小球藻的玻璃化超低温保存法

植物生理学通讯　　第４０卷　第５期，２００４年１０月599

小球藻的玻璃化超低温保存法

蔡小宁＊　　陈舒泛　　陈俊　　刘少华

南京晓庄学院生命科学系，南京　２１００１７

Cryopreservation of Chlorella vulgaris by Vitrification

CAI Xiao-Ning*, CHEN Shu-Fan, CHEN Jun, LIU Shao-Hua

Department of Life Science, Nanjing Xiaozhuang College, Nanjing 210017

提要　　先用含０．５　ｍｏｌ·L－１甘油和０．４　ｍｏｌ·L－１蔗糖的预处理液处理２０　ｍｉｎ，　然后用含３０％蔗糖＋１５％乙二醇＋１０％二甲基亚砜＋ＢＢＭＧ培养液的玻璃化液处理，在０℃下预冻６０　ｍｉｎ后，将小球藻投入液氮。此法存活率较高，可达到６０．１４％，小球藻种质保存效果较好。通过试验初步建立了小球藻玻璃化法超低温保存的技术程序。关键词　　小球藻；　超低温保存；

玻璃化法

１０年来，随着超低温保存技术的建立和发展，有多种植物的细胞、组织和器官实现了超低温冰冻保存［１］。玻璃化保存法是近年来发展起来的一种保存方法，与其他超低温保存方法相比，具有设备简单、程序简化和冻存效果好等优点，在植物上已经取得很大进展［２，３］。目前，藻类种质的超低温保存技术已受到广泛的重视。迄今为止，绝大多数藻类是采用两步冰冻法保存［４￣７］，采用玻璃化法超低温保存藻类的报道很少［８］。本文探讨玻璃化法超低温保存小球藻种质的技术。离心（转速５００　ｒ·mｉｎ－１，下同），弃去上清液，小球藻沉降于离心管底部，然后分别加入预先配制的不同浓度的预处理液（表１），混匀，于室温下处理２０　ｍｉｎ后再离心。３　　玻璃化液处理

玻璃化液配方为３０％蔗糖＋１５％乙二醇＋不同浓度二甲基亚砜＋ＢＢＭＧ培养液，加入前先放在０￣４℃下预冷，在无菌条件下取代预处理液，悬浮后移入冻存管，于０℃下预冻不同时间后放入液氮中。

４　　化冻和玻璃化保护剂的去除

将在液氮中保存半年后的冻存管取出，立刻放入４０℃恒温水浴中迅速摇动，直到最后一个冰晶消失后移入室温中。化冻后的小球藻在无菌条件下先在０．４　ｍｏｌ稬－１的蔗糖溶液中室温平衡５　ｍｉｎ，然后再在１．２　ｍｏｌ稬－１蔗糖溶液中平衡５　ｍｉｎ，最后转入ＢＢＭＧ液体培养基中培养。培养条件为２７℃、弱光、摇床速度１２０　ｒ·mｉｎ－１，培养４　ｄ。５　　存活率的测定

参照Ｃａｎａｖａｔｅ及Ｌｕｂｉａｎ的方法［１０］，将经过处理的小球藻样品和对照小球藻样品再培养４　ｄ后，用７２２型光栅分光光度计于波长５４０　ｎｍ处测藻液的吸光度。根据预先确定的藻细胞密度（ｙ×1０８

材料与方法

１　　实验用小球藻的准备

小球藻（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ　ｖｕｌｇａｒｉｓ）接种前，所用的液体培养基和容器于１．２　ｋｇ·cｍ－２压力下蒸汽灭菌２０ｍｉｎ。从保存藻种的平板上挑取小球藻，培养于装有５　ｍＬ　ＢＢＭＧ液体培养基（参照　Ｂｏｌｄ’s　ｂａｓａｌ　培养基配方［９］，其中含７５　ｇ稬－１硝酸钠、　１０　ｇ稬－１葡萄糖、１０　ｇ稬－１蛋白胨）的试管中。弱光下（根据我们的试验，在异养培养条件下光照强度对小球藻生长无影响）培养５￣７　ｄ，再将试管种接入５０　ｍＬＢＢＭＧ液体培养基，于弱光下培养至对数期，此为最初的液体种子。培养小球藻时，接入２％的液体种子于５０　ｍＬ培养液中，放在摇床上于２５℃弱光下培养，摇床转速为１２０　ｒ·mｉｎ－１，４￣５　ｄ即可得到实验用的小球藻。２　　预处理液的加入

在室温下分别取２　ｍＬ藻液置于若干离心管中

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个·L－１）和吸光度（ｘ）的直线回归方程：ｙ＝３．４５６ｘ－０．３８９（ｒ＝０．９９６１），可以推算出上述冰冻样品和对照样品在再培养４　ｄ后的藻细胞密度，两者的百分比值即为超低温保存的存活率［６］。

实验重复３次，每处理设置３个平行样品，取平均值。

成［１１］。甘油也是一种常用的冰冻保护剂。我们比较了预处理液中甘油和蔗糖的浓度及组合对玻璃化法超低温保存小球藻存活率的影响，结果（表１）表明，在所试浓度范围内，如果预处理液中不添加甘油和蔗糖，而仅仅作玻璃化液处理的存活率最低，为２９．１１％；预处理液中单加甘油或蔗糖的存活率大幅度提高；预处理液中甘油和蔗糖都添加时，小球藻的存活率则随着甘油浓度的增加而逐渐下降。这表明，玻璃化液处理前，先用含有蔗糖和甘油的预处理液预处理，可大大提高玻璃化法超低温保存的小球藻存活率。以０．５　ｍｏｌ·L－１甘油和０．４　ｍｏｌ·L－１蔗糖的组合中，存活率最高，达到６０．１４％。

结果与讨论

１　　预处理液中甘油和蔗糖的浓度及组合对小球藻存活率的影响

在超低温保存中通常对植物材料进行预处理，预处理过程中通过蔗糖提高胞质浓度，增加抗冻力和抗脱水力，促进降温过程中玻璃化的形

０￣６０　ｍｉｎ，已有报道表明预冻时间对藻的存活率影响极大［４，５］。我们用３０％蔗糖＋１５％乙二醇＋１０％二甲基亚砜＋ＢＢＭＧ培养液的玻璃化溶液处理小球藻后，于０℃下分别预冻不同时间，结果表明，无论预处理与否，小球藻的存活率都以预冻时间为６０　ｍｉｎ时最高（表３）。

较理想的技术程序为：先用含０．５　ｍｏｌ·L－１的甘油和０．４　ｍｏｌ·L－１的蔗糖溶液预处理２０　ｍｉｎ左右，然后加入含有３０％蔗糖＋１５％乙二醇＋１０％二甲基亚砜＋ＢＢＭＧ培养液的玻璃化保护剂，放入０℃冰中预冻６０　ｍｉｎ左右，再投入液氮中保存；保存半年（或以上）后，将冻存管取出，立刻放入４０℃恒

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温水浴中迅速摇动，直到最后一个冰晶消失后移入室温中；化冻后的小球藻在无菌的条件下转入０．４　ｍｏｌ·L－１的蔗糖溶液中室温平衡５　ｍｉｎ，然后再转入１．２　ｍｏｌ·L－１蔗糖溶液中平衡５　ｍｉｎ。此时，小球藻可转入ＢＢＭＧ培养液中再培养，培养条件２７℃，摇床速度１２０　ｒ·mｉｎ－１，培养４　ｄ，即可获得活化的小球藻。

参考文献

１　　　　肖洁凝，黄学林．　茎尖和芽的超低温保存．　生物工程进展，１９９９，

１９（５）：４６￣５１２

王子成，邓秀新．玻璃化法超低温保存柑桔茎尖及植物再生．

７王起华，张恩栋，周春影．藻类种质超低温保存研究概况．植物学通报，２００２，１９（１）：２１￣２９

８Ｄａｙ　ＪＧ．　Ｃｒｙｏ－ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｍｉｃｒｏａｌｇａｅ　ａｎｄ　ｃｙａｎｏｂａｃｔｅｒｉａ．Ｃｒｙｏ－Ｌｅｔｔｅｒｓ，　１９９８，　１（ｓｕｐｐ）：７￣１４

９Ｂｉｓｃｈｏｆｆ　Ｈ，　Ｂｏｌｄ　ＨＣ．　Ｐｈｙｃｏｌｏｇｉｃａｌ　ｓｔｕｄｉｅｓ　ＩＶ．　Ｓｏｍｅ　ｓｏｉｌａｌｇａｅ　ｆｒｏｍ　Ｅｎｃｈａｎｔｅｄ　Ｒｏｃｋ　ａｎｄ　ｒｅｌａｔｅｄ　ａｌｇａｌ　ｓｐｅｃｉｅｓ．　Ａｕｓｔｉｎ：Ｕｎｉｖ　Ｔｅｘａｓ　Ｐｕｂｌ，　１９６３．　Ｎｏ．　６３１８

１０Ｃａｎａｖａｔｅ　ＪＰ，　Ｌｕｂｉａｎ　ＬＭ．　Ｓｏｍｅ　ａｓｐｅｃｔｓ　ｏｎ　ｔｈｅｃｒｙｏｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎｏｆ　ｍｉｃｒｏａｌｇａｅ　ｕｓｅｄ　ａｓ　ｆｏｏｄ　ｆｏｒ　ｍａｒｉｎｅｓｐｅｃｉｅｓ．　Ａｑｕａｃｕｌｔｕｒｅ，　１９９５，　１３６：　２７７￣２９０

１１王君晖，边红武，黄纯农．植物样品包埋脱水法超低温保存的研究进展．植物学通报，１９９９，１６（５）：５８２￣５８６