碳氮代谢测定

谷氨酰胺合成酶（GS ）和谷氨酸脱氢酶（GDH ）是碳氮代谢的关键酶。 淀粉酶，转化酶，硝酸还原酶，

谷氨酰胺合成酶活性测定

原理 谷氨酰胺合成酶（GS ）是植物体内氨同化的关键酶之一，在ATP 和M g 2+ 存在下，它催化植物体内谷氨酸形成谷氨酰胺。在反应体系中，谷氨酰胺转化为γ—谷氨酰基异羟肟酸，进而在酸性条件下与铁形成红色的络合物，该络合物在540nm 处有最大吸收峰，可用分光光度计测定。谷氨酰胺合成酶活性可用产生的γ—谷氨酰基异羟肟酸与铁络合物的生成量来表示，单位μmol·mg －1 protein·h －1 。也可间接用540nm 处吸光值的大小来表示，单位A·mg －1 protein·h －1 。 【仪器与用具】 冷冻离心机；分光光度计；天平；研钵；恒温水浴；剪刀；移液管（2 ml、1ml ）。 【试剂】 提取缓冲液： 0.05mol/L Tris-HCl，pH8.0，内含2mmol/L Mg 2+ ，2mmol/L DTT，0.4 mol/L 蔗糖。称取Tris （三羟甲基氨基甲烷）1.5295g ，0.1245g MgSO 4 ·7 H 2 O，0.1543g DTT（二硫苏糖醇）和34.25g 蔗糖，去离子水溶解后，用0.05 mol/L HCl 调至pH8.0，最后定容至250ml ； 反应混合液A （0.1mol/L Tris-HCl 缓冲，pH7.4）： 内含80mmol/L Mg 2+ ，20mmol/L 谷氨酸钠盐，20mmol/L 半胱氨酸和2 mmol/L EGTA ，称取3.0590g Tris ，4.9795 gMgSO 4 ·7H 2 O, 0.8628g 谷氨酸钠盐，0.6057g 半胱氨酸，0.1920gEGTA ，去离子水溶解后，用0. 1mol/L HCl 调至pH7.4，定容至250ml ； 反应混合液B （含盐酸羟胺，pH7.4）： 反应混合液A 的成分再加入80mmol/L 盐酸羟胺，pH7.4； 显色剂（0.2mol/L TCA, 0.37mol/L FeCl 3 和0.6mol/L HCl 混合液）： 3.3176g TCA（三氯乙酸），10.1021g FeCl 3 ·6H 2 O，去离子水溶解后，加5ml 浓盐酸，定容至100ml ； 40mmol/L ATP 溶液：0.1210g ATP 溶于5ml 去离子水中（临用前配制）。 【方法】 1. 粗酶液提取 称取植物材料1g 于研钵中，加3ml 提取缓冲液，置冰浴上研磨匀浆，转移于离心管中，4℃下15,000g 离心20min ，上清液即为粗酶液。 2. 反应 1.6ml 反应混合液B ，加入0.7ml 粗酶液和0.7ml ATP 溶液，混匀，于37℃下保温半小时，加入显色剂1ml ，摇匀并放置片刻后，于 5,000g 下离心10min ，取上清液测定540nm 处的吸光值，以加入1.6ml 反应混合液A 的为对照。 3. 粗酶液中可溶性蛋白质测定 取粗酶液0.5ml ，用水定容至100ml ，取2ml 用考马斯亮蓝G-250 测定可溶性蛋白质（见实验28）。 4. 原始数据记载 5. 结果计算： GS 活力(A·mg －1 protein·h －1 ) ＝ 式中 A —540nm 处的吸光值； P —粗酶液中可溶性蛋白含量（mg/ml）； V —反应体系中加入的粗酶液体积（ml ）； T —反应时间（h ）。

蔗糖合成酶的测定方法

一、仪器设备

冷冻离心机、恒温水浴、分光光度计

二、试剂

HEPES-NaOH （50mmol/L，pH7.5）缓冲液，包括50mmol/L MgCI2；2mmol/LEDTA；0.2%(W/V)BSA；2%PVP；

0.1%间苯二酚：称取0.1g 溶解并定溶于100ml 95%乙醇中。

30%盐酸、2mol/L NaOH、100mmol/L UDPG、100mmol/L6-磷酸果糖、100mmol/L果糖

三、操作方法

1、粗酶液制备

称取0.5g 样品（植物叶片去掉主叶脉），洗净剪碎，置于预冷的研钵中，加3ml Hepes-NaOH 缓冲液，冰浴研磨，10000×g 离心10min 。

2、酶活性测定

依次加入 50μL粗酶液，

50μLHepes-NaOH 缓冲液pH7.5，

20μL 50 mmol/LMgCI2，

20μL 100mmol/L UDPG ，

20μL 100mmol/L6-磷酸果糖（20μL 100mmol/L果糖），

30℃中反应30min 后，加入200μL 2mol/L NaOH终止反应，沸水煮10min ，流水冷却，加入1.5ml 30%盐酸和0.5ml 0.1% 间苯二酚，摇匀后置于80℃水浴保温10min ，冷却后置于480nm 处，以提前杀死酶活性为空白比色测定蔗糖含量。 同时取50μL粗酶液，加入200μL 2mol/L NaOH，以下同上操作，测定蔗糖含量。

3、蔗糖标线制作：

取0、40、80、120、160、200μg/ml的蔗糖溶液50μL，操作同上，然后以蔗糖浓度为纵坐标，以吸光值为横坐标，得方程。

4、计算

样品中酶活性（μg ·g ﹣1·h ﹣1）=

式中 C —反应液催化产生的蔗糖总量（μg ）；

V 1—提取酶液时加入的缓冲液体积（ml ）；

V 2—酶反应时加入的粗酶液体积（ml ）

淀粉酶活性的测定

1方法

1.1试剂配制淀粉酶提取缓冲液：0.1mol/L-1柠檬酸溶液(pH 5.6);1%的淀粉溶液：用0.1mol/L-1的柠檬酸缓冲液(pH 5.6)配制；标准麦芽糖溶液

(1mg/mL-1);3,5-二硝基水杨酸试剂(DNS试剂):称取6.5 g 3,5-二硝基水杨酸溶于少量水中，移入1000 mL容量瓶中，加入325 mL 2mol·L-1 NaOH溶液，再加入45g 丙三醇，摇匀，冷却后定容到1000 mL 。淀粉和麦芽糖为Sigma 产品，其余试剂为国产分析纯试剂。

1.2测定方法

1.2.1酶液的提取

将每一个重复的3个果实去皮后切碎混匀，称取其果肉1g ，置于预冷的研钵中，加2mL 预冷的0.1mol/L-1柠檬酸溶液(pH5.6)和少量石英砂研磨，将匀浆移入7mL 的离心管中，再分别用1mL 的0.1mol/L-1柠檬酸缓冲(pH 5.6) 冲洗2次, 于4℃下以15000×g 离心15min ，上清液转移入另一个5mL 离心管中，作为酶提取液备用。

1.2.2酶活性的测定

取洁净的试管18支，作标记，每一个样品设1个对照。总反应体积为0.5mL ，测定管含0.2mL 的酶提取液和0.3mL 的1%淀粉溶液；对照管含0.2 mL 的酶提取

液和0.3mL 的0.1mol/L-1柠檬酸溶液(pH 5.6,不含底物淀粉) 将试管放入恒温40℃的水浴锅中，保温30min 后取出，立即加入1.5mL 的DNS 试剂终止反应再将试管置于沸水浴中10min ，取出后冰浴冷却。取反应液稀释10倍，测定波长520nm 处的吸光值，同上做麦芽糖标准曲线，从标准曲线上查出麦芽糖的含量，计算淀粉酶的总活性。

周蓓云. α-和β-淀粉酶活性的测定. 见：中国科学院上海植物生理研究所，上海市植物生理学会编. 现代植物生理学实验指南. 北京：科学出版社，1999.123~124

转化酶的测定

转化酶又称蔗糖酶，是一种水解酶，植物体的库组织中，一般含有较高活性的转化酶，它能将植物体内的主要同化产物——蔗糖不可逆的水解为葡萄糖和果糖，为细胞的可溶性糖贮库提供可利用六碳糖，以用于细胞壁、贮藏多糖及果聚糖的生物合成，并通过与呼吸作用偶联的氧化磷酸化产生能量，所以，转化酶与植物组织的生长有密切关系，是衡量同化产物的转化和利用、植物细胞代谢及生长强度的指标。

试剂：

1、10%蔗糖溶液

2、葡萄糖标准液（500μg/ml）

3、0.05mol/l的磷酸缓冲液

4、（DNS ）3，5二硝基水杨酸：将6.3g 二硝基水杨酸和262 ml 2mol/l NaOH 溶液，加到500ml 含有185g 酒石酸钾钠的热水溶液中，再加5g 结晶酚和5g 亚硫酸钠，搅拌溶解，冷却后加蒸馏水定容至1000ml ，贮于棕色瓶中备用。

方法：1、酶的提取：1g 样品剪碎后，用预冷的蒸馏水在冰浴中研磨成匀浆，定容至100ml ，在冰箱中浸提3小时，4000转离心15分钟，上清液即为酶的粗提液。

2、酶活性的测定：吸酶液2ml ，放入试管中，再加入pH6.0的缓冲液5ml 及10%蔗糖溶液1ml ，在37度水浴中保温30分钟，取出后立即按3，5二硝基水杨酸法测定还原糖的含量。以煮沸酶液10分钟钝化酶的试管作对照。

3、还原糖标准曲线的制作及还原糖含量的测定

①标准曲线：取6支20ml 刻度试管，编号，按下表配置不同浓度的葡萄糖标准液：

管号 1 2 3 4 5 6 葡萄糖原液量0 0.4 0.8 1.2 1.6 2.0 （ml ） 加蒸馏水量（ml ） 2.0 1.6 1.2 0.8 0.4 0 葡萄糖浓度（μ0 100 200 300 400 500 g/ml）

在上述各管中分别加入1.5ml 3，5二硝基水杨酸试剂，在沸水浴中加热5分钟，

取出后立即放入盛有冷水的烧杯中冷却至室温，加蒸馏水定容至20ml ，混匀，以1号管为空白，测540nm 波长下的OD 值。以OD 值为纵坐标，葡萄糖浓度为横坐标，绘制标准曲线。

②酶反应液中还原糖的含量的测定：吸取2ml 反应液，加入1.5ml 3，5二硝基水杨酸试剂，沸水浴中煮沸5分钟，冷却定容至20ml ，测定540nm 波长下的OD 值，查标准曲线得酶反应液中还原糖的浓度。

4、结果计算：

A=(N-N’)*V/(T*W*1000)

A ：转化酶的活性(mg/gfw/h) N ：酶反应液中还原糖的浓度(μg/ml)

N’：钝化酶反应液中还原糖的浓度(μg/ml) V ：酶反应液的总体积

T ：反应时间 W ：材料鲜重

试剂：

谷氨酰胺合成酶：

Tris （三羟甲基氨基甲烷）、MgSO 4 .7 H 2 O、 DTT （二硫苏糖醇）、 蔗糖、 谷氨酸钠盐、半胱氨酸、EGTA 、 盐酸羟胺、TCA （三氯乙酸）、FeCl 3.6H 2 O、 ATP 、

Rubisco 酶：

磷酸钾、EDTA （乙二胺四乙酸）、硫基乙醇、KCl 、MgCl 2、ATP 、DDT （二硫苏糖醇）、NADH （还原型辅酶1）KHCO 3 、RUBP 、 三磷酸甘油酸激酶、三磷酸甘油醛脱氢酶、