细胞生物学作业

题目：

一、光学显微镜、电子显微镜分别有哪些？说明其工作原理、观察对象和主要构造。请查阅文献资料截图举出每种显微镜拍摄的细胞生物学照片3张以上的图片。

二、试述单克隆抗体技术、FRET 、荧光漂白恢复技术的原理与应用。

解答：

一、

（一）、光学显微镜

观察对象：

光学显微镜适用于比较大的物质，最小能看到十几微米尺寸的物体。且需要该物体对光的散射比较良好，景深不大。可用于观察细胞，细菌，以及大结构的金属组织。

尼康E-600显微镜

（1）原理：

普通的光学显微镜是根据凸透镜的成像原理，要经过凸透镜的两次成像。第一次先经过物镜（凸透镜①）成像，这时候的物体应该在物镜(凸透镜①）的一倍焦距和两倍焦距之间，根据物理学的原理，成的应该是放大的倒立的实像。而后以第一次成的物像作为“物体”，经过目镜的第二次成像。由于我们观察的时候是在目镜的另外一侧，根据光学原理，第二次成的像应该是一个虚像，这样像和物才在同一侧。因此第一次成的像应该在目镜（凸透镜②）的一倍焦距以内，这样经过第二次成像，第二次成的像是一个放大的正立的虚像。如果相对实物说的话，应该是倒立的放大的虚像。

（2）主要构造：

普通生物显微镜由3部分构成，即：①照明系统，包括光源和聚光器；②光学放大系统，由物镜和目镜组成，是显微镜的主体，为了消除球差和色差，目镜和物镜都由复杂的透镜组构成；③机械装置，用于固定材料和观察方便。

（3）图片：

蛔虫

钩虫

尼康E800荧光DIC 显微镜

（1）原理：

细胞中有些物质，如叶绿素等，受紫外线照射后可发荧光；另有一些物质本身虽不能发荧光，但如果用荧光染料或荧光抗体染色后，经紫外线照射亦可发荧光，荧光显微镜就是对这类物质进行定性和定量研究的工具之一。

荧光显微镜依据光路可分为透射式和落射式两种，目前新型荧光显微镜多为落射式荧光显微镜，某些大型荧光显微镜中兼有透射利落射两种方式的激发光路。

①透射式荧光显微镜，激发光源是从标本下方经过聚光镜穿过标本材料来激发荧光，适于观察对光可透的标本。其优点是低倍镜时荧光强，

而缺点是随放大

倍数增加其荧光减弱。

②落射式荧光显微镜，是近代发展起来的新式荧光显微镜，其激发光源是从标本上方经过套在物镜外用的特殊的垂直照明器，从物镜周围落射到标本上，光路中需加上一个双色束分离器，它与光轴呈45。角，激发光被反射到物镜中，并聚集在样品上，样品所产生的荧光以及由盖玻片表面等反射的激发光同时进入物镜，即用同一物镜作为聚光器和收集荧光的物镜。由于不必透过载坡片，减少了激发光的无效吸收，提高了对激发光的利用率。如换用不同的激发滤片／双色束分离器／阻断滤片的组合插块，可满足不同荧光反应产物的需要。此种荧光显微镜的优点是视野照明均匀，成像清晰，放大倍数愈大，荧光愈强。

透射式照明原理

落射式照明原理

（2）主要构造：

荧光显微镜主要由光源、滤光片系统和显微镜光学系统等部件组成。

（3）图片：

荧光显微镜照片（微管呈绿色、微丝红色、核蓝色）口腔上皮细胞

叶表皮细胞

激光共聚焦扫描显微镜

（1）原理：

激光共聚焦扫描显微镜，用激光作扫描光源，逐点、逐行、逐面快速扫描成

像，扫描的激光与荧光收集共用一个物镜，物镜的焦点即扫描激光的聚焦点，也是瞬时成像的物点。由于激光束的波长较短，光束很细，所以共焦激光扫描显微镜有较高的分辨力，大约是普通光学显微镜的3倍。系统经一次调焦，扫描限制在样品的一个平面内。调焦深度不一样时，就可以获得样品不同深度层次的图像，这些图像信息都储于计算机内，通过计算机分析和模拟，就能显示细胞样品的立体结构。

激光共聚焦扫描显微镜既可以用于观察细胞形态，也可以用于细胞内生化成分的定量分析、光密度统计以及细胞形态的测量。

（2）主要构造：

在结构配置上，激光扫描共聚焦显微镜除了包括普通光学显微镜的基本构造外，还包括激光光源、扫描装置、检测器、计算机系统 (包括数据采集、处理、转换、应用软件) 、图像输出设备、光学装置和共聚焦系统等部分。由于该仪器具有高分辨率、高灵敏度、“光学切片”（Optical sectioning）、三维重建、动态分析等优点，因而为基础医学与临床医学的研究提供了有效手段。此外，CLSM 对荧光样品的观察具有明显的优势，只要能用荧光探针进行标记的样品就可用其观察。

（3）图片：

LCSM 照片，蓝色为细胞核，绿色为微管

暗视野显微镜

（1）原理：

暗视野显微镜的聚光镜中央有当光片，使照明光线不直接进人物镜，只允许被标本反射和衍射的光线进入物镜，因而视野的背景是黑的，物体的边缘是亮的。利用这种显微镜能见到小至 4~200nm的微粒子，分辨率可比普通显微镜高50倍。

暗视野照明方式

（2）主要构造：

暗视野显微镜基本结构是将普通显微镜光学组加上挡光片。普通显微镜只要聚光器是可以拆卸的，支架的口径适于安装暗视野聚光器，即可改装成暗视野显微镜。在无暗视野聚光时，可用厚黑纸片制作一个中央遮光板，放在普通显微镜的聚光器下方的滤光片框上，也能得到暗视野效果。挡光片是用来挡住光源中间的光线，让光线只能从周围射入标本，大小约和光圈大小相同。不同倍率用不同的光圈，所以要制作不同的挡光片。

（3）观察对象：

暗视野显微镜常用来观察未染色的透明样品。这些样品因为具有和周围环境相似的折射率，不易在一般明视野之下看的清楚，于是利用暗视野提高样品本身与背景之间的对比。这种显微镜能见到小至4~200nm的微粒子，只能看到物体的存在、运动和表面特征，不能辨清物体的细微结构。

（4）图片：

血细胞苍白密螺旋体

硅藻轮虫残骸浮在清水中

相差显微镜

（1）原理：

相差显微镜的基本原理是，把透过标本的可见光的光程差变成振幅差，从而提高了各种结构间的对比度，使各种结构变得清晰可见。光线透过标本后发生折射，偏离了原来的光路，同时被延迟了1/4λ（波长），如果再增加或减少1/4λ，则光程差变为1/2λ，两束光合轴后干涉加强，振幅增大或减下，提高反差。

相差显微镜照明原理

（2）主要构造：

① 环形光阑：位于光源与聚光器之间，作用是使透过聚光器的光线形成空心光锥，焦聚到标本上。

②相位板：在物镜中加了涂有氟化镁的相位板，可将直射光或衍射光的相位推迟1/4λ。分为两种：

a.A+相板：将直射光推迟1/4λ，两组光波合轴后光波相加，振幅加大，标本结构比周围介质更加变亮，形成亮反差（或称负反差）。

b. B+相板：将衍射光推迟1/4λ，两组光线合轴后光波相减，振幅变小，形成暗反差（或称正反差），结构比周围介质更加变暗。

（3）观察对象：

相差显微镜由P ．Zernike 于1932年发明，并因此获1953年诺贝尔物理奖。这种显微镜最大的特点是可以观察未经染色的标本和活细胞。

（4）图片

一种介壳虫的染色体（PCM 照片）

链球菌杆菌

盘镜轮虫

偏光显微镜

（1）原理：

和普通显微镜不同的是：其光源前有偏振片（起偏器），使进入显微镜的光线为偏振光，镜筒中有检偏器（一个偏振方向与起偏器垂直的的起偏器），这种显微镜的载物台是可以旋转的，当载物台上放入单折射的物质时，无论如何旋转载物台，由于两个偏振片是垂直的，显微镜里看不到光线，而放入双折射性物质时，由于光线通过这类物质时发生偏转，因此旋转载物台便能检测到这种物体。

（2）主要构造：

偏光显微镜最重要的特质是具有发作偏振光的装置

（3）观察对象：

偏光显微镜用于检测具有双折射性的物质，如纤维丝、纺锤体、

胶原、染色体等等。

（4）图片：

塑料结晶长石石英

半结晶聚合物成膜形态蕨菜茎截面细胞

微分干涉差显微镜

（1）原理：

DIC 显微镜的物理原理完全不同于相差显微镜，技术设计要复杂得多。DIC 利用的是偏振光，有四个特殊的光学组件：偏振器、DIC 棱镜、DIC 滑行器和检偏器。偏振器直接装在聚光系统的前面，使光线发生线性偏振。在聚光器中则安装了石英Wollaston 棱镜，即DIC 棱镜，此棱镜可将一束光分解成偏振方向不同的两束光（x 和y ），二者成一小夹角。聚光器将两束光调整成与显微镜光轴平行的方向。最初两束光相位一致，在穿过标本相邻的区域后，由于标本的厚度和折射率不同，引起了两束光发生了光程差。在物镜的后焦面处安装了第二个Wollaston 棱镜，即DIC 滑行器，它把两束光波合并成一束。这时两束光的偏振面（x 和y ）仍然存在。最后光束穿过第二个偏振装置，即检偏器。在光束形成目镜DIC 影像之前，检偏器与偏光器的方向成直角。检偏器将两束垂直的光波组合成具有相同偏振面的两束光，从而使二者发生干涉。x 和y 波的光程差决定着透光的多少。光程差值为0时，没有光穿过检偏器；光程差值等于波长一半时，穿过的光达到最大值。于是在灰色的背景上，标本结构呈现出亮暗差。为了使影像的反差达到最佳状态，可通过调节DIC 滑行器的纵行微调来改变光程差，光程差可改变影像的亮度。调节DIC 滑行器可使标本的细微结构呈现出正或负的投影

形象，通常是一侧亮，而另一侧暗，这便造成了标本的人为三维立体感，类似大

理石上的浮雕。

（2）主要构造：

DIC 利用的是偏振光，有四个特殊的光学组件：偏振器、DIC 棱镜、DIC 滑行器和检偏器。偏振器直接装在聚光系统的前面，使光线发生线性偏振。

（3）观察范围：

DIC 显微镜又称Nomarski 相差显微镜，其优点是能显示结构的三维立体投影影像。与相差显微镜相比，其标本可略厚一点，折射率差别更大，故影像的立体感更强。

DIC 显微镜使细胞的结构，特别是一些较大的细胞器，如核、线粒体等，立体感特别强，适合于显微操作。目前像基因注入、核移植、转基因等的显微操作常在这种显微镜下进行。

（4）图片：

神经细胞

DIC 显微镜下的硅藻

（伪彩色）细胞胚胎

草履虫

莱卡倒置显微镜

组成和普通显微镜一样，只不过物镜与照明系统颠倒，前者在载物台之下，后者在载物台之上，用于观察培养的活细胞，具有相差物镜。

进入20世纪80年代以来，光学显微镜的设计和制作又有了很大的发展，其发展趋势主要表现在，注重实用性和多功能方面的改进。在装配设计上趋于采用组合方式，集普通光镜加相差、荧光、暗视野、DIC 、摄影装置于一体，从而操作灵活，使用方便。

（二）、电子显微镜

观察对象：

电子显微镜可以观察几个纳米至几十微米范围内的物体，需要被测物体导电性良好。根据不同的电子显微镜，被观测的物体不同。扫描电子显微镜主要观察几百纳米至几十微米之间的物体表面机构，分辨率比光学显微镜高，但是比透射电子显微镜底。可用于观察大型纳米颗粒，较细结构的金属组织，以及生物体的纳米结构。

透射电子显微镜主要观察几纳米至几微米的薄膜样品，分辨率极高。可用于观察纳米颗粒，金属微观组织以及原子结构。

原理：

在光学显微镜下无法看清小于0.2µm的细微结构，这些结构称为亚显微结构或超微结构。要想看清这些结构，就必须选择波长更短的光源，以提高显微镜的分辨率。1932年Ruska 发明了以电子束为光源的透射电子显微镜，电子束的波长要比可见光和紫外光短得多，并且电子束的波长与发射电子束的电压平方根成反比，也就是说电压越高波长越短。目前TEM 的分辨力可达0.2nm 。

电子显微镜（图2-12）与光学显微镜的成像原理基本一样，所不同的是前者用电子束作光源，用电磁场作透镜。另外，由于电子束的穿透力很弱，因此用于电镜的标本须制成厚度约50nm 左右的超薄切片。这种切片需要用超薄切片机制作。电子显微镜的放大倍数最高可达近百万倍、由电子照明系统、电磁透镜成像系统、真空系统、记录系统、电源系统等5部分构成。

不同光源的波长

JEM-1011透射电子显微镜

（1）原理：

透射电镜的总体工作原理是：由电子枪发射出来的电子束，在真空通道中沿着镜体光轴穿越聚光镜，通过聚光镜将之会聚成一束尖细、明亮而又均匀的光斑，照射在样品室内的样品上；透过样品后的电子束携带有样品内部的结构信息，样品内致密处透过的电子量少，稀疏处透过的电子量多；经过物镜的会聚调焦和初级放大后，电子束进入下级的中间透镜和第1、第2投影镜进行综合放大成像，最终被放大了的电子影像投射在观察室内的荧光屏板上；荧光屏将电子影像转化为可见光影像以供使用者观察。本节将分别对各系统中的主要结构和原理予以介绍。

（2）主要构造

透射电镜一般是电子光学系统、真空系统和电源与控制系统三大部分组成。电子光学系统通常称为镜筒，是透射电子显微镜的核心，它又可以分为照明系统、成像系统和观察记录系统。

电镜中的电子光学系统主要包括电子枪、聚光镜、试样台、物镜、物镜光阑、选区光阑、中间镜、投影镜和观察记录系统等几部分组成，其成像的光路与光学显微镜基本相同。

（3）观察范围：

透射电子显微镜在材料科学、生物学上应用较多。由于电子易散射或被物体吸收，故穿透力低，样品的密度、厚度等都会影响到最后的成像质量，必须制备更薄的超薄切片，通常为50～100nm 。所以用透射电子显微镜观察时的样品需要处理得很薄。常用的方法有：超薄切片法、冷冻超薄切片法、冷冻蚀刻法、冷冻断裂法等。对于液体样品，通常是挂预处理过的铜网上进行观察。

（4）图片

内质网透射电镜图（伪彩色）

纳米铜粉珊瑚砂

流感病毒

JEOL 扫描电子显微镜

（1）原理：

扫描电子显微镜于20世纪60年代问世，用来观察标本的表面结构。其工作原理是用一束极细的电子束扫描样品，在样品表面激发出次级电子，次级电子的多少与电子束入射角有关，也就是说与样品的表面结构有关，次级电子由探测体收集，并在那里被闪烁器转变为光信号，再经光电倍增管和放大器转变为电信号来控制荧光屏上电子束的强度，显示出与电子束同步的扫描图像。图像为立体形象，反映了标本的表面结构。为了使标本表面发射出次级电子，标本在固定、脱水后，要喷涂上一层重金属微粒，重金属在电子束的轰击下发出次级电子信号。

光学显微镜、TEM 、SEM 成像原理比较

（2）主要构造：

扫描电子显微镜由电子光学系统，信号收集及显示系统，真空系统及电源系统组成。

（3）观察范围：

目前扫描电镜的分辨力为6~10nm，人眼能够区别荧光屏上两个相距0.2mm

的光点，则扫描电镜的最大有效放大倍率为0.2mm/10nm=20000X。

（4）图片：

人类血细胞SEM 照片叶蓟属植物的花粉

百合花花粉松树花粉

扫描隧道显微镜

（1）原理：

扫描隧道显微镜由Binnig 等1981

年发明，根据量子力学原理中的隧道效应

而设计。当原子尺度的针尖在不到一个纳米的高度上扫描样品时，此处电子云重叠，外加一电压（2mV~2V），针尖与样品之间产生隧道效应而有电子逸出，形成隧道电流。电流强度和针尖与样品间的距离有函数关系，当探针沿物质表面按给定高度扫描时，因样品表面原子凹凸不平，使探针与物质表面间的距离不断发生改变，从而引起电流不断发生改变。将电流的这种改变图像化即可显示出原子水平的凹凸形态。扫描隧道显微镜的分辨率很高，横向为0.1~0.2nm，纵向可达0.001nm 。它的优点是三态（固态、液态和气态）物质均可进行观察，而普通电镜只能观察制作好的固体标本。

（2）主要构造：

隧道针尖的结构是扫描隧道显微技术要解决的主要问题之一。针尖的大小、形状和化学同一性不仅影响着扫描隧道显微镜图象的分辨率和图象的形状，而且也影响着测定的电子态。

（3）观察范围：

利用扫描隧道显微镜直接观察生物大分子，如DNA 、RNA 和蛋白质等分子的原子布阵，和某些生物结构，如生物膜、细胞壁等的原子排列。

（4）图片：

扫描隧道显微镜下的原子图片溴原子

量子森林蓝宝石

二、 （1）原理：

其原理是: B淋巴细胞能够产生抗体，但在体外不能进行无限分裂; 而瘤细胞虽然可以在体外进行无限传代，但不能产生抗体。将这两种细胞融合后得到的杂交瘤细胞具有两种亲本细胞的特性。

（2）应用：

单克隆抗体用于临床诊断和治疗，目前研究较多的是抗人 T 细胞单克隆抗体，用以识别人T 细胞表面的不同抗原决定簇，有OKT 系统及Leu 系统。T 细胞, 特别是免疫调节T 细胞（Ti/h及Tc/s细胞）对于调控免疫应答和维持免疫自稳起着至关重要的作用, 临床上许多疾病的发生与免疫调节失常有关, 因此，研究 T 细胞在这些疾病中的变化，有助于探讨病因和辅助诊断。各种免疫缺损病、肿瘤或感染性疾病都与免疫功能低下有关，而变态反应性疾病、自身免疫性疾病等与免疫功能亢进有关。因此应用 OKT 系列单克隆抗体检测这些疾病患者外周血中T 细胞亚群及T4/T8比值的变化，对探讨发病机理，及时诊断疾病及监测病情发展有十分重要的意义。接受肾移植或骨髓移植的患者往往需应用各种免疫抑制剂以控制排斥反应， T 细胞亚群的检测有助于了解移植器官的排异和发展。抗人T 细胞单克隆抗体可用以治疗白血病、移植物抗宿主反应

(GVHD)

和急性肾排斥等，

目前尚处于摸索阶段。

（1）原理：

荧光能量共振转移是距离很近的两个荧光分子间产生的一种能量转移现象。当供体荧光分子的发射光谱与受体荧光分子的吸收光谱重叠，并且两个分子的距离在10nm 范围以内时，就会发生一种非放射性的能量转移，即FRET 现象，使得供体的荧光强度比它单独存在时要低的多（荧光猝灭），而受体发射的荧光却大大增强（敏化荧光）。

（2）应用：

在生命科学领域，FRET 技术是检测活体中生物大分子纳米级距离和纳米级距离变化的有力工具，可用于检测某一细胞中两个蛋白质分子是否存在直接的相互作用。正如前述，当供体发射的荧光与受体发色团分子的吸收光谱重叠，并且两个探针的距离在10nm 范围以内时，就会产生FRET 现象。而在生物体内，如果两个蛋白质分子的距离在10nm 之内，一般认为这两个蛋白质分子存在直接相互作用。 FRET 技术得以在生物体内广泛应用，与绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP) 的应用和改造是密不可分的。 GFP 由11个β片层组成桶状构成疏水中心，由α螺旋包含着的发光基团位于其中。这个发光基团(chromophore)是由3个氨基酸（Ser65、Tyr66、Gly67）经过环化、氧化后形成的咪唑环，在钙离子激发下产生绿色荧光。野生型GFP 吸收紫外光和蓝光，发射绿光。通过更换GFP 生色团氨基酸、插入内含子、改变碱基组成等基因工程操作，实现对GFP 的改造，如增强其荧光强度和热稳定性、促进生色团的折叠、改善荧光特性等。 GFP 近年来发展出了多种突变体，通过引入各种点突变使发光基团的激发光谱和发射光谱均发生变化而发出不同颜色的荧光，有BFP ，YFP ，CFP 等。这些突变体使GFP 应用于FRET 成为可能, 为FRET 技术用于活体检测蛋白质相互作用提供了良好的支持。

青色荧光蛋白、黄色荧光蛋白为目前蛋白-蛋白相互作用研究中最广泛应用的FRET 对。CFP 的发射光谱与YFP 的吸收光谱相重叠。将供体蛋白CFG 和受体蛋白YFG 分别与两种目的蛋白融合表达。当两个融合蛋白之间的距离在5-10nm 的范围内，则供体CFP 发出的荧光可被YFP 吸收，并激发YFP 发出黄色荧光，此时通过测量CFP 荧光强度的损失量来确定这两个蛋白是否相互作用。两个蛋白距离越

近，CFP 所发出的荧光被YFP 接收的量就越多，检测器所接收到的荧光就越少。 如Tsien & Miyawaki采用FRET 技术检测细胞内Ca2+的浓度变化。他们将CFP 和YFP 分别于钙调蛋白和钙调蛋白结合肽融合表达于同一个细胞内。当细胞内具有高的Ca2+浓度时，钙调蛋白和钙调蛋白结合肽结合，可诱发FRET ，使受体蛋白YFP 发出黄色荧光，因此细胞呈黄色。当细胞内Ca2+浓度低时，FRET 几乎不发生，因此检测时CFP 被激发，发出绿色荧光，细胞呈绿色。

（1）原理：

荧光漂白后的恢复技术是使用亲脂性或亲水性的荧光分子，如荧光素、绿色荧光蛋白等与蛋白或脂质耦联，用于检测所标记分子在活体细胞表面或细胞内部运动及其迁移速率。

（2）应用：

荧光漂白后的恢复技术是使用亲脂性或亲水性的荧光分子，如荧光素、绿色荧光蛋白等与蛋白或脂质耦联，用于检测所标记分子在活体细胞表面或细胞内部运动及其迁移速率。FPR 技术的原理是：利用高能激光照射细胞的某一特定区域，使该区域内标记的荧光分子不可逆的淬灭，这一区域称荧光漂白区。随后，由于细胞质中的脂质分子或蛋白质分子的运动，周围非漂白区荧光分子不断向光漂白区迁移。结果使荧光漂白区的荧光强度逐渐地回复到原有水平。