有机污染物的微生物降解
有机污染物的微生物降解――高效脱酚菌的分离和筛选
一、目的要求
学习并掌握分离纯化微生物的基本技能和筛选高效降解菌的基本方法。
二、 基本原理
环境中存在各种各样的微生物，其中某些微生物能以有机污染物作为它们生长所需的能源、碳源或氮源，从而使有机污染物得以降解。本实验以苯酚为例：
3H2H2COOHCOOHCO2+H2O 采样后，在以苯酚为唯一碳源的培养基中，经富集培养、分离纯化、降解试验和性能测定，可筛选出高效降解菌。
三、设备与材料
1、器材
①恒温培养箱 ②恒温振荡器 ③分光光度计 ④蒸馏烧瓶（500mL） ⑤冷凝管 ⑥移液管（50mL、10mL、1mL）⑦容量瓶（250 mL、100 mL） ⑧培养皿（9cm）⑨玻璃珠 ⑩玻璃刮棒 接种耳 酒精灯
2、培养基
营养琼脂(B. R.)
液体培养基
葡萄糖1g，蛋白胨0.5g，磷酸氢二钾0.1g，硫酸镁0.05g，蒸馏水1000ml，调pH为7.2-7.4。分装与250ml锥形瓶中，每瓶50mL或100mL，115℃高压蒸汽灭菌，30min。
3、试剂
苯酚标准液
精确称取分析纯苯酚1.000g，溶于蒸馏水中，稀释至1000mL，摇匀。此溶液每mL含苯酚1mg。取此溶液10mL，移入另一100mL容量瓶，用蒸馏水稀至刻度，摇匀。此溶液的酚浓度为100ppm。
四硼酸钠饱和溶液
称取化学纯四硼酸钠（Na2B4O7）40g，溶于1L热蒸馏水中，冷却后使用。此溶液pH为10.1。 3％ 4-氨基安替比林溶液
称取分析纯4-氨基安替比林3g，溶于蒸馏水，并稀释至100mL。置于棕色瓶内。冰箱保存，可用两周。
2％过硫酸铵溶液
称取化学纯过硫酸铵[(NH4)2S2O8]2g，溶于蒸馏水，并稀至100mL。冰箱保存，可用两周。
10％硫酸铜溶液
称取化学纯硫酸铜(CuSO4)10g，溶于蒸馏水，并稀释至100mL。
9N硫酸溶液
量取化学纯浓硫酸（比重1.84，96％）25mL，缓缓倒入蒸馏水中，，稀至100mL。 无菌水
分装试管，每管9.9mL或4.5mL。
四、实验步骤
1、富集培养
采集活性污泥、生物膜或土样，接种于装有50mL液体培养基和玻璃珠并加适量苯酚的三角瓶中，适温振荡培养。待菌生长后，用无菌移液管吸取1mL专至另一个装有50mL液体培养基并加适量苯酚的三角瓶中。如此连续转接2-3次，每次所加的苯酚量适当增加，最后可得脱酚菌占绝对优势的混合培养物
2、平板分离和纯化
用无菌移液管吸取经富集培养的混合菌液0.1mL，注入9.9mL无菌水中，充分混匀，并继续稀释到适当浓度。
取最后三个稀释管，分别自各管中吸取稀释菌液，滴一滴（约0.05mL）于营养琼脂平板（倒平板时添加适量的酚）中央，每个稀释度做2-3个重复。
用无菌玻璃刮棒把滴加在平板上的菌液推平，盖好皿盖。室温放置，待接种菌液被培养基吸收后，倒置于37℃恒温箱，培养1-2d。
挑选不同形态的菌落，在含适量酚的营养琼脂平板上划线纯化。平板倒置于37℃恒温箱，培养1-2d。
3、转接斜面
将纯化后的单菌落转接至补加适量酚的营养琼脂试管斜面，于37℃恒温箱培养24h。
4、降解试验
用接种环取各斜面菌苔一环，分别接种于100mL液体培养基中，37℃振荡培养22-24h。
5、测定含酚量
1）绘制标准曲线
取100mL容量瓶7只，分别加入100ppm苯酚标准溶液0，0.5，1.0，2.0，3.0，4.0，5.0mL。于每只容量瓶中加入四硼酸钠饱和溶液10mL，3％4-氨基安替比林溶液1mL，再加入四硼酸钠饱和溶液10mL，2％过硫酸铵溶液1mL，然后用蒸馏水稀至刻度，摇匀。放置10min后将溶液转至比色皿中，在560nm处以试剂空白为参比读取吸光度。根据吸光度和苯酚标准溶液的用量（苯酚mg数），绘制标准曲线。
2. 取经降解的培养液50mL，放入蒸馏烧瓶内，加入10％硫酸铜溶液10mL，9N硫酸溶液10mL，蒸馏水200mL，进行蒸馏。馏液接入250mL容量瓶内。
3. 至馏液达200mL左右时停止蒸馏，用蒸馏水稀至刻度。
4. 移取稀释馏液10mL于100mL容量瓶内，加入四硼酸钠饱和溶液10mL，3％4-氨基安替比林溶液1mL，再加入四硼酸钠饱和溶液10mL，2％过硫酸铵溶液1mL，然后用蒸馏水稀至刻度，摇匀。同时做空白对照。
5. 放置10min后用分光光度计测定吸光度。
6. 由测得的吸光度和绘制的标准曲线查得酚的mg数。
7. 计算酚含量
查得酚的mg数⨯
苯酚（mg/L）=5025010⨯1000
五、实验报告
1. 根据含酚量，求出各株降解菌的脱酚率。
2. 选出高效降解菌
六、注意事项和相关研究进展
注意事项
1. 分离用平板在使用前2-3天倒好，放置于室温下或35℃左右的恒温箱内，使平板表面无水膜。
2. 涂布时，若不更换无菌刮棒，应按稀释倍数从高至低的顺序进行。
3. 涂布后待菌液被平板充分吸收，再倒置于恒温箱培养。
4. 蒸馏时烧瓶内放几颗玻璃珠以防骤沸。