正交试验法优选金银花中绿原酸水提醇沉工艺的研究
第5卷第1册 宋德花:正交试验法优选金银花中绿原酸水提醇沉工艺的研究 V ol. 5,N o. 1
正交试验法优选金银花中绿原酸
水提醇沉工艺的研究
宋德花 梁运霞 刘广文 杨长志 刘 永 李继昌
(1. 黑龙江畜牧兽医职业学院 黑龙江 双城 150111; 2. 黑龙江出入境检验检疫局 黑龙江 哈尔滨 150001; 31东北农业大学动物医学院 黑龙江 哈尔滨 150030)
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摘 要 目的:优选金银花中绿原酸水提醇沉工艺。方法:采用正交试验法, 以测定金银花中绿原酸提取率作为考核指标。结果:金银花中绿原酸水提醇沉工艺的最佳提取条件为不浸泡, 加水(15+12) 倍量, 煎煮(1+1) h 。结论:该试验绿原酸提取率高, 稳定性好。
关键词 金银花 绿原酸提取率 正交试验 HP LC 法 金银花是一种有着悠久药用历史的中草药。又名双花、银花、忍冬花等, 为忍冬科植物忍冬japoglauca Thunb. 、红腺忍冬L. 、花L. con fusa DC. 解毒, 热、风热感冒、咽喉肿痛、肺炎、丹毒、蜂窝组织炎、痢疾等多种疾病, 有“中药之中的青霉素”之称。《中国(2000年版) 规定其绿原酸含量不得低于兽药典》
1. 5%。作者采用正交试验法对金银花的水提醇沉工
精密称取经110℃干燥至恒重的绿原酸标准品4.3mg , 置50ml 的棕色量瓶中, 加50%甲醇10ml 溶
解, 再加0. 05m ol ΠL pH3K H 2PO 4溶液稀释至刻度, 摇μ匀(浓度86g Πml ) , 作为储备液。取1ml 储备液加μ0. 05m ol ΠL pH3. 0K H 2PO 4溶液稀释10倍(浓度8. 6g Πml ) , 作为应用液。2. 2 供试品溶液的制备
艺进行了优选。按2000年药典下的高效液色谱法测定金银花中绿原酸的含量, 精密称取相当于0. 25g 生药材的干浸膏, 置具塞锥形瓶中, 精密加50%甲醇25ml , 称定重量, 超声处理30min , 放冷, 再称定重量, 用50%甲醇补足减失的重量, 摇匀, 再精密量取5ml 置50ml 棕色量瓶中, 加0. 05m ol ΠL pH3K H 2PO 4溶液至刻度, 摇匀, 用μ孔径为0. 45m 水溶性微滤膜滤过, 注入高效液相色谱仪并测定含量。2. 3 绿原酸含量的测定
2. 3. 1 色谱条件。采用ODS -3色谱柱, 以甲醇-0. 05m ol ΠL pH3K H 2PO 4溶液(35:65) 为流动相, 检测
1 实验材料与仪器
金银花:产地山东巨鹿, 批号050408Π01, 购于双城市新药特药公司; 绿原酸标准品:购于中国药品生物制品检定所(代号0753-200111) ; 甲醇为色谱纯。
美国Agilent1100高效液相色谱仪、自动定量进样器、可变紫外检测器、80-1离心机、K Q3200超声波清洗器、恒温干燥箱、高精密度电子天平(sartorius ,made in w -G ermany ) 、HC -TP11B -10架盘药物天平、西德A LPH A -I -5型真空干燥机、恒温水浴箱、BC D -243G 冰箱。
μ波长327nm , 自动进样量20L ,1. 000ml Πmin 流速, 柱温25℃下测定。
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第5卷第1册
2006年12月 黑龙江畜牧兽医职业学院学报
V ol. 5,N o. 1Dec. 2006
μ图1 绿原酸标准品浓度为8. 6g Πml 高效液相色谱图
2. 3. 2 绿原酸标准曲线的制备。精密吸取浓度为μμμ4. 38. 6g Πml 、g Πml 。用孔径为0. 45m 水溶性微滤膜滤过, 注入高效液相色谱仪并记录色谱图及峰高值。由所得数据进行回归分析, 得回归方程。Y =1. 80308x +0. 11586, r =0. 99955。绿原酸浓度在
μ86g Πml 的标准品溶液0. 5ml 、1. 0ml 、1. 0ml 、2. 5ml 、5ml 分别加入100ml 、100ml 、50ml 、50ml 、50ml 的棕色量瓶中, 加0. 05m ol ΠL pH3K H 2PO 4溶液稀释至刻度, 摇匀。μμμ其浓度分别为0. 43g Πml 、0. 86g Πml 、1. 72g Πml 、
μμ0. 43g Πml ～8. 6g Πml 范围内线性关系良好
。
μ2. 3. 3 8. 6g Πml 标准品溶液, 连续进样6次, 测其峰高值。RS D =0. 66%, 结果表明, 本法精密度较好。
2. 3. 4 稳定性试验。分别用同一标准品溶液和供试
2. 3. 5 重现性试验。取水提工艺样品2相当于金银
花原药材0. 25g 的干浸膏, 精密称定, 0. 0923g 、0. 0918g 、0. 0916g 、0. 0919g 、0. 0909g 。按供试品溶液的
制备制备方法, 测定金银花中绿原酸的含量。RS D =2. 84%。重现性结果较好
。
品溶液, 每隔一定时间进样1次, 结果表明, 标准品溶液和供试品溶液在24h 内稳定。
图2 金银花水提样品2高效液相色谱图
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2. 3. 6 回收率试验。取已知绿原酸含量样2的水提
液至刻度, 摇匀, 用0. 45um 滤膜滤过, 注入液相色谱仪并测定含量。
4
2.3. 8 金银花水提醇沉工艺。按L 9(3) 正交试验
工艺的干浸膏相当于原药材0. 25g 的量精密称定, 共取5份, 分别精密加入绿原酸标准品, 按上述方法测定。0. 0912g 、0. 0914g 、0. 0925g 、0. 0913g 、0. 0908g 。RS D =1. 28%。
2. 3. 7 生药样品绿原酸含量的测定。精密称取粉碎
表, 共设9次实验, 每次都分别称取干燥至恒重的样品50g , 煎煮后合并滤液, 倒入坩埚中,80℃水浴浓缩至相对密度为1. 15～1. 20, 冷却后缓缓加入4倍量95%乙醇, 搅拌均匀后置4℃冰箱过夜, 离心(4000r Πmin ,10min ) 后取上清液倒入坩埚中,80℃水浴浓缩挥
后的样品粉末0. 5g , 置具塞锥形瓶中, 精密加50%甲醇25ml , 称定重量, 超声处理30min , 放冷, 再称定重量, 用50%甲醇补足减失的重量, 摇匀, 再精密量取5ml 置50ml 棕色量瓶中, 加0. 05m ol ΠL pH3K H 2PO 4溶
发乙醇至无醇味,80℃真空干燥, 得干浸膏。
4
表1 水提醇沉工艺正交试验因素、水平表L 9(3)
水平123
A 浸泡时间(h )
00. 51. 0
B 加水量(倍)
12+85+1220+15
C 提取时间(h )
1+0. 51+1+1. 2
3 结果
4
按正交试验因素、水平表L 9(3) , 见表1。共设9
, 测, 并计算绿原酸的2次实验, 表2 试验号123456789
11222333
123123123
C 123231312
D (空) 123312231
含量2. 46%3. 89%2. 90%3. 29%2. 22%2. 13%2. 11%1. 89%3. 65%9. 70%
提取率0. 2540. 4010. 30. 3390. 2290. 2200. 2180. 1950. 376
生药K 1K 2K 3K 1K 3
2
0. 9550. 7880. 7890. 9120. 6210. 623
0. 8110. 8250. 8960. 6580. 6810. 803
0. 6691. 1160. 7470. 4481. 2450. 558
0. 8590. 8390. 8340. 7380. 7040. 696
C =0. 712
K 2
2
2
注:提取率=样品中绿原酸的含量Π生药材绿原酸含量×100%
对表2中金银花样品绿原酸提取率进行方差分析, 结果见表3。
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2006年12月 黑龙江畜牧兽医职业学院学报
V ol. 5,N o. 1Dec. 2006
表3 正交试验优选金银花水提工艺绿原酸提取率方差分析表
误差来源
A B C
离差平方和SS 0. 0066670. 0020. 03830. 0009660. 046004
自由度f
22228
方差S 0. 00333350. 0010. 019150. 000483
F 值6. 9052. 07039. 65
P 值
3
>0. 05
33
误差
总
注:3F 0. 05(2,11) =3. 98; F 0. 01(2,11) =7. 20
4 讨论
4. 1 提取率的影响因素
为2次, 所以我们没有考查煎煮次数对实验结果的影响, 将煎煮次数定为2次。4. 4 验证性试验
从上表可知各因素对提取效果的影响程度依次为C >A >B , 因素C 对试验结果影响极显著(P
精密称取干燥的金银花样品50g , 共6份,3份加12+8倍量水, 另3份加15+12倍量水, 都不浸泡, 提
取1h +1h , 收集提取液, 倒入坩埚中,80℃水浴浓缩至相对密度为1. 15～1. 20, 4倍量95%乙醇, 搅拌均匀后置4℃, 按上述方法测定。838. 76+40. 23%。两者的提取率
素B 对试验结果影响不显著, 可任选其一水平。根据金银花正交试验绿原酸提取率可见, 金银花中绿原酸的含量会因提取时间的过长而明显降低, 浸泡也可降低其提取率, 所以浸泡时间以0h 、提取时间以1+1h 为最佳条件, 加水量可任选一个水平的角度, 应选12+8倍量水为好; 的角度, 我们应选15+12取工艺可选方案2, 次15+12倍量或12+81h +1h 后合并滤液, 倒入坩埚中,80℃1. 15～1. 20, 冷却后缓缓加入4倍量95%乙醇, 搅拌均匀后置4℃冰箱过夜。绿原酸在提取过程中会发生化学变化, 提取时间不宜过长。4. 2 流动相选择
。
参考文献
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工艺的研究. 时珍国医国药,2002,6321-323
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在流动相的选择中, 经反复几次试验摸索, 选择酸性流动相, 因绿原酸为有机酸, 酸性可抑制其电离, 出峰时间早, 峰形稳定, 分离度好。4. 3 煎煮次数
药与临床药理,2003,1(1) 59-61
[6]陈钢, 侯世祥, 胡平等. 金银花提取物中绿原酸的稳定性研
究. 中国中药杂志,2003,3(28) :223-226
一般来说, 不含贵重药材的中草药汤剂提取次数
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