细胞油红O染色的操作步骤
细胞油红O染色的操作步骤
点击次数：348 发布时间：2011-4-1
1、10%中性甲醛的配制
材料：中性甲醛(多聚甲醛) 密封瓶
称取1g中性甲醛粉末，加入10ml的三蒸水中，密封，在60度水浴中过夜才能溶解。配好的溶液1个星期内有效，最好4度保存。
2、染色液的配制
材料：油红染料 棕色可密封瓶 异丙醇 研钵 漏斗 定性滤纸
称取预先研磨粉碎的0.5g油红干粉，溶于少量异丙醇中，然后加异丙醇至100ml，棕色瓶密封(或锡箔纸包裹避光)4℃保存，为储存液，可长期保存。用时取6ml加三蒸水4ml混匀，定性滤纸过滤，稀释后数小时内用完。
3、培养载体 3毫升培养瓶。如果培养载体为塑料制品，hoechst33342染核的话，塑料板自发荧光也为蓝色，必须考虑。
4、.染色对象 间充质细胞脂肪诱导后不同时间段。
5、注意事项：
脂肪油红染色，有的是动物/人体脂肪组织切片，或细胞爬片。各有操作差异。以下是各论坛方法小结，不全。
(1).完全成熟饱满的脂肪细胞，容易破裂，脂滴泄漏，所以压片，切片都要考虑到这个问题。
(2).细胞爬片细胞溶液脱落，特别是脂滴大的。操作务要轻柔。不要把细胞冲掉。
(3).如果做脂肪组织冰冻切片，冰冻温度比普通要低，切片厚度加厚。
6、染色步骤：
(1) 先小心轻缓倒去培养夜。
(2) 用pbs轻缓漂洗(不洗没问题)。
(3)加10%中性甲醛固定30min(实际固定时间过夜都没问题。固定液用95%酒精也可)。固定的是细胞膜。
(4) 稀释油红储存液，油红：去离子水＝3:2，滤纸过滤，室温放置10min(除去一些杂质，染色结果更清晰)。
(5)染色10min左右，加的体积覆盖住板底即可，如6孔加1.5ml，24孔加0.5-1ml(实际染色时间1小时都可以)。
(6)脱色，用75%酒精/60%异丙醇漂洗，除去多余的染料(实际用其他平衡液洗也没问题，背景并不会残留多少)。
(7) 复染，淡苏木染色1/5分钟，pbs漂洗(这一步不做也可，看试验需要，并且苏木素会把胞浆染红，如要显示核， hoechst33342也可以，浓度5微克/毫升染10分钟即可把核染上)。
(8)甘油明胶封片(封片后可长期保存)。
(9)显微镜观察。
三、显示脂类的油红法：
（1）操作步骤：
1、福尔马林固定后的恒冷箱切片附贴于载片上或游离切片，厚5-10nm，
2、60%异丙醇稍洗切片，
3、油红O液染5-15min，
4、60%异丙醇洗去多余染液，
5、自来水洗，
6、苏木素染细胞核2min，
7、自来水洗，如果需要可分化，
8、水洗至细胞核蓝化5-10min，
9、擦去多余水分，甘油明胶封固。
结果：脂类物质显示红色，细胞核显示蓝色。
（II）试剂的配制：
油红o（oil red o） 0.5g
异丙醇（isopropanot） 100ml
将异丙醇放入三角烧瓶，再加入油红O，于水浴中慢慢加热使之溶解，待至完全溶解后取出，冷却至室温后，过滤，装于棕色小磨沙口瓶保存，临用前取6ml加蒸馏水4ml，混合后静置10min后过滤，染色时间5-15min。