荧光定量RT-PCR步骤
荧光定量real-time PCR反应步骤
一、RNA 的抽提（捷瑞试剂盒GK3011）
准备：
1. 95%乙醇184ml+ DEPC水至250ml （70%），擦拭台面（量筒、250ml 瓶DEPC 处理）
2. 配置2ml 氯仿/异戊醇（960ul ﹕40ul ）2管，20次
3. 配置RPE Solution液，RPE/无水乙醇（180ul ﹕720ul ）10管，20次
4. 恒温加热器调整到65℃
提取：
1. 细胞（10）消化离心，转移至1.5mlEppendorf 管内，离心，去上清
2.1mlHanks 液稀释、吹散，取25ul 细胞计数（约10/L）结果乘以0.01即细胞量，其余细胞离心，去上清，加入0.5mlTrizol
3.1ml 注射器抽吸，裂解细胞后，加入100ul 氯仿/异戊醇，剧烈震荡混匀30sec ，12000rpm ，5min
4. 上清液转移到另一Eppendorf 管内加入150ul 无水乙醇混匀
5. 将全部溶液（包括沉淀）转移到套放于2ml 收集管内的GenClean 柱内，室温放置2min ，12000rpm ，1min
6. 取出柱子弃去废液，再将柱子放回收集管内加入450ulRPEsolution ，12000rpm ，30sec ，并重复一次
7. 取出柱子弃去废液，再将柱子放回收集管内10000rpm ，30sec
8. 取出柱子，放入Eppendorf 管内，柱内膜中心加入40ulDEPC-H 2O （包装盒内的），65℃，2min
9.12000rpm ，1min ，管内即为RNA 样品，-70℃保存。 96
*10细胞约可提RNA100ug
*1OD260=40mg RNA，浓度=（OD 260-OD 320）×稀释倍数×0.04ug/ul
*RNA的分析定量：测定在260和280nm 的OD 值（TE Buffer稀释），OD 260/280=1.8～2.0视为提取的RNA 纯度很高，小则蛋白质污染，大则RNA 被水解。
*肌肉细胞的trizol 使用量应该加大
二、RT 反应
1. 在microtube 管内加入如下反应液（冰上）
2.65℃ 5min, 冰上急冷（﹥1min ）
3. 再向管内加入如下反应液（冰上）
4. 逆转录反应
1.30℃10min （用Random 6 mers时，用Olig dT省去此步），2.42℃（到50℃之间）45min ，3.70℃15min ，4. 降温到4℃ 6