蛋白质起始的+DNA病毒复制机制

３５Ｎｏ．３微生物学杂志　２０１５年６月第３５卷第３期　ＪＯＵＲＮＡＬＯＦＭＩＣＲＯＢＩＯＬＯＧＹＪｕｎ．２０１５Ｖｏｌ．

６５

蛋白质起始的ＤＮＡ病毒复制机制

邢亚丽，司亚运，袁　戈，张　清，姚　勤，陈克平

（江苏大学生命科学研究院，江苏镇江　２１２０１３）

倡

摘　要　ＤＮＡ聚合酶在ＤＮＡ合成过程中需要的引物包括ＲＮＡ引物、ＤＮＡ自我引物和蛋白质引物３种类型。新ＤＮＡ链（如冈崎片段）的复制多是在ＤＮＡ模板上合成一段ＲＮＡ引物，细小病毒利用其基因组末端的反向末端重复序列（ＩＴＲｓ）自我折叠成ＤＮＡ引物，而一些ＤＮＡ、ＲＮＡ病毒及真菌质粒起始复制反应的引物则是蛋白质。以感染原核生物的噬菌体Ｐｈｉ２９和真核ＤＮＡ病毒腺病毒为例，从复制过程所涉及的蛋白质、对复制原点的识别、复制起始反应、新链的延伸、复制终止过程等方面详细阐述ＤＮＡ病毒由蛋白质引发的复制机制，并对已商品化的Ｐｈｉ２９ＤＮＡ聚合酶产品多重置换扩增及单细胞测序等的应用以及基于噬菌体Ｐｈｉ２９蛋白质起始的最小复制系统体外扩增异源ＤＮＡ等最新的应用研究作相关总结介绍。关键词　ＤＮＡ病毒；蛋白质引物；复制起始；基因组扩增机制

中图分类号　Ｑ７５　　　文献标识码　Ａ　　　文章编号　１００５－７０２１（２０１５）０３－００６５－０６ｄｏｉ：１０．３９６９／ｊ．ｉｓｓｎ．１００５－７０２１．２０１５．０３．００１

Ｐｒｏｔｅｉｎ－ＰｒｉｍｅｄＭｅｃｈａｎｉｓｍｏｆＤＮＡＶｉｒｕｓＲｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ

ＸＩＮＧＹａ－ｌｉ，ＳＩＹａ－ｙｕｎ，ＹＵＡＮＹｉ，ＺＨＡＮＧＱｉｎｇ，ＹＡＯＱｉｎ，ＣＨＥＮＫｅ－ｐｉｎｇ

（Ｃｏｌｌ．ＯＬｉｆｅＳｃｉ．，ＪｉａｎｇｓｕＵｎｉ．，Ｚｈｅｎｊｉａｎｇ２１２０１３）

Ａｂｓｔｒａｃｔ　ＤＮＡｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｅｓｓｅｎｔｉａｌｆｏｒｔｈｅｐｒｏｃｅｓｓｏｆＤＮＡｓｙｎｔｈｅｓｉｓｃｏｍｐｒｉｓｅｓＲＮＡｐｒｉｍｅｒ，ＤＮＡｓｅｌｆ－ｐｒｉｍｅｒ，ａｎｄｔｅｄｗｉｔｈｔｈｅｓｙｎｔｈｅｓｉｓｏｆａｎＲＮＡｐｒｉｍｅｒｏｎｔｈｅＤＮＡｔｅｍｐｌａｔｅ，Ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓｕｓｉｎｇｉｎｖｅｒｔｅｄｔｅｒｍｉｎａｌｒｅｐｅａｔｓ（ＩＴＲｓ）ａｔｓｔａｒｔｉｎｇｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎｒｅａｃｔｉｏｎｗｉｔｈａｐｒｏｔｅｉｎｐｒｉｍｅｒ．Ｉｎｔｈｉｓａｒｔｉｃｌｅ，ｐｈａｇｅＰｈｉ２９ａｎｄｅｕｋａｒｙｏｔｉｃＤＮＡｖｉｒｕｓａｄｅｎｏｖｉｒｕｓｃａｔｉｏｎ，ＤＮＡ－ｐｒｉｍｅｄｅｌｏｎｇａｔｉｏｎａｎｄｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎｏｆＴＰ－ＤＮＡｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ．ＴｈｅｃｏｍｍｅｒｃｉａｌｉｚｅｄＰｈｉ２９ＤＮＡｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｓｅａｒｃｈｅｓｗｅｒｅｓｕｍｍａｒｉｚｅｄａｎｄｉｎｔｒｏｄｕｃｅｄｒｅｃｉｐｒｏｃａｌｌｙｉｎｔｈｉｓｐａｐｅｒ．

ｐｒｏｔｅｉｎｐｒｉｍｅｒｔｈｒｅｅｔｙｐｅｓｏｆｐｒｉｍｅｒｓ．ＴｈｅｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎｏｆｎｅｗＤＮＡｓｔｒａｎｄｓ（ｅ．ｇ．Ｏｋａｚａｋｉｆｒａｇｍｅｎｔｓ）ａｒｅｍｏｓｔｌｙｉｎｉｔｉａ－ｔｈｅｅｎｄｏｆｉｔｓｇｅｎｏｍｅｗｈｉｃｈｓｅｌｆｆｏｌｄｉｎｔｏａＤＮＡｐｒｉｍｅｒ，ｗｈｉｌｅｓｏｍｅｏｆｔｈｅＤＮＡ，ＲＮＡｖｉｒｕｓｅｓａｎｄｆｕｎｇａｌｐｌａｓｍｉｄｓｔｈａｔｉｎｆｅｃｔｅｄｐｒｏｋａｒｙｏｔｅｗｅｒｅｔａｋｅｎａｓｍｏｄｅｌｓａｎｄｅｌａｂｏｒａｔｅｏｎｔｈｅｉｒＤＮＡｖｉｒｕｓｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎｍｅｃｈａｎｉｓｍｐｒｉｍｅｄｂｙｐｒｏ－ｔｅｉｎ，ｒａｎｇｉｎｇｆｒｏｍｐｒｏｔｅｉｎｓｉｎｖｏｌｖｅｄｉｎｔｈｅｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎｐｒｏｃｅｓｓ，ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎｏｆｔｈｅｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎｏｒｉｇｉｎ，ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎｏｆｒｅｐｌｉ－ｐｒｏｄｕｃｔｓａｐｐｌｉｅｄｆｏｒｍｕｌｔｉｐｌｅｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔｗｈｏｌｅｇｅｎｏｍｅａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ（ＷＧＡ）ａｎｄｓｉｎｇｌｅ－ｃｅｌｌｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ，ａｍｐｌｉｆｉｃａ－ｔｉｏｎｏｆｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓＤＮＡｗｉｔｈａｍｉｎｉｍａｌｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎｓｙｓｔｅｍｂａｓｅｄｏｎｐｈａｇｅＰｈｉ２９ｉｎｖｉｔｒｏａｎｄｏｔｈｅｒｎｅｗａｐｐｌｉｅｄｒｅ－Ｋｅｙｗｏｒｄｓ　ＤＮＡｖｉｒｕｓ；ｐｒｏｔｅｉｎｐｒｉｍｅｒ；ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ；ｇｅｎｏｍｉｃａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎｍｅｃｈａｎｉｓｍ

　　病毒增殖的方式是自我复制，当病毒进入活

细胞后便发挥其生物活性。病毒的专性寄生性决定其必须侵入易感宿主细胞，依靠宿主细胞的酶系统、原料和能量复制病毒的核酸，借助宿主细胞的核糖体翻译病毒的蛋白质。病毒复制周期包括吸附、穿入、脱壳、生物合成及装配释放５个步骤。病毒大分子合成包括病毒基因组早期基因的表达（转录或翻译）、病毒基因组的复制、病毒基因组

　基金项目：国家自然科学基金项目（３１２７２５０７；３１２７０１９２）；国家重点基础研究发展计划（９７３计划）项目（２０１２ＣＢ１１４６０４）　作者简介：邢亚丽　女，硕士研究生。研究方向为分子病毒学。Ｅ－ｍａｉｌ：ｙａｌｉ＿Ｐｏｒｉｅ＠１６３．ｃｏｍ

　倡通讯作者。女，研究员，博士生导师。从事现代生物学仪器分析（生化仪器）和病毒分子生物学研究。Ｔｅｌ：０５１１－８８７９１７０２，　Ｅ－ｍａｉｌ：ｙａｏｑｉｎ＠ｕｊｓ．ｅｄｕ．ｃｎ

　收稿日期：２０１４－１２－０１；修回日期：２０１５－０１－０３

晚期基因的表达（转录或翻译）３个过程。体内病毒基因组ＤＮＡ的复制需要引物是由ＤＮＡ聚合酶的特性所决定的。ＤＮＡ聚合酶具有的高保真系统，要求在新链的延伸过程中ＤＮＡ聚合酶的上游位置一定要互补形成双链（可以是ＲＮＡ－ＤＮＡ）才能继续下游ＤＮＡ的合成。并不是所有ＤＮＡ复制的引物都是ＲＮＡ。①引物是ＤＮＡ。如在某些噬菌体或质粒的滚筒复制方式中，引物的３′－羟基端是由一种特殊的核酸内切酶酶切产生的；又如在酶异源二聚体，然后由ＤＮＡ聚合酶催化形成ｄＮＭＰ和末端蛋白特定丝氨酸残基－ＯＨ基团之间的共价键，后续ｄＮＭＰ持续地添加到新生链的末端，随后ＤＮＡ聚合酶与ＴＰ解离，独自执行延伸反应，直至遇到终止信号，产生２个完整复制的ＴＰ－ＤＮＡ分子后ＤＮＡ聚合酶从每条ＤＮＡ分子上解离下来，与游离的末端蛋白再次形成新的异源二聚体继续起始新一轮复制。

细小病毒单链ＤＮＡ的复制中，ＤＮＡ链的３′端自我折叠产生引物的３′－羟基端；②引物是蛋白质：一种病毒自身编码的蛋白质通过使单个脱氧核苷酸与模板链末端配对而起引物的作用，如腺病毒和枯草杆菌噬菌体Ｐｈｉ２９线性染色体的复制，在部分植物、真菌线粒体的质粒以及酵母的线性质粒中也存在。

１　蛋白质引发的ＤＮＡ复制机制与环形基因组典型的复制叉模式能够完整复制基因组不同ＤＮＡ始ＤＮＡ，需要利用一段，由于ＤＮＡ聚合酶不能从头合成的合成，而一旦位于最末端的引物被降ＤＮＡ／ＲＮＡ分子作为引物起

解，一小段未复制的单链ＤＮＡ区域将会保留在染色体的末端ＤＮＡ确保染色体末端的完整性分子持续性缩短，经过多轮（ＤＮＡ末端复制问题复制最终将导致子代，避免线性染色体滞后

）。因此为链末端基因组遗传信息的丢失，线性基因组机体

构建了不同的复制策略来解决这一问题［１］

。其中动物病毒（如腺病毒和人体Ｂ型肝炎病毒即乙肝病毒），细菌噬菌体（如感染革兰阳性菌枯草芽胞杆菌的Ｐｈｉ２９、φ１５、ＰＺＡ、ＰＺＥ、Ｎｆ、Ｍ２、Ｂ１０３、ＧＡ－１，感染肺炎链球菌的Ｃｐ－１，感染革兰阴性菌大肠埃希菌的ＰＲＤ１），线粒体质粒，线性染色体，链霉菌的质粒［２］

，以及一些感染古生菌的病毒（如晕病毒［３］

），都具有位于其线性染色体末端的由反向末端重复序列（ＩＴＲｓ）和一个末端蛋白（ＴＰ）组成的复制起点。末端蛋白能够为线性染色体末端起始的ＤＮＡ复制提供所需的特定丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸－ＯＨ基团，从而规避末端复制问题。以蛋白质为引物的复制机制即所谓的ｍｅｃｈａｎｉｓｍ基因组中，复制起始时先形成一个ｏｆＤＮＡｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ”，普遍存在于线性“ｐｒｏｔｅｉｎ－ｐｒｉｍｅｄＴＰ－ＤＮＡ聚合２　复制机制（２种典型模式）

腺病毒（Ａｄ）病毒粒子结构是无囊膜的正二十面体，由２５２个颗粒组成，几何排列成２４０个非顶角六邻体和ＤＮＡ有１（个ｄｓＤＮＡ１２个五邻体，基因组为线性双链１００～），１６５大小约为ｎｔ的反向末端重复序列２５～３６ｋｂ，其两端各具（ＩＴＲｓ），包含复制起点和包装信号，基因组的５′末端共价结合着一个末端蛋白ＴＰ。感染易感细胞后，病毒

粒子在细胞质中脱去外壳，其核心进入细胞核释

放出病毒ＤＮＡ［４］

。的烈性噬菌体Ｐｈｉ２９是一种感染革兰阳性菌枯草芽胞杆菌

。Ｐｈｉ２９ＤＮＡ双链线性基因组长约１９．３ｋｂ，包括一个６碱基（３′－ＴＴＴＣＡＴ）的反向末端重复序列（ＩＴＲｓ）和一个大小约３１ｋｕ的末端蛋

白ＴＰ，通过位于丝氨酸Ｓｅｒ２３２

和５′－ｄＡＭＰ（起始核苷酸）之间的磷酸酯键共价连接到其２个５′末

端［５］

，形成最小复制起点。２．１　复制相关蛋白质腺病毒基因组的复制由早期基因Ｅ２转录单元编码的３种病毒蛋白联合作用完成，分别是前末端蛋白ＤＮＡ（ｐＴＰ）、腺病毒ＤＮＡ聚合酶（Ａｄｐｏｌ）物，Ａｄｐｏｌ结合蛋白将ｄＣＭＰ（ＤＢＰ运输至）。ｐＴＰｐＴＰ作为复制起始的引和处，随后ｐＴＰ和ｐｏｌ形成的异源二聚体结合到复制核心区域ＤＢＰ因组结合到双链，促进复制起始ＤＮＡ，同时也是延伸反应所必需上以覆盖整个ＡｄＤＮＡ，大量

基的，核因子ＮＦⅠ／ＣＴＦ１和ＮＦⅢ／Ｏｃｔ－１随后结合到ｏｒｉ的辅助区域，增强ＤＮＡ复制起始，ＤＢＰ还具有增强核因子作用的功能，核因子ＮＦⅡ具有拓扑异构酶活性，能协助解链过程释放拓扑压力，是

病毒基因组合成必需的［６－７］

。码的蛋白质共同完成Ｐｈｉ２９基因组的复制同样由噬菌体基因组编，包括ＤＮＡ聚合酶ｐｏｌ、末

端蛋白ＴＰ、单链结合蛋白ＳＳＢ和双链结合蛋白ＤＢＰ（Ｐ６）。Ｐｈｉ２９ＴＰ包括亲本ＴＰ（ｐａｒｅｎｔａｌＴＰ）和引物ＴＰ（ｐｒｉｍｅｒＴＰ）两种，共价连接在ＤＮＡ末端的ＴＰ分子称为亲本ＴＰ，而与ＤＮＡｐｏｌ形成复合物中的ＴＰ称为引物ＴＰ，担任复制起始的引物；核蛋白复合物ＤＢＰ能促进后随链的打开，存在起始核苷酸ｄＡＴＰ的条件下由Ｐｈｉ２９ＤＮＡ聚合酶催化还能促进形成ｄＡＭＰ与ＴＰ特定丝氨酸残基上－ＯＨ基之间的共价键，而噬菌体编码的ＳＳＢ能结合到被链置换出来的单链上维持其单链结构的稳定性，而后在延伸反应中再逐渐被解离

［１］

下来。

２．２　复制起点ｏｒｉ

腺病毒有效的ＤＮＡ复制起始需要位于病毒基因组末端的ＩＴＲｓ上的特异末端核苷酸序列，以及与ＤＮＡ５′末端共价连接的ＴＰ。Ａｄ２的ｏｒｉ由必需的核心区域以及辅助区域组成，ＩＴＲｓ末端的１８ｂｐ被定义为核心区域，代表最小的复制起点，序列５′－ＡＴＡＡＴＡＴＡＣＣ－３′（９～１８ｂｐ）在所有人类腺病毒中是保守的，同时该序列也是ｐＴＰ／ｐｏｌ的结合位点，ＮＦⅠ／ＣＴＦ１的ＤＮＡ结合位点位于辅助区域２３～３８ｂｐ之间，ＮＦⅢ／Ｏｃｔ－１的ＤＮＡ识别位点（３９～４９ｂｐ）位于ＮＦⅠ结合位点的末梢，识别位点包括部分保守

［７］

的核苷酸序列５′－ＴＡＴＧＡＴＡＡＴＧＡ－３′（图

１）。

图１　腺病毒ＤＮＡ复制起点的结构和排布示意图

Ｆｉｇ．１　ＳｔｒｕｃｔｕｒｅｏｆＡｄｅｎｏｖｉｒｕｓｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎｏｒｉｇｉｎ

结合位点位置：ＰＴＤ／ｐｏｌ位于９～１８ｂｐ处，ＮＦⅠ位于２３～３８ｂｐ处，ＮＦⅢ／Ｏｃｔ－１位于３９～４９ｂｐ处

Ｂｉｎｄｉｎｇｓｉｔｅ：ｐＴＰ／ｐｏｌ（９～１８ｂｐ），ＮＦⅠ（２３～３８ｂｐ）ａｎｄＮＦⅢ／Ｏｃｔ－１（３９～４９ｂｐ）

　　Ｐｈｉ２９早期基因Ｅ６的产物ＤＢＰ优先地结合

到Ｐｈｉ２９ＤＮＡ末端，每２４个核苷酸结合１个ＤＢＰ，在特定阶段对激活ＤＮＡ复制起始至关重［８］

要，该蛋白质是一种组蛋白样蛋白，能够自组装成环形寡聚物，进而产生右手螺旋的双螺旋细［９］

丝，这些细丝会形成一个脚手架紧紧包裹ＤＮＡ右手超螺旋，从而抑制其正超螺旋，同时能帮助打开ＤＮＡ末端，协助ＤＮＡ聚合酶／引物ＴＰ形成的异源二聚体识别复制起点从而激活ＴＰ－ＤＮＡ复制起始，ＤＢＰ的二聚体形式是其与ＤＮＡ结合过程中的活性形式。２．３　复制起始反应

感染易感细胞后，腺病毒病毒粒子在细胞质中脱去外壳，其核心进入细胞核释放出病毒ＤＮＡ，编码Ａｄｐｏｌ、ｐＴＰ和ＤＢＰ的Ｅ２基因转录和表达后便起始ＤＮＡ的复制。产生的大量ＤＢＰ结合到ｄｓＤＮＡ上覆盖腺病毒基因组，同时可提高核因子ＮＦⅠ对其识别位点的亲和性，Ａｄｐｏｌ和ｐＴＰ形成一个异源二聚体，ＮＦⅢ的ＰＵＯｈｄ结构域与

ｐＴＰ、ＰＯＵｓ结构域与复制起点相互作用将ｐＴＰ／Ａｄｐｏｌ异源二聚体募集到其结合位点ｄｓＤＮＡ

［１０］

ＩＴＲｓ的核心区域上，核因子ＮＦⅠ／ＣＴＦ１和ＮＦⅢ／Ｏｃｔ－１结合到ｏｒｉ的辅助区域以增强ＤＮＡ复制的起始，于是复制前起始复合物形成，之后起始区解链暴露ｓｓＤＮＡ作为ＤＮＡ合成的模板起始ＤＮＡ的复制。

Ｐｈｉ２９ＴＰ－ＤＮＡ复制的第一步是由２个病毒粒子编码的蛋白质引物ＴＰ和Ｐｈｉ２９ＤＮＡｐｏｌ形成的异源二聚体识别包含ＴＰ的基因组末端复制起点，ＤＢＰ（Ｐ６）核蛋白复合物能帮助打开双链促进识别过程并激活起始活性，而Ｐｈｉ２９ＤＮＡ聚合

２３２

酶催化起始ｄＡＭＰ与ＴＰ特定丝氨酸Ｓｅｒ残基－ＯＨ基团之间共价键的形成，进一步起始以ＴＰ为引物的ＤＮＡ复制。２畅３畅１　预延伸：蛋白质－引发ＤＮＡ复制的回跳或滑回机制　异源二聚体识别的前末端蛋白ｐＴＰ的受体丝氨酸定位在第二个ＧＴＡ的对面即在基因组第４～８位碱基上，形成末端残基的α－磷酸

基团、ｄＣＴＰ和ｐＴＰ丝氨酸的β－ＯＨ之间的共价键。然后由Ａｄｐｏｌ催化加入第二、第三个核苷酸结合到ｐＴＰ／ｄＣＭＰ的３′－ＯＨ上形成ｐＴＰ－三核苷酸复合体（ｐＴＰ－ＣＡＴ）。ｐＴＰ固定在ｐｏｌ上的区域会成为路障使ｐＴＰ－ＣＡＴ不能离开活性位点，随后异源二聚体为起始反应变换位置，ｐＴＰ－ＣＡＴ和起始复合物采用一种回跳机制（Ｊｕｍｐ－ｂａｃｋ）回跳３

［１１］

个核苷酸到ｏｒｉ上１～３位的第一个ＧＴＡ上，接着前起始复合物开始解离。

２畅３畅２　蛋白质引发向ＤＮＡ引发的转换　Ｐｈｉ２９ＤＮＡ聚合酶／引物ＴＰ二聚体在反应起始或是滑回后并不立即解离，ＤＮＡ聚合酶分子结合５个核苷酸到引物ＴＰ上同时仍然与ＴＰ呈复合物状态（起始模式），在结合６～９个核苷酸的过程中会经历一些结构变化（转换），最终当第１０个核苷酸结合到新生ＤＮＡ链时ＤＮＡｐｏｌ从引物ＴＰ上解

［１２］

离下来（延伸模式）。结果表明聚合酶需要ＤＮＡ引物的最小长度，继而才能有效地催化ＤＮＡ在三碱基重复序列Ｐｈｉ２９和Ｐｈｉ２９相关噬菌体（如Ｐｈｉ２９ＤＮＡＤＮＡ末端为的末端都存３′－ＴＴＴ…５′），由于模板链的３′末端能通过模板链的下游沟深入到ＤＮＡ聚合酶的催化位点，最终聚合酶占据模板链催化位点的倒数第２个ｄＴＭＰ，这将有助于其指导起始ｄＡＭＰ，与启动典型的聚合反应ＴＰ丝氨酸ＳｅｒｄＡＭＰ的进入，催化起始

２３２

－ＯＨ羟基之间形成磷酸酯键。而要继续ＴＰ－ＤＮＡ全长分子合成，ＴＰ－ｄＡＭＰ起始产物会向后改变一个位置以覆盖模板信息的第１个３′－Ｔ，此重复序列在ＤＮＡ延伸之前允许起始产物ＴＰ－ｄＡＭＰ不对称地易位，与第１个Ｔ碱基配对，这就是所谓的需要２ｂｐ碱基重复的滑回机制（Ｓｌｉｄｉｎｇ－ｂａｃｋ）（图

２）。

图２　蛋白质引发ＤＮＡ复制的Ｓｌｉｄｉｎｇ－ｂａｃｋ或

Ｊｕｍｐ－ｂａｃｋ机制

Ｆｉｇ．２　Ｐｒｅ－ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎｆｏｒｐｒｏｔｅｉｎ：Ｊｕｍｐ－ｐｒｉｍｅｄ－ｂａｃｋＤＮＡｏｒＳｌｉｄｉｎｇｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ

－ｂａｃｋｍｅｃｈａｎｉｓｍ

延伸反应。２．４　ＤＮＡ引发的延伸反应

随着前起始复合物的解离，腺病毒蛋白酶将作用于ｐＴＰ，从ｐＴＰ上释放出Ａｄｐｏｌ，而Ａｄｐｏｌ就会变成一个更为高效的聚合酶，其延伸和校正活性都会得到提升ＤＮＡＣＡＴ链的结合显著增强，持续合成能力也会随着。新生链的合成以ＤＢＰ与合成由非模板链的置换反应完成复合体中ｄＴＭＰ的３′－ＯＨ为引物启动，ｐＴＰＤＮＡ－ＩＴＲｓ制随之开始的碱基配对形成部分双链。复制延伸期及催化链置换合成反应，第二轮，置换链通过ＤＮＡ复过程中，ＤＢＰ结合ｓｓ和ｄｓＤＮＡ是延伸反应所必需的。

一旦起始反应、滑回和由蛋白－引发转换成由ＤＮＡ－引发的步骤完成，Ｐｈｉ２９ＤＮＡ聚合酶将从引物ＴＰ上解离下来，ＤＮＡ聚合酶恢复ＴＰ－ＤＮＡ

复制的功能［１３］

，启动以ＤＮＡ为引物的复制延伸过程ＤＮＡ。与大多数复制性ＤＮＡ聚合酶不同，Ｐｈｉ２９成ＤＮＡｐｏｌ复制能在没有持续合成因子的协助下独自完。由于复制反应起始于ＤＮＡ链的末端又同时耦合着链置换反应，将导致Ⅰ型复制中间体的出现，病毒ＳＳＢ会绑定到被置换出来的单链ＤＮＡ上；当两端的复制叉及聚合酶分子相遇时，Ⅰ型复制中间体分开成２个Ⅱ型复制中间体［１４－１５］，Ⅱ型复制中间体都包含一条完整的Ｐｈｉ成亲本链的复制２９ＤＮＡ分子。。随后ＤＮＡ聚合酶持续延伸完２．５　ＴＰ－ＤＮＡ复制的终止

ＴＰ沟相互作用引物部分当Ａｄｐｏｌ，，使末端全部核苷酸得以复制可能的情况是与到达基因组末端Ａｄ，遇到相反方向的ｐｏｌ模板的结合，随后病毒结构蛋白在细胞核内聚集形成病毒衣壳，病毒的基因组将被包装进去，形成有感染力的病毒颗

粒，并最终裂解宿主细胞释放出去，完成腺病毒的生活周期。

伴随着ＳＳＢ的解离，Ⅱ型复制中间体分子由

ＤＮＡ聚合酶继续延伸，直至Ｐｈｉ２９ＤＮＡ聚合酶遇到位于基因组末端共价连接的ＴＰ分子，最终产生２个完整复制的Ｐｈｉ２９ＴＰ－ＤＮＡ分子。ＤＮＡｐｏｌ

随之脱离ＤＮＡ链，引物ＴＰ经剪切等修饰成为亲

本ＴＰ留在基因组末端，解离下来的ＤＮＡ聚合酶与游离的ＴＰ形成新的异源二聚体继续起始新一轮的复制反应。至今为止ＴＰ－ＤＮＡ的基因组复制终止依然悬而未决，解决这些细节问题将进一步

拓展这一研究的应用范畴。

图３　腺病毒、细菌噬菌体Ｐｈｉ２９复制方式：蛋白质引发的链置换方式

Ｆｉｇ．３　ＳｃｈｅｍａｔｉｃｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎｏｆｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅＰｈｉ２９、ＡｄｅｎｏｖｉｒｕｓＴＰ－ＤＮＡｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ．

３　应　用

以上是对ＤＮＡ病毒中以蛋白质为引物的复

制机制所做的介绍，并且重点剖析了腺病毒、噬菌体Ｐｈｉ２９的复制过程。以蛋白质为引物的复制方式因其快速、准确、高效的明显优势与特点日益受到相关研究者的青睐。

已有应用也最具代表性的重组腺病毒载体如ＴＭ

ＡｄＥａｓｙ包装系统和ＡｄＭａｘ包装系统，其目的基因表达水平高且能降低体内毒性；并可通过口服或通过喷雾、滴注吸收，是基因治疗临床试验中应用最多的一种载体；还可应用于预防和治疗性疫

［１６］

苗的开发；高容量腺病毒载体（ＨＣ－Ａｄ）也被称为“辅助依赖性”（ＨＤ－Ａｄ），缺失了所有病毒编码

［１７］

序列，能作为高滴度空囊型病毒载体起介导基

［１８］

因转移的作用。溶瘤腺病毒使抗癌基因伴随病毒复制表达，能在引发针对肿瘤抗原的免疫应答的同时发挥着病毒治疗和基因治疗的双重功［１９］能。

蛋白质作为引物起始的ＤＮＡ复制是一种高

效的复制模式。在噬菌体Ｐｈｉ２９方面，近年来诞生的全基因组扩增技术（ｗｈｏｌｅｇｅｎｏｍｅａｍｐｌｉｆｉｃａ－ｔｉｏｎ，ＷＧＡ）—多重置换扩增，就是应用了Ｐｈｉ２９持续合成能力等特性

［２０－２１］

ＤＮＡ聚合酶的快速高效、准确校正、链置换及高

，仅需少量ＤＮＡ样品就

［２２］

能高度忠实地复制全部基因组ＤＮＡ，扩增出

１０～１００ｋｂ大小的片段。此外，Ｐｈｉ２９ＤＮＡ聚合酶与其他Ｂ家族ＤＮＡ聚合酶相比又多出２个亚结构域ＴＰＲ１和ＴＰＲ２，能够与ＤＮＡ模板更紧密地结合，使得复制过程更加长久，扩增出的片段更长，提供大量均一完整的全基因组序列，是一种简单、有效的方法，目前该技术已经广泛应用于法医学、遗传研究和临床诊断领域

［２３］

。Ｐｈｉ２９ＤＮＡ聚

［２４］

合酶也已商品化应用于ＤＮＡ测序滚环复制

［２５］

、恒温ｐｒｏ－

ｔｅｉｎ－ｐｒｉｍｅｄＤＮＡ扩增、利用随机引物扩增ＤＮＡ、

、复制ｅｘｔｅｎｄｅｄ－ｒｅｇｉｏｎ，甚至利用

［２６］

Ｐｈｉ２９ＤＮＡ聚合酶可进行无细胞克隆的实验

。

西班牙ＭａｒｇａｒｉｔａＳａｌａｓ实验室已探索到基于噬菌体Ｐｈｉ２９的最小复制系统，这一复制机器仅包括

［１３］ＢｌａｎｃｏＬ，ＢｅｒｎａｄＡ，ＬáｚａｒｏＪＭ，ｅｔａｌ．ＨｉｇｈｌｙｅｆｆｉｃｉｅｎｔＤＮＡ

ｓｙｎｔｈｅｓｉｓｂｙｔｈｅＰｈａｇｅＰｈｉ２９ＤＮＡｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ．Ｓｙｍｍｅｔｒｉｃａｌ８９３５－８９４０．

ｍｏｄｅｏｆＤＮＡｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ［Ｊ］．ＪＢｉｏｌＣｈｅｍ，１９８９，２６４（１５）：

ＤＮＡ复制原点和４种蛋白质（ＤＮＡｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ，

ＴｅｒｍｉｎａｌＰｒｏｔｅｉｎ，ｓｉｎｇｌｅ－ｓｔｒａｎｄｅｄＤＮＡｂｉｎｄｉｎｇｐｒｏ－ｔｅｉｎ，ｄｏｕｂｌｅ－ｓｔｒａｎｄｅｄＤＮＡｂｉｎｄｉｎｇｐｒｏｔｅｉｎ）就可体

外大量扩增异源ＤＮＡ，获得３０倍的扩增系数；此方法同时开拓了相关ＤＮＡ扩增和产生杂交蛋白－

［２７］

ＤＮＡ分子的可能性，成为基础研究、基因治疗和疫苗开发等领域中的重要工具，具较好的发展潜力。参考文献：

［１４］ＧｕｔｉéｒｒｅｚＣ，ＳｏｇｏＪＭ，ＳａｌａｓＭ．Ａｎａｌｙｓｉｓｏｆｒｅｐｌｉｃａｔｉｖｅｉｎｔｅｒ－

ｍｅｄｉａｔｅｓｐｒｏｄｕｃｅｄｄｕｒｉｎｇｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅＰｈｉ２９ＤＮＡｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ［１５］ＩｎｃｉａｒｔｅＭＲ，ＳａｌａｓＭ，ＳｏｇｏＪＭ．ＳｔｒｕｃｔｕｒｅｏｆｒｅｐｌｉｃａｔｉｎｇＤＮＡ

１９８０，３４（１）：１８７－１９９．［１６］

ｍｏｌｅｃｕｌｅｓｏｆＢａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓｂａｃｔｅｒｉｏＰｈａｇｅＰｈｉ２９［Ｊ］．ＪＶｉｒｏｌ，ＡｎｔｏｎＶ．Ｂｏｒｏｖｊａｇｉｎ，ＪｏｒｇｅＧ．Ｇｏｍｅｚ－Ｇｕｔｉｅｒｒｅｚ，Ｈａｖａｌｉｎｖｉｔｒｏ［Ｊ］．ＪＭｏｌＢｉｏｌ，１９９１，２２２（４）：９８３－８９４．

［１］　ＪｅｌｅｎａＫｕｓｉｃ－Ｔｉｓｍａ．ＮＡＲｅｐｌｉｃａｔｉｏｎａｎｄＲｅｌａｔｅｄＣｅｌｌｕｌａｒ［２］　ＳａｌａｓＰｒｏｃｅｓｓｅｓＭ．［ＭｅｃｈａｎｉｓｍｓＭ］．Ｃｒｏａｔｉａｏｆ：ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎＩｎＴｅｃｈ，２０１１．

ｏｆｌｉｎｅａｒＤＮＡｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎｉｎ［３］　ＢａｔｈｐｒｏｋａｒｙｏｔｅｓＣ，Ｃｕｋａｌａｃ［Ｊ］．ＧｅｎｅｔＴ，ＰｏｒｔｅｒＥｎｇ（ＫＮ，ｅｔＹ）ａｌ，．１９９９，２１：１５９－Ｈｉｓ１ａｎｄＨｉｓ１７１．２ａｒｅｄｉｓ－

ｔａｎｔｌｙｖｅｌｖｉｒｕｓｒｅｌａｔｅｄ，，ｓｐｉｎｄｌｅＳａｌｔｅｒｐｒｏｖｉｒｕｓ－ｓｈａｐｅｄ［ｈａｌｏｖｉｒｕｓｅｓＪ］．Ｖｉｒｏｌｏｇｙｂｅｌｏｎｇｉｎｇ，２００６，３５０ｔｏｔｈｅ（１ｎｏ）：－２２８－２３９．

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ｃｏｍ－

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ｃｌｅｏｔｉｄｅｃａｔｉｏｎ：ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅｏｆｄｕｒｉｎｇｍｏｌｅｃｕｌａｒｉｎｉｔｉａｔｉｏｎｏｆａｄｅｎｏｖｉｒｕｓＤＮＡｒｅｐｌｉ－［１２］ｂａｃｋＭｅｎｄｅｚｍｅｃｈａｎｉｓｍＪ，Ｂｌａｎｃｏ［Ｊ］Ｌ．，ＥＭＢＯＳａｌａｓＭＪ，ｅｎｄｓｉｎｖｉｔｒｏｂｙａｊｕｍｐｉｎｇ．１９９４，Ｐｒｏｔｅｉｎ１３（２３）－ｐｒｉｍｅｄ：５７８６－ＤＮＡ５７９２．

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ｕｎｉｑｕｅｓｈｉｒｗａｎｏｆＰｒｏＰｈｙｌａｃｔｉｃ，ｅｔａｌ．ａｎｄＡｄｅｎｏｖｉｒｕｓＴｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ－ＢａｓｅｄＶａｃｃｉｎｅｓＶｅｃｔｏｒｓ［Ｊｆｏｒ］．ｔｈｅＮｏｖｅｌＤｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｇｉｅｓｆｏｒＶａｃｃｉｎｅＤｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，２０１４：２０３－２７１．Ｔｅｃｈｎｏｌｏ－［１７］ＫｒｅｐｐｅｌＦ．Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎｏｆｈｉｇｈ－ｃａｐａｃｉｔｙａｄｅｎｏｖｉｒｕｓｖｅｃｔｏｒｓ［Ｊ］．［１８］ＭｅｔｈｏｄｓＲíｏｓＣＤ，ＭｏｌＯｏｂｏｓｈｉＢｉｏｌ，２０１４，０８９：２１１－Ｈ，ＰｉｅｇｏｒｓＤ，２２９．

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ｎｏｖｉｒｕｓＭｅｔｈｏｄｓｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎＭｏｌＢｉｏｌ，２０１４，１０８９：１１７－：ａｃｔｉｖｉｔｙａｎｄ１３２．

ｉｍｍｕｎｅｒｅｓｐｏｎｓｅｓ［Ｊ］．［２０］ＬｅｉｃｈｔｙＡＲ，ＢｒｉｓｓｏｎＤ．Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅｗｈｏｌｅｇｅｎｏｍｅａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ

ｆｏｒｓａｍｐｌｅｓｒｅｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ［Ｊ］．Ｇｅｎｅｔｉｃｓｔａｒｇｅｔ，ｍｉｃｒｏｂｉａｌ２０１４，１９８（２）ｓｐｅｃｉｅｓ：４７３－ｆｒｏｍ４８１．ｃｏｍｐｌｅｘｎａｔｕｒａｌ［２１］ＫａｍｔｅｋａｒＳ，ＢｅｒｍａｎＡＪ，ＷａｎｇＪ，ｅｔａｌ．Ｉｎｓｉｇｈｔｓｉｎｔｏｓｔｒａｎｄ

ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔｐｒｏｔｅｉｎ－ｐｒｉｍｅｄａｎｄＤＮＡｐｒｏｃｅｓｓｉｖｉｔｙｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｆｒｏｍｔｈｅｃｒｙｓｔａｌｓｔｒｕｃｔｕｒｅｏｆｔｈｅＭｏｌＣｅｌｌ，２００４，１６（４）：６０９－６１８．

ｏｆｂａｃｔｅｒｉｏＰｈａｇｅＰｈｉ２９［Ｊ］．［２２］ＳｉｌａｎｄｅｒＫ，ＳａａｒｅｌａＪ．ＷｈｏｌｅｇｅｎｏｍｅａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎｗｉｔｈＰｈｉ２９

ＤＮＡｐｌｅｓｏｆｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｌｏｗｔｏｅｎａｂｌｅｇｅｎｅｔｉｃｏｒｇｅｎｏｍｉｃａｎａｌｙｓｉｓｏｆｓａｍ－［２３］刘维瑜，金春莲ＤＮＡ．ｙｉｅｌｄ多重置换扩增［Ｊ］．Ｍｅｔｈｏｄｓ——Ｍｏｌ—一种新的全Ｂｉｏｌ，２００８，４３９：１－基因组１８．扩

增技术［Ｊ］．国际遗传学杂志，２００７，３０（４）：２６５－２６８．［２４］ＮｅｌｓｏｎＪＲ，ＣａｉＹＣ，ＧｉｅｓｌｅｒＴＬ，ｅｔａｌ．Ｔｅｍｐｌｉｐｈｉ，Ｐｈｉ２９ＤＮＡ

ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅＤＮＡｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇｂａｓｅｄ［Ｊｒｏｌｌｉｎｇ］．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓｃｉｒｃｌｅａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ，２００２，Ｓｕｐｐｌｏｆｔｅｍｐｌａｔｅｓ：４４－４７．ｆｏｒ［２５］ＪｏｈｎｅＲ，ＭüｌｌｅｒＨ，ＲｅｃｔｏｒＡ，ｅｔａｌ．Ｒｏｌｌｉｎｇ－ｃｉｒｃｌｅａｍｐｌｉｆｉｃａ－

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蛋白质起始的 DNA病毒复制机制

作者：作者单位：刊名：英文刊名：年，卷(期)：

邢亚丽， 司亚运， 袁戈， 张清， 姚勤， 陈克平， XING Ya-li， SI Ya-yun，YUAN Yi， ZHANG Qing， YAO Qin， CHEN Ke-ping江苏大学 生命科学研究院,江苏 镇江,212013微生物学杂志

Journal of Microbiology2015(3)

引用本文格式：邢亚丽.司亚运.袁戈.张清.姚勤.陈克平.XING Ya-li.SI Ya-yun.YUAN Yi.ZHANG Qing.YAOQin.CHEN Ke-ping 蛋白质起始的 DNA病毒复制机制[期刊论文]-微生物学杂志 2015(3)