样品的迅速检测【9】。目前，英国的Randox Laborato—ries Ltd和德国的r —biopharm 公司均开发出了检测肉品、饲料中CLB 残留的ELISA 试剂盒。中国在应用EIA 检测CLB 方面的研究起步晚，但近几年取得了明显的进展，目前已有几种试剂盒研制开发成功【10】。

2.3.1 测定原理

“瘦肉精”（克仑特罗）竞争酶标免疫检测的基础是抗原抗体反应。酶联板的微孔包被有针对兔抗克仑特罗特异性抗体的羊抗体【11】（第2抗体）。加入兔抗克仑特罗特异性抗体（第1抗体）与第2抗体结合而被固定，洗涤后加入标准液或样品溶液与酶结合物（酶标记抗原），标准液或样品中的游离抗原与酶标抗原竞争兔抗克仑特罗特异性抗体上有限的结合位点【12】。通过洗涤除去没有与特异性抗体结合的酶标抗原，加入酶基质（过氧化脲）和发色剂（四甲基联苯胺）并孵育，结合到板上的酶标记物将无色的发色剂转化为蓝色的底物。加酸终止反应后，颜色由蓝色转变为黄色。【13】在单波长450纳米处测吸光度，吸收光强度与样品中的克仑特罗浓度成反比。

2.3.2 样品制备

取粉碎的肉样5克，与25毫升50 mmol/L HCl混合，振荡1.5小时。称6克均质物，加入离心管中。10~15℃条件下4 000转/分钟或更高的转速离心15分钟。转移上清液到另1个离心管中，加300微升1摩尔/升氢氧化钠混合15分钟。加入4毫升500毫摩尔/升磷酸二氢钾缓冲液（pH 值3.0），简单混合，并在4℃保存至少1.5小时或过夜。10~15℃条件下4 000转/分钟或更高的转速离心15分钟。分离全部上清液，使其升至室温，然后用C 18柱纯化【14】。

C 18柱纯化样品必须在室温条件下，并严格控制过柱时流速。用3毫升甲醇洗涤柱子，控制流速为1滴/秒。用2毫升洗涤液（50毫摩尔/升磷酸二氢钾缓冲液pH 值3.0）洗涤柱子。将肉样的全部上清液进柱，控制流速为每4秒1滴。用2毫升洗涤液，洗涤柱子，流速为1滴/秒。用正压除去残留的流体并用空气或氮气吹2分钟，干燥柱子。用1毫升甲醇洗脱样品，控制流速为每4秒1滴。在50~60℃并在弱空气或氮气流下完全蒸发甲醇溶剂【15】。用1毫升蒸馏水溶解干燥的残留物，取20微升进行分析。取10克饲料样品，用10毫摩尔/升盐酸溶解，连续震荡10分钟，用滤纸过滤，在滤液中加入120微升1毫摩尔/升氢氧化钠进行中和，检查pH 值，用氢氧化钠控制pH 值在6.5~7.5之间，取上清液20微升进行分析，稀释倍数为25。

2.3.3 测定步骤

所有试剂及样品在开始检测前必须回升至室温，测定操作在20~24℃下进行。用盒中缓冲液以体积1∶10的比例稀释实际用量的克仑特罗抗体浓缩液，稀释前混匀抗体，不要猛烈振荡。取出试验需要数量的微孔板条，足够标准品和样品，标准品和样品做2个平行试验，记录标准品和样品的位置。剩余的微孔板条

放进原锡箔袋中并且与提供的干燥剂一起重新密封，2~8℃冷藏。

每个微孔底部加100微升稀释后的抗体溶液，室温孵育微孔板15分钟，避

免光线照射。孵育的同时进行酶标记物的稀释，洗板，甩出孔中液体，将微孔架倒置在吸水纸上拍打，直到纸上无明显水迹（拍打3次），以保证完全除去孔中的液体。

用250微升蒸馏水充入孔中，再次甩掉微孔中液体，并在吸水纸上拍打，重复操作2次。加洗涤水的移液器管尖必须置于微孔上方约0.5厘米处打出洗涤水，避免将板孔中的游离抗体带入洗涤水中。洗板后立即进行下步操作，不要让板孔干燥【16】。加入20微升标准品和处理好的样品到各自的微孔底部，标准品和样品做2个平行实验。加入100微升稀释的酶标记物至微孔底部，轻轻震荡微孔，并在桌面上作圆周运动以混匀。移液器管尖不要接触到孔中的混合物，避免交叉污染。室温孵育微孔板30分钟，避免放置，尽可能每隔10分钟轻轻振荡1次，准备好酶基质，并注意避光放置。

在洗板过程中加洗涤水的移液器置于微孔板上方0.5厘米处打出洗涤水，避免将板孔中的游离酶标记物带入洗涤水中。不要让板孔干燥，迅速加入100微升酶基质到每个孔中，操作步骤要迅速，避免反应时间相差过长。移液器管尖不要接触微孔中的混合物，避免交叉污染。室温暗处孵育微孔板15分钟，暗处避光放置，同时，准备好反应停止液。每孔加入100微升反应停止液，混匀，60分钟内用酶标仪测量450纳米处波长吸光度值【17】。

2.3.4 结论

ELISA 的优点是灵敏度高、操作简便、检测迅速、价格便宜；缺点是仍不能实现现场检测，而且假阳性率高。

故而，ELISA 方法只是一种大范围的筛选方法，它不能起到定性和定量的作用，检测结果出现可疑，可以用其他检测方法进行定性和定量分析。

2.4 毛细管电泳法（CE ）【18】

毛细管电泳法（CE ）非常适用于难以用传统的液相色谱法分离的离子化样品的分离与分析。优点是有很大的灵活性许多分离参数如缓冲液的组成和pH 值毛细管的类型以及所使用的电场的波形都可以调节，操作简便，所需样品量极少，一般只需几纳升。缺点是检测时间仍很长，不能满足在线检测，仪器复杂、缺乏配套的检测器

3 CLB检测技术的未来趋势和发展方向

当前，造成盐酸克伦特罗屡禁不止的原因之一就是国内外检测CLB 的方法、手段还不完善，还没有建立准确、迅速、方便、精确的检测方法。鉴于目前国内外检测CLB 各种方法的进展情况以及CLB 滥用及残留的严峻性，建立一种克服上述各种检测方法缺点的简便、快速、精确、可实现在线检测的CLB 技术势在必行。

生物传感器技术(Biosensor，BS) 【19】和滴金免疫技术(DIGFA)【20】是两种快速、高效的残留物分析技术，如能研究、开发运用到检测生物样品中CLB 的残留可能会产生理想的效果。

纳米材料是非常敏感的化学和生物传感器，固定有能选择性结合靶分子的生物探针的纳米传感器称为纳米生物传感器。它们能和生物芯片、免疫技术、标记

技术等技术手段结合，从而使检测更加高效、简便。与液质联用分析克伦特罗的方法相比，基于碳纳米管的无标记电化学免疫传感器免除了样品分析前的固

相萃取及纯化步骤，使得操作方法更简便。与ELISA 法相比，该传感器同样具有样品处理简单及高能量的优点。此外，该传感器的方法很少受到基质效应的影响，或者至少比在ELISA 方法中的影响小【21】。

纳米金免疫标记技术，是蛋白质等高分子被吸附到纳米金颗粒表面的包被过程，由于金颗粒具有高电子密度的特性，在金标蛋白结合处，在显微镜下可见黑褐色颗粒，当标记物在相应的配体处大量聚集时，肉眼可见红色或粉红色斑点，用于定性或半定量的快速免疫检测方法中【22】。

可以预见的是，在未来一定会有更加灵敏、快捷、方便的检测方法问世，从而使猪肉中瘦肉精的检测问题得到彻底解决。

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