大肠杆菌高细胞密度发酵

课 程 设 计 说 明 书

课程名称：发酵工程 设计题目：大肠杆菌的高细胞密度发酵 院 系：生物与食品工程学院 学生姓名： 郑帅超 学 号：[1**********]0 专业班级：11 生物技术

2014年5月26日

课 程 设 计 任 务 书

枯草芽孢杆菌产淀粉酶发酵工艺的优化

摘要： 大肠杆菌被广泛地用于基因工程菌的构建，以获得大量的外源基因产物 , 利用基因重组技术构建的基因工程菌的发酵工艺不同于传统的发酵工艺。生物工程菌发酵的目的是希望能获得大量的外源基因产物 , 尽可能减少宿主细胞本身蛋白的污染。外源基因的高水平表达不仅涉及宿主 , 载体和目的基因三者之间的相互关系, 而且与其所处环境条件息息 相关。因此仅按传统的发酵工艺生产生物制品是远远不够的, 需要对影响外源基因表达的因素进行分析 , 探索出适于外源基因高效表达的发酵工艺。高密度、高产率和高浓度培养是近几年发酵工业的目标和方向 。近几年 , 人们对高密 度发酵(high cell density fermentation) 进行了大量的研究 , 并取得了可喜的成果。对于大肠杆菌 , 尤其是重组大肠杆菌的发酵来讲 , 实现高密度发酵 , 可相应地缩小生物反应器的体积 和降低生物量的分离费用 , 从而降低生产成本 , 达到提高生产效率的目的。本文就大肠杆菌高密度发酵的影响因素 包括培养基、培养条件、补料方法、发酵工艺以及高密度发酵过程中存在的问题和对策加以讨论, 并探讨了如何提高大肠杆菌高密度发酵工艺技术水平。

关键词： 大肠杆菌 高密度发酵 培养基 溶氧值 菌体密度

目 录

1. 设计背景.............................................................................................1 1.1 大肠杆菌简介..................................................................................1 1.2 高细胞密度发酵技术概述........................................................................1 1.3 影响大肠杆菌高细胞密度发酵的因素....................................................2 2. 设计方案 ............................................................................................3 2.1实验材料与条件................................................................................3 2.2培养基..............................................................................................3 2.3总工艺流程.......................................................................................4 3. 方案实施..............................................................................................5 3.1 种子的扩大培养................................................................................5 3.3发酵罐的灭菌——实消......................................................................5 3.4接种...................................................................................................5 3.5取样检测分析.....................................................................................5 3.6补料....................................................................................................6 3.7倒罐....................................................................................................6 4. 收获与致谢.............................................................................................7 5. 参考文献................................................................................................8 6. 附件.......................................................................................................9

1. 设计背景

1.1 大肠杆菌简介

大肠埃希氏菌(Escherichia coli ) 通常称为大肠杆菌，1885年由Theodor Escherich 发现，分布在自然界，大多数是不致病的，主要附生在人或动物的肠道里, 为正常菌群，少数的大肠杆菌具有毒性, 可引起疾病。大肠杆菌是细菌，属于原核生物，具有由肽聚糖组成的细胞壁，只含有核糖体简单的细胞器，没有细胞核有拟核，细胞质中的质粒常用作基因工程中的运载体。其代谢类型是异养兼性厌氧型。

大肠杆菌在生物技术中的应用：大肠杆菌作为外源基因表达的宿主，遗传背景清楚，技术操作简单，培养条件简单，大规模发酵经济，倍受遗传工程专家的重视。目前大肠杆菌是应用最广泛，最成功的表达体系，常做高效表达的首选体系。

在培养基选体系培养时无需添加生长因子，向培养基中加入伊红美蓝遇大肠杆菌，菌落呈深紫色，并有金属光泽，可鉴别大肠杆菌是否存在。

1.2 高细胞密度发酵技术概述

基因工程技术和大规模培养技术的有机结合，使得原来无法获得的许多天然蛋白能 够大量生产：由于大肠杆菌(EscheHchia colo结构简单、遗传学背景清晰、生长周期短、 生长条件清楚，成为最为常用的宿主菌, 已被广泛应用于重组蛋白, 以及非蛋白的生物分子，如氨基酸等的生产。 高细胞密度发酵 (high cell density cultivation，HCDC) 是指在一定条件和培养体系下，获得最多的细胞量，由此更多地或更高效地获得目的产物。即利用一定的培养技术和装置提高菌体的发酵密度，使菌体密度较普通培养有显著提高，最终提高产物的比生产率(单位体积单位时间内产物的产量) 。实现高密度发酵不仅可以减少培养体积，强化下游分离提取，还可以缩短生产周期、减少设备投资，从而降低生产成本。

通常认为菌体密度超过50 g(DCW)／L 即为高密度发酵。根据Riesenbere 计算，理论上大肠杆菌发酵所能达到的最高菌体密度为400 g(DCW／L) ，考虑到实际情况中的种种条件限制，Markel 认为最高的菌体密度为200 g(DCW／L) ，此时发酵液的25％充满了长3 µm ，宽1µm 的大肠杆菌，发酵液粘度很高，几乎丧失流动性。迄今为止，大 肠杆菌发酵菌体密度最高的两例为：非重组E coli W3110达174 g(DCW／L) ，生产聚．3． 羟基丁酸的重组菌达1 75．4 g(DCW／L) 。

1.3 影响大肠杆菌高细胞密度发酵的因素

利用一般的发酵工艺生产大肠杆菌或以其组建的基因工程菌的表达产物，大肠杆菌的生物量，表达产物在菌体内和发酵液中的浓度比较低，难以获得理想的生产效率和经济效益。应用高密度发酵不但可获得较高的生物量，而且可显著提高目的基因表达产物的浓度。高密度发酵对发酵设备有较高的要求，而且对发酵条件也有非常高的要求。影响高密度发酵的因素非常多，如细菌生长所需的营养物质、发酵过程中生长抑制物的积累、溶氧浓度、培养温度、发酵液的pH 值、补料方式及发酵液流变学特性等。

2. 设计方案

2.1实验材料与条件 2.1.1 实验材料

由生物与食品工程学院实验室培养的大肠杆菌菌种

2.1.2 实验条件

温度：37℃ PH：7.2~7.6 OD溶解度：20%~80% 罐压：0.05Mpa 接种量：1% CO2溶解度：1%~3% 转速：300rpm~400rpm 调节PH ：氨水

补料时间：有待观察（2~4h左右） 通气量：100L/h

设备：空压机；50L 发酵罐；蒸汽加热器；分光光度计等

2.2培养基

由于发酵过程主要经历三个阶段：种子的扩大培养、发酵罐初始培养和流加培养。所以整个过程需要三种培养基：

2.2.1 种子培养基的配比

2.2.2 发酵罐初始培养基的配比 （35L ）

（3L ）

种子的扩大培养 发酵罐的前期准备 实消

补料 倒罐

2.2.3 流加培养基的配比

2.3 总工艺流程

3. 方案实施

3.1 种子的扩大培养

种子培养基经过配制和灭菌之后，在超净工作台中，用接种环从保存斜面中接一环至装液量为60ML 的1000ML 摇瓶中， 250r/min,37℃ ，摇瓶培养12~16h，制作两瓶种子液。

3.2 发酵罐的前期准备

3.2.1发酵罐的清洗

发酵罐的清洗 发酵罐使用前后都应认真清洗，特别是前后两次培养采用不同的菌株时，更应注意清洗和杀菌工作。发酵罐内可进行清洗的任何部分都应认真清洗，否则都可能成为杂菌的滋生地。易被忽略而未能充分清洗的地方有喷嘴内部与取样管内以及罐顶等处。

3.2.2发酵罐溶氧电极和PH 电极的校正 用标准溶液校正电极

3.3发酵罐的灭菌——实消

配制发酵培养基并加入发酵罐进行灭菌

①排气管为硅胶管, 一端装有过滤装置，以保证蒸汽能自由出入发酵罐，同时不会出现染菌现象．

②取样口上连接一段硅胶管，在硅胶管上安装节流夹，以防止培养基在灭菌时流出。 ③装入发酵罐容积60％的培养基后，通入高压蒸汽加热发酵罐, 在121℃下灭菌20min 。当灭菌完成后，确认排气口正常后，以0.3~5L/min的通气量通入过滤气体．接通冷却水管脚开挽拌在低转速下进行培养基的冷却．

3.4 接种

接种是在发酵罐顶部接种口进行。适当降低通风量，在接种口四周缠绕上经酒精浸泡的脱脂棉，点燃后戴上石棉手套, 迅速打开接种口，将菌种加入到发酵罐中，接种量为1％，然后将接种口盖子在火焰中灭菌后盖好。在37℃，pH7.4下进行 ，搅拌速度为300rpm 。通气量100L/h.的条件下进行发酵培养。

3.5 取样检测分析

3.5.1还原糖含量的测定

还原糖含量测定用的是菲林试剂法。

3.5.2氨基氮含量的测定

氨基氮含量的测定用的是甲醛滴定法 3.5.3菌体浓度的测量

用分光光度仪在OD600下测定菌液的吸光度. 对于高于1.0的菌液要进行稀释，并进行吸光度的测定。此时菌体密度即为吸收值与稀释倍数的乘积。

自培养操作开始起，每4h 取一次样。取样时将取样管口流出的最初15mL 左右培养液作为废液，取随后流出的培养液10mL 。 3.5.4实验是原始数据

3.6 补料

根据样品中还原糖的含量、氨基氮的含量、PH 、溶氧量（DO 值）、菌体密度（OD 值）的变化，进行补料培养基的配制灭菌后，用补料瓶进行补料，期间要注意无菌操作和要注意蠕动泵运转中自于硅胶管的弯曲折叠，出现的阻塞现象以及水的渗漏等问题。特别需要注意在一定的阶段泡沫有可能大量生成。

3.7 倒罐

为了安全起见，防止菌体污染环境，倒灌前须对发酵液进行灭菌，升温到90度，灭菌三十分钟，倒掉发酵液，并把发酵罐彻底的进行清洗干净。

4. 收获与致谢

本课题设计在进行过程中得到李安华老师的悉心指导，论文行文你过程中李老师多次帮我分析思路，开拓视角，在我遇到困难想要放弃的时候给予我最大的支持和鼓励。李老师严谨求学的治学态度，踏实坚韧的治学精神，两是我终生受益。在此，向李老师致以诚挚的谢意和崇高的敬意。

感谢这两周来生物与食品工程学院所有老师对我学习上的帮助，正是你们的辛勤工作，才使我得以顺利地完成这次课程设计。

感谢我们课题组所有成员，在我实验过程中给予我技术上的帮助，心理上的支持与鼓励。没有大家的相互配合，相互帮助，也就没有我们最后的成功，我们共同思考解决了所遇到的难题，为我以后在求学和生活道路上打好了坚实的基础。

最后再一次诚挚的感谢所有在课题设计中帮助过我的良师益友和亲爱的同学们。

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5. 参考文献

[1] 李寅等著，高细胞密度发酵技术，化学工业出版社，2006-10-01，177~288.

[2] 陈坚 , 李寅 , 毛英鹰 , 等. 生物工程学报 ,1998 ,14(4) :452～455.

[3] 李民 , 陈常庆 , 朴勤 , 等. 生物工程学报 ,1998 ,14(3) :270～275.

[4] 杨汝燕 , 李民 , 陈常庆. 工业微生物 ,1998 ,28(3) :30～33.

[5 ] 李民 , 陈常庆 , 朴勤等 , 生物工程学报 ,1998 ,14 (3) :270~275.

[6] 杨汝燕 , 李民 , 陈常庆 , 工业微生物 ,1999 ,29(1) :25～28.

[7] 徐皓 , 李民 , 阮长庚 , 等. 工业微生物 ,1998 ,28(2) :20～25.

[8] 刘社际 , 葛永红 , 杨立明. 中国生物制品学杂志 ,1999 ,12 (1) :29 ～31.

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6. 附件

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