2种阴离子交换柱对_葡萄糖苷酶的分离纯化效果

第３９卷　第１２期

年月２０１１１２西北农林科技大学学报（自然科学版）

（）ＪｏｕｒｎａｌｏｆＮｏｒｔｈｗｅｓｔＡ＆ＦＵｎｉｖｅｒｓｉｔＮａｔ．Ｓｃｉ．Ｅｄ．　　　　ｙＶｏｌ．３９Ｎｏ．１２

Ｄｅｃ．２０１１

：：／网络出版时间：ＤＯＩＣＮＫＩ６１１３９０Ｓ．２０１１１０２５．２１３３．０３３２０１１１０２５１：３３－－－　２

：／／／／／网络出版地址：ｈｔｔｗｗｗ．ｃｎｋｉ．ｎｅｔｋｃｍｓｄｅｔａｉｌ６１．１３９０．Ｓ．２０１１１０２５．２１３３．０３３．ｈｔｍｌｐ

２种阴离子交换柱对α－葡萄糖苷酶

的分离纯化效果

袁亚宏ａ，蔡　瑞ａ，岳田利ａ，侯俊龙ａ，徐长云ａ，郭康权ｂ

（）西北农林科技大学ａ食品科学与工程学院，陕西杨凌７ｂ机械与电子工程学院，１２１００

［摘　要］目的】比较Ｑ－ＳｅｈａｒｏｓｅＦａｓｔＦｌｏｗ和ＤＥ５２２种阴离子交换柱对１株脂环酸芽孢杆菌Ａｌｉｃｃｌｏｂａ－　【　　－　ｐｙ为α方法】ｃｉｌｌｕｓｃｏｎｔａｍｉｎａｎｓ发酵产生的α　－葡萄糖苷酶的分离纯化效果，－葡萄糖苷酶的规模化生产提供技术支持。【采用硫酸铵分级沉淀法对发酵液中的蛋白质进行沉淀，以分离纯化后的蛋白质含量和酶活为指标，对２种阴离子交换柱的分离纯化效果进行评价。【结果】经过Ｑ－ＳｅｈａｒｏｓｅＦａｓｔＦｌｏｗ阴离子交换层析柱分离得到的α　　－葡萄糖苷酶有ｐ

３　

／最大酶活为６．在这个吸收峰内蛋白质的含量稳定在２经过Ｄ１个酶活吸收峰，９９×１０Ｕ，６．２５μｍＬ左右；Ｅ５２阴－ｇ３　

离子交换层析柱分离，最大酶活为５．在酶活吸收峰内，蛋白质含量为５６×１０Ｕ，α－葡萄糖苷酶的酶活范围较大，

／变化范围较大。【结论】Ｑ－２１．２５～２３２．５μｍＬ，ＳｅｈａｒｏｓｅＦａｓｔＦｌｏｗ阴离子交换层析柱对α　　－葡萄糖苷酶的分离效ｇｐ果优于ＤＥ５２层析柱。－

［关键词］阴离子交换层析；分离纯化　脂环酸芽孢杆菌；α－葡萄糖苷酶；［中图分类号］８１４．１　Ｑ

［文献标识码］　Ａ

［（）文章编号］６７１９３８７２０１１１２０１９１０５　１－－－

Ｅｆｆｅｃｔｓｏｆｔｗｏｋｉｎｄｓｏｆａｎｉｏｎｅｘｃｈａｎｅｃｈｒｏｍａｔｏｒａｈ　　　　　　　ｇｇｐｙ

ｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎｌｕｃｏｓｉｄａｓｅｔｈｅｓｅａｒａｔｉｏｎａｎｄｏｆｉｎ　　　　　α－ｐｇｐ

ａａａａ，，ＹＵＡＮ　ＹａｈｏｎＣＡＩＲｕｉＹＵＥＴｉａｎｌｉＨＯＵＪｕｎｌｏｎ－　　　－　　－ｇ，ｇ，ａｂ，ＸＵＣｈａｎｕｎＧＵＯ　Ｋａｎｕａｎ　－－ｇｙｇｑ

（ａＣｏｌｌｅｅｏＦｏｏｄ　Ｓｃｉｅｎｃｅａｎｄ　ＥｎｉｎｅｅｒｉｎｂＣｏｌｌｅｅｏＭｅｃｈａｎｉｃａｌａｎｄ　ＥｌｅｃｔｒｏｎｉｃＥｎｉｎｅｅｒｉｎ　　　　　　ｇｆ　ｇｇ，ｇｆ　ｇｇ，

ＮｏｒｔｈｗｅｓｔＡ＆Ｆ　ＵｎｉｖｅｒｓｉｔＹａｎｌｉｎＳｈａａｎｘｉ７１２１００，Ｃｈｉｎａ）　　ｙ，ｇｇ，

：【】ＴＡｂｓｔｒａｃｔＯｂｅｃｔｉｖｅｈｅｒｅｓｅａｒｃｈｆｏｃｕｓｅｄｏｎｔｈｅｃｏｍａｒｉｓｏｎｂｅｔｗｅｅｎＱ－ＳｅｈａｒｏｓｅＦａｓｔＦｌｏｗａｎｄ　　　　　　　　　　ｊｐｐＤＥ５２ｉｎｔｈｅｓｅａｒａｔｉｏｎａｎｄｏｆｆｒｏｍＡｌｉｃｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓｃｏｎｔａｍｉｎａｎｓｗｈｉｃｈｗａｓｓｅｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎｌｕｃｏｓｉｄａｓｅ－　　　　　α－　　　　　－ｐｐｐｇｙ

，ａｒａｔｅｄｆｒｏｍｏｒｃｈａｒｄｏｆＳｈａａｎｘｉＰｒｏｖｉｎｃｅｉｎｏｒｄｅｒｔｏｔｅｃｈｎｉｃａｌｓｕｏｒｔｆｏｒｉｎｄｕｓｔｒｉａｌｓｃａｌｅｒｏｖｉｄｅｒｏｄｕｃ　　　　　　　　　　　　－　－ｐｐｐｐ【】，ｔｉｏｎｏｆαｌｕｃｏｓｉｄａｓｅ．ＭｅｔｈｏｄＦｉｒｓｔｌａｍｍｏｎｉｕｍｓｕｌｆａｔｅｗａｓｕｓｅｄｔｏｄｅｏｓｉｔｒｏｔｅｉｎｂｄｉｆｆｅｒｅｎｔｓａｔｕｒａ　－　　　　　　　　－ｇｐｙｐｙ　

，ｔｉｏｎｌｅｖｅｌｓｔｈｅｎｔｈｅｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅｄｓｏｌｕｔｉｏｎｗａｓｔｒｅａｔｅｄｂｔｈｅｔｗｏｋｉｎｄｓｏｆａｎｉｏｎｅｘｃｈａｎｅｃｈｒｏｍａｔｏｒａｈ．　　　　　　　　　　　　　ｙｇｇｐｙ　，Ａｆｔｅｒｔｈａｔｒｏｔｅｉｎｃｏｎｔｅｎｔａｎｄｅｎｚｍｅａｃｔｉｖｉｔｗｅｒｅｕｓｅｄｔｏｅｖａｌｕａｔｅｔｈｅｅｆｆｅｃｔｓｏｆｔｈｅｔｗｏｋｉｎｄｓｏｆａｎｉｏｎ　　　　　　　　　　　　　　　　ｐｙｙ　

【】Ｔｅｘｃｈａｎｅｃｈｒｏｍａｔｏｒａｈｉｎｔｈｅｓｅａｒａｔｉｏｎｏｆαｌｕｃｏｓｉｄａｓｅ．Ｒｅｓｕｌｔｈｅｒｅｓｕｌｔｓｓｈｏｗｅｄｏｎｅａｂｓｏｒｔｉｏｎ　　　　－　　　　ｇｐｙｐｐｇｇ　ｏｆαａｅａｒｅｄａｎｄｔｈｅｅｎｚｍｅａｃｔｉｖｉｔｗａｓ６．９９×１０　ＵａｆｔｅｒｔｈｅｔｒｅａｔｍｅｎｔｏｆＱ－Ｓｅｈａｅａｋｌｕｃｏｓｉｄａｓｅ　－　　　　　　　　　　　－ｐｐｙｙｐｐｇ　

／ｒｏｓｅＦａｓｔＦｌｏｗ，ａｎｄｔｈｅｃｏｎｔｅｎｔｗａｓｓｔｅａｄａｔａｂｏｕｔ２６．２５μｍＬｉｎｔｈｉｓａｂｓｏｒｔｉｏｎｔｈｅｒａｎｅｒｏｔｅｉｎｅａｋ；　　　　　　　　　　　　　　ｙｐｇｐｇｐ　

３

ｏｆａｂｓｏｒｔｉｏｎｗａｓｌａｒｅａｆｔｅｒｔｒｅａｔｅｄｂＤＥ５２ａｎｄｔｈｅｈｉｈｅｓｔｅｎｚｍｅａｃｔｉｖｉｔｗａｓ５．５６×１０ｅａｋｏｉｎｔ　　　　　　　－　　　　　　ｐｇｙｇｙｙｐｐ　　

３

＊

［收稿日期］０１１０７０６　２－－

［）；”）基金项目］农业部“项目（３１０７１５５０９４８２０１１８３　国家自然科学基金项目（－Ｇ－［］（），，，，，：作者简介　袁亚宏１９７１－女甘肃天水人副教授博士主要从事食品高新技术研究。Ｅ－ｍａｉｌｕａｎ３２４＠ｍｓｎ．ｃｏｍｙ［（），，，，，。通信作者］郭康权男陕西西安人教授博士生导师主要从事食品废弃物综合利用研究１９５５－　

：Ｅ－ｍａｉｌｄｋｗｓｕａｆ．ｅｄｕ．ｃｎ＠ｎｊｇｑ

１９２

西北农林科技大学学报（自然科学版）

第３９卷

／Ｕ，ｂｕｔｔｈｅｒｏｔｅｉｎｃｏｎｔｅｎｔｆｌｕｃｔｕａｔｅｄｆｒｏｍ２１．２５ｔｏ２３２．５μｍＬｉｎｔｈｉｓａｂｓｏｒｔｉｏｎｅａｋ，ｖａｒｉｎｉｎａｌａｒｅ　　　　　　　　　　　　　ｐｇｐｐｙｇｇ　

【】Ａｒａｎｅ．ＣｏｎｃｌｕｓｉｏｎｎｉｏｎｅｘｃｈａｎｅｃｈｒｏｍａｔｏｒａｈＱ－ＳｅｈａｒｏｓｅＦａｓｔＦｌｏｗｉｓｂｅｔｔｅｒｔｈａｎＤＥ５２ｉｎｔｈｅ　　　　　　　　－　ｇｇｇｐｙｐ　ｌｕｃｏｓｉｄａｓｅ．ｓｅａｒａｔｉｏｎｏｆα　－ｇｐ

：；；ＫｅｗｏｒｄｓＡｌｉｃｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓｃｏｎｔａｍｉｎａｎｓ；ｌｕｃｏｓｉｄａｓｅａｎｉｏｎｅｘｃｈａｎｅｃｈｒｏｍａｔｏｒａｈｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　α－　　ｇｇｇｐｙｐｙｙ　）是一类能够从低ｌｕｃｏｓｉｄａｓｅ　　α－葡萄糖苷酶（α－ｇ

聚糖类底物的非还原末端切开α１，４糖苷键的酶－类，其水解过程伴随着葡萄糖的释放，或者将游离出的葡萄糖残基转移到麦芽糖、麦芽３蔗糖等另５糖、－形成α经过水解后形外的糖类底物上，１，６糖苷键，－成非发酵性的低聚异麦芽糖或其相应的糖酯、糖肽

］１２－

。作为酶制剂中的重要分支，等［α－葡萄糖苷酶主

厦门中村光学仪器ＨＪ３数显恒温磁力搅拌器，－

厂；日本岛津公司；ＵＶ２５５０紫外分光光度计，ＳＢＳ－－上海青浦沪西仪器１６０数控计滴自动部分收集器，

北京哲成科技厂；ＢＪＢＬＡＡ１０００微孔滤膜过滤器，－有限公司。

１．２　Ａ．ｃｏｎｔａｍｉｎａｎｓ菌株的发酵

从斜面挑取Ａ．ｃｏｎｔａｍｉｎａｎｓ菌株接种于１００

／ｍＬ的ＡＡＭ液体培养基中，４５℃摇床（１９０ｒｍｉｎ）

培养２以５％接种量接种于４ｈ作为种子培养液，摇床培养１取培养液于２５０ｍＬ三角摇瓶中，２０ｈ，

／，收集上清。８０００ｒｍｉｎ离心１０ｍｉｎ　

１．３　粗酶制备

将上清液转移至烧杯，在恒温磁力搅拌器上边搅动边慢慢加入磨碎的硫酸铵粉末沉淀蛋白，当上，上清液于４清液达到２５％饱和度后再搅拌３０ｍｉｎ℃冰箱过夜后离心弃去杂蛋白并收集上清液。然后

直到溶液饱和继续加入硫酸铵粉末进行蛋白沉淀，

度达到７于４℃冰箱过夜，离心收集蛋白沉５％后，将蛋白溶于少量ｐ透析淀，Ｈ５．４的乙酸缓冲液中，　过夜，０．４５μｍ超滤膜过滤除去蛋白溶液杂质。１．４　２种阴离子交换柱的分离纯化

根据α－葡萄糖苷酶的分子质量大小和对不同层析材料的亲和力，采用Ｑ－ＳｅｈａｒｏｓｅＦａｓｔＦｌｏｗ和　　ｐ

ＤＥＡＥＥ５２进行α－纤维素Ｄ－－葡萄糖苷酶的分离纯化。

１．４．１　Ｑ－ＳｅｈａｒｏｓｅＦａｓｔＦｌｏｗ分离纯化　用ｐＨ　　ｐ

／５．４的０．０２ｍｏｌＬ磷酸缓冲液冲洗Ｑ－Ｓｅｈａｒｏｓｅｐ至流出液的电导和ｐＦｌｏｗ离子交换柱，Ｈ保持Ｆａｓｔ　

恒定不变；将透析得到的蛋白质溶液加到阴离子交，换柱上（上样量为２ｍ用０～０．２．０ｃｍ×１０ｃｍ）Ｌ；５／（同样缓冲液配制）进行梯度洗脱，流ｍｏｌＬ的ＮａＣｌ

／速２ｍ调节收集器的时间间隔为４ｍ用Ｌｍｉｎ；ｉｎ，试管收集洗脱液，每管５ｍ在２Ｌ；８０ｎｍ波长处测定并测酶活性。收集酶活洗脱液中蛋白质的吸光度，

性高的各管溶液于透析袋中，用ＰＥＧ２００００浓缩，－除去水分及小分子杂质。最后将透析袋放入０．２／即可得到Ｑ－Ｌ叠氮钠溶液中透析１ｈ，Ｓｅｈａｒｏｓｅｐｇ

Ｆｌｏｗ纯化的αＦａｓｔ　－葡萄糖苷酶。１．４．２　ＤＥ５２分离纯化　将透析浓缩后的酶液加－

要参与动物体内的糖代谢、降解植物体中可溶性淀粉形成葡萄糖以及参与微生物糖代谢的非磷酸途

］３４－

。径，具有非常重要的生物性功能［

关于α当前主要集中－葡萄糖苷酶的应用研究，

］］５６７８－－

、、于医学领域［新型低聚异麦芽糖生产［啤酒的］９］１０１１１２］－、口感改善［淀粉的生产［以及麦芽糖检测［等

多个方面。同时，由于α－葡萄糖苷酶在实际应用中需要精分离高纯度，故其分离纯化也是研究的重点之一。目前，对于酶的分离纯化，主要有盐析、有机溶剂沉淀、离子交换层析、凝胶过滤层析、超滤技术、聚丙烯酰胺凝胶电泳等多种方法，其中离子交换层重复性好、选择性强、分析速度析法以其灵敏度高、

快等优点，在酶和蛋白质分离纯化中得到了广泛应

］１３１４－

。有文献报道，脂环酸芽孢杆菌Ａ用［ｌｉｃｌｏｂａ－ｙ［１５］

ｃｉｌｌｃｏｎｔａｍｉｎａｎｓ中α　－葡萄糖苷酶的活性较高。为此，本研究采用２种不同的阴离子交换柱对脂环

酸芽孢杆菌Ａ．ｃｏｎｔａｍｉｎａｎｓ中的α－葡萄糖苷酶进行分离纯化，以期得到对其分离纯化效果较好的柱材，为α同时－葡萄糖苷酶的进一步分离纯化奠定基础，也为α－葡萄糖苷酶的规模化生产提供技术支持。

１　材料与方法

试剂与仪器１．１　材料、

脂环酸芽孢杆菌Ａｌｉｃｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓｃｏｎｔａｍｉ　－ｙ

分离自陕西某果园，实验室保存，发酵培养用ｎａｎｓ，

［６］

。ＡＡＭ培养基１

Ｑ－ＳｅｈａｒｏｓｅＦａｓｔＦｌｏｗ，ＡｍｅｒｓｈａｍＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ　　　ｐ

公司；北京瑞达恒辉科技发展ＤＥＡＥＥ５２，－纤维素Ｄ－，有限公司；对硝基苯－ＮＰＧ）Ｓｉｍａα－Ｄ－葡萄糖苷（ｐｇ

，公司；对硝基苯酚（杭州凯佳化工有限公司；ＰＮＰ）牛血清白蛋白，中科瑞泰（北京）生物科技有限公司；，考马斯亮蓝Ｇ北京瑞尔欣德科技有限公司。２５０－

第１２期袁亚宏，等：２种阴离子交换柱对α－葡萄糖苷酶的分离纯化效果

１９３

／至预先用ｐＨ５．４的０．０２ｍｏｌＬ醋酸－醋酸钠缓冲　，液平衡的ＤＥ５２离子交换柱上（２．０ｃｍ×１０ｃｍ）－／（上样量２ｍ用０～０．同样缓冲Ｌ，５ｍｏｌＬ的ＮａＣｌ

／；液配制）进行梯度洗脱，恒流泵流速２ｍ使用Ｌｍｉｎ部分收集器收集洗脱液，每管收集５ｍ在２Ｌ，８０ｎｍ波长处测定每管的蛋白质吸光值，并测定酶活性，收用Ｐ集酶活性高的各管，ＥＧ２００００浓缩。－１．５　α－葡萄糖苷酶活性的测定

１．５．１　标准曲线的绘制　准确称取对硝基苯酚

，用蒸馏水定容至１１３９．０ｍ０００ｍＬ容量瓶。再从　ｇ中吸取１，２，３，４，５，６ｍＬ溶液分别至６个１００ｍＬ／容量瓶中，用１ｍｏｌＬ的ＮａＣＯ２３溶液定容后混匀，最终使１ｍＬ稀释液中分别含有０，１０，３０，５０，７０，９０并ｍｍｏｌ对硝基苯酚。在４０５ｎｍ处测定吸光度值，

绘制标准曲线。

ＮＰＧ为底１．５．２　α－葡萄糖苷酶活性的测定　以ｐ

／、取２物，００μＬＮＰＧ溶液（１ｍｍｏｌＬ）６００μＬ乙酸－　ｐ，／乙酸钠缓冲溶液（和２Ｈ５．４５０ｍｍｏｌＬ）００μＬ酶　ｐ

，／于５以１ｍ液，２℃水浴中反应３０ｍｉｎｏｌＬＮａＣＯ　２３终止反应，反应结束后在４０５ｎｍ下测定对硝基苯酚的吸光值。为５１个酶活力单位（Ｕ）２℃、５．４下，Ｈ　ｐ１ｍｉｎ催化产生１μｍｏｌ对硝基苯酚需要的酶量。

α－葡萄糖苷酶活性的计算公式为：·。

Ｕ）＝α－葡萄糖苷酶活性（３

Ａ４３．５×１００６×

；式中：２００为反应过程中加入的酶量（Ｌ）３０为反μ

）；应时间（ｍｉｎＫ为标准曲线系数；Ａ４０５为测定的吸

。光度值；３．５为反应总体积（ｍＬ）１．６　蛋白质含量的测定

１７］

。在２采用紫外吸收法测定［８０ｎｍ波长处，

测定牛血清蛋白质量浓度为０，２０，４０，６０，８０，１００／绘制标准曲线，计ｍＬ时标准溶液的吸光度值，ｇμ

算样品中的蛋白质含量。

样品蛋白质含量的计算公式为：

Ａ２８０

（／。ｃｍＬ）＝ｇμＫ

式中：ｃ为蛋白质含量；Ｋ为标准曲线系数；Ａ２８０为测定的吸光度值。

２　结果与分析

标准曲线２．１　对硝基苯酚（ＰＮＰ）

以４以０５ｎｍ波长处测得的吸光度值为纵坐标，反应体系中对硝基苯酚的终浓度为横坐标，绘制ＰＮＰ标准曲线如图１所示。标准曲线方程为ｙ＝

。其中ｙ为溶液在４相关系数为００．００１８ｘ，．９９８０５　，ｎｍ波长处的吸光度值（Ａｘ为对硝基苯酚浓度。４０５）２．２　蛋白质含量标准曲线

用紫外吸收法测定蛋白质得到的标准曲线如图２所示。标准曲线方程为ｙ＝０．００５７ｘ＋０．００８７，　　

相关系数为０．９９８７。其中ｙ为溶液在２８０ｎｍ处的　，吸光度值（Ａ２ｘ为牛血清蛋白质含量

。８０）

图１　对硝基苯酚的标准曲线Ｆｉ．１　ＰＮＰｓｔａｎｄａｒｄｃｕｒｖｅ　　ｇ

图２　蛋白质含量测定的标准曲线Ｆｉ．２　Ｐｒｏｔｅｉｎｓｔａｎｄａｒｄｃｕｒｖｅ　　ｇ

２．３　Ｑ－ＳｅｈａｒｏｓｅＦａｓｔＦｌｏｗ分离纯化　　ｐ

取２ｍ缓慢加入到Ｌ盐析后适度浓缩的样品，Ｑ－ＳｅｈａｒｏｓｅＦａｓｔＦｌｏｗ层析柱中。记录洗脱液在　　ｐ

并测定α２８０ｎｍ处的光吸收值，－葡萄糖苷酶的活（性，绘制曲线如图３所示。由图３可以看出：经１）过硫酸铵分级沉淀得到的粗酶，能够通过Ｑ－Ｓｅｈａ－ｐ

ｒｏｓｅＦａｓｔＦｌｏｗ进行进一步的分离纯化。经过洗　　

脱，出现２个蛋白吸收峰和１个酶吸收峰，蛋白吸收而酶吸收峰明显，两者间隔分明，没有重叠；峰较低，

（）经过Ｑ－蛋２ＳｅｈａｒｏｓｅＦａｓｔＦｌｏｗ层析柱洗脱后，　　ｐ白质在第１～５管、第１６～２２管各出现１个吸收峰，且在第３～１根据标准曲线计８管各出现１个峰值，

１９４

西北农林科技大学学报（自然科学版）

第３９卷

算得此时的蛋白含量分别为１４６．２５和９２．５／但在这２个蛋白峰的管内，ｍＬ，α－葡萄糖苷酶的ｇμ

（）甚至没有；在第２活性均很低，３５～３５管出现１个

酶活吸收峰，在第２由公式计９管出现酶活的峰值，

３　

算得其最大酶活为６．而在此范围内，蛋９９×１０Ｕ，

／白质的含量约为２６．２５μｍＬ

。ｇ

图３　Ｑ－ＳｅｈａｒｏｓｅＦａｓｔＦｌｏｗ对α　　－葡萄糖苷酶的分离纯化ｐ

ｌｕｃｏｓｉｄａｓｅＦｉ．３　ＲｅｓｕｌｔｓｏｆｓｅａｒａｔｉｏｎｏｆαｂＱ－ＳｅｈａｒｏｓｅＦａｓｔＦｌｏｗ　　　－　　　ｇｇｐｙｐ　

２．４　ＤＥ５２分离纯化－

取２ｍ用ＤＬ盐析后适度浓缩的样品，Ｅ５２层－记录洗脱液在２析柱进行分离纯化，８０ｎｍ处的吸光度值，并检测α绘制曲线如图４－葡萄糖苷酶的活性，（所示。由图４可以看出：经Ｄ１）Ｅ５２阴离子交换－蛋白质在第３～１柱分离纯化后，１管和第１７～３３管各出现１个吸收峰，而α３～－葡萄糖苷酶酶活在第２

酶活吸收峰与蛋白的第２个４６管出现１个吸收峰，

（）吸收峰有部分重叠；第３～１２１管之间的吸收峰在／其蛋白质含量为１第６管出现１个峰值，５０μｍＬ，ｇ

第２个峰值在第２其蛋白质含量为３４管出现，１０／酶活性吸收峰值在第３其活性为ｍＬ，５管出现，ｇμ

３　

在酶活吸收峰内，蛋白质含量为５．５６×１０Ｕ，／变化范围较大

。２１．２５～２３２．５μｍＬ，ｇ

图４　ＤＥ５２对α－－葡萄糖苷酶的分离纯化

ｌｕｃｏｓｉｄａｓｅＦｉ．４　ＲｅｓｕｌｔｓｏｆｓｅａｒａｔｉｏｎｏｆαｂＤＥ５２　　　－　－ｇｇｐｙ　

３　结　论

本研究以从陕西某果园分离到的１株Ａｌｉｃｙ－对其发酵液中的αｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓｃｏｎｔａｍｉｎａｎｓ为材料，　－

葡萄糖苷酶进行了分离，经过硫酸铵分级沉淀之后，

Ｑ－ＳｅｈａｒｏｓｅＦａｓｔＦｌｏｗ层析柱和ＤＥ５２层析柱对　　－ｐ

蛋白质洗脱液α－葡萄糖苷酶均有一定的分离作用，

出现２个峰，而酶活均只有１个吸收峰，可见２种阴离子交换柱对α－葡萄糖苷酶有相似的分离作用。经过Ｑ－ＳｅｈａｒｏｓｅＦａｓｔＦｌｏｗ分离纯化的α　　－葡萄糖苷ｐ

第１２期袁亚宏，等：２种阴离子交换柱对α－葡萄糖苷酶的分离纯化效果

６４０．

１９５

／酶在蛋白质含量为２６．２５μｍＬ左右时有吸收峰ｇ值，分离效果良好；而ＤＥ５２分离纯化后的α－－葡萄且在这个吸收峰内，糖苷酶酶活吸收峰的跨度较大，

／蛋白质含量为２变化范围较１．２５～２３２．５μｍＬ，ｇ大，说明其分离效果较差。

综上所述，分别采用Ｑ－ＳｅｈａｒｏｓｅＦａｓｔＦｌｏｗ和　　ｐＤＥ５２２种阴离子层析柱对脂环酸芽孢杆菌产生的－　

Ｑ－ＳｅｈａｒｏｓｅＦａｓｔα－葡萄糖苷酶进行分离纯化时，　ｐＦｌｏｗ阴离子交换柱对α－葡萄糖苷酶的分离纯化效

果优于Ｄ该研究为以后的αＥ５２阴离子交换柱，－－葡萄糖苷酶纯化工作奠定了基础，同时也为Ａｌｉｃｙ－

［］７ｏｎｉｓｈｉＭ，ＦｕｋｕｏｋａＴ，ＳｈｉｍａｎｅＹ，ｅｔａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓｎｔｈｅｓｉｓ　Ｋ　　　　　ｙ

，ｏｆｎｏｖｅｌｓｅｌｆａｓｓｅｍｂｌｉｎｌｃｏｌｉｉｄｓｆｒｏｍｒｉｃｉｎｏｌｅｉｃａｃｉｄｂａｒｅ　－　　　　　－ｇｇｙｐｙ　　］ｃｏｍｂｉｎａｎｔαｌｕｃｏｓｉｄａｓｅｆｒｏｍＧｅｏｂａｃｉｌｌｕｓｓＪ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏ－　　－ｇｐ［，Ｌｅｔｔｅｒｓ２０１１，３３：１３９１４５．－ｇｙ　

［］８ｉｍｉｂｏｏｎＰ，ＮａｋａｏｎＳ，ＰｉｃｈａｎｋｕｒａＲ，ｅｔａｌ．Ｓｎｔｈｅｓｉｓｏｆ　Ｎ　　　　ｐｐｇｙｇｙ　

ａｎｏｖｅｌｒｅｂｉｏｔｉｃｔｒｉｓａｃｃｈａｒｉｄｅｂａｔｅⅠαｌｕｃｏｓｉｄａｓｅｆｒｏｍ　　　　　－　ｙｙｐｐｇ　，Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｏｒｍｉｓｓｔｒａｉｎＴＨ４２［Ｊ］．ＰｒｏｃｅｓｓＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒ　　－　ｙｆ２０１１，４６：４４８４５７．－

［］］低醇甜味啤酒与低醇奶味啤酒的研制［酿酒，９Ｊ．　马雅娥．

（）：２００４，３１６６１６２．－

ＭａＹＥ．Ｔｈｅｄｅｖｅｌｏｍｅｎｔｏｆｌｏｗａｌｃｏｈｏｌｓｗｅｅｔａｎｄｌｏｗａｌｃｏｈｏｌ　　　　　　　　　　ｐ］，（）：（）ｍｉｌｋｂｅｅｒ［Ｊ．ＬｉｕｏｒＭａｋｉｎ２００４，３１６６１６２．ｉｎＣｈｉｎｅｓｅ　　－　ｑｇ［］１０ａｒｔｉｎｏＡ，ＳｃｈｉｒａｌｄｉＣ，ＦｕｓｃｏＳ．Ｐｒｏｅｒｔｉｅｓｏｆｔｈｅｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　Ｍ　　　　　　ｐ

ｌｕｃｏｓｉｄａｓｅｆｒｏｍ　Ｓｕｌｏｌｏｂｕｓｓｏｌａｔａｒｉｃｕｓｉｎｒｅｌａｔｉｏｎｔｏα－　　　　　ｇｆｆ］ｓｔａｒｃｈＪ．ＪｏｕｒｎａｌｏｆＭｏｌｅｃｕｌａｒＣａｔａｌｓｉｓＢｅｎｚｒｏｃｅｓｓｉｎ　　　　　－－ｙｙｐｇ［，ｍａｔｉｃ２００１，１１：７８７７９４．－

［］１１ｄｚｉｅｂｌｏＡ，ＳｎｏｗｉｅｃｋｉＪ．Ｎｅｗｓｏｕｒｃｅｏｆｔｈｅｔｈｅｒｍｏｓｔａｂｌｅα　Ｚ　　　　　　－ｙ

ｌｕｃｏｓｉｄａｓｅｒｏｃｅｓｓｉｎｓｕｉｔａｂｌｅｆｏｒｓｉｎｌｅｓｔｅｓｔａｒｃｈＪ］．　　　　　ｇｇｐｐｇ［　，Ｃｈｅｍｉｓｔｒ２００２，７９：４８５４９１．Ｆｏｏｄ　－ｙ

［］１２ｉｌｅｋＯ，ＡｚｍｉＴ，ＳｕｎａＴ．Ｍａｌｔｏｓｅｂｉｏｓｅｎｓｉｎｂａｓｅｄｏｎｃｏｉｍ－　Ｄ　　　　　　－ｇ　

］ｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎｏｆａｌｈａａｎｄｏｘｉｄａｓｅ［Ｊ．ｌｕｃｏｓｉｄａｓｅｒａｎｏｓｅ　　－　　　ｐｇｐｙ，（）：Ｂｉｏｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉｓｔｒ２０１０，７９１１０８１１３．－ｙ

［］蛋白质工程［北京：科学出版社，１３Ｍ］．２００８：２０９２１７．　汪世华．－

：，ＳＨ．ＰｒｏｔｅｉｎｅｎｉｎｅｅｒｉｎＭ］．ＢｅｉｉｎＳｃｉｅｎｃｅＰｒｅｓｓＷａｎ　　　ｇｇｇ［ｊｇ　（）２００８：２０９２１７．ｉｎＣｈｉｎｅｓｅ－　

］［赵　佳．离子交换层析技术在多糖分离纯化中的应用１４　司　波，

［］（）：科技风，Ｊ．２００９１８２０３．

ＳｉＢ，ＺｈａｏＪ．Ｔｈｅａｌｉｃａｔｉｏｎｏｆｉｏｎｅｘｃｈａｎｅｃｈｒｏｍａｔｏｒａｈ　　　　　－　ｐｐｇｇｐｙｉｎｔｈｅｓｅａｒａｔｉｏｎａｎｄｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｏｌｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ［Ｊ］．　　　　　　ｐｐｐｙ，（）：（）ＴｅｃｈｎｏｌｏＴｒｅｎｄ２００９１８２０３．ｉｎＣｈｉｎｅｓｅ　ｇｙ　

［］１５ａｎＹ，ＹｕｅＴＬ，ＹｕａｎＹ　Ｈ，ｅｔａｌ．Ｉｓｏｌａｔｉｏｎａｎｄｉｄｅｎｔｉｆｉｃａ　Ｗ　　　　　　－ｇ　

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［］１６ｏｔｏＫ，ＮｉｓｈｉｂｏｒｉＡ，ＷａｓａｄａＹ．Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｔｈｅｒｍｏａｃｉ　Ｇ　　　　　－－

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２０８．

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ｃｏｓｉｄａｓｅｆｒｏｍ　ＴｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒｔｅｎｃｏｎｅｎｓｉｓＭＢ４ｂｓｉｎ　　　－ｙｇｇ　］ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ［Ｊ．ＪｏｕｒｎａｌｏｆＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅａｎｄＢｉｏｅｎｉｌｅｒａｌｉｎｅ　　　　　　－ｇｇｐ，（）：ｎｅｅｒｉｎ２０１０，１１０１１２１７．－ｇ

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］，［４ｏｎｓｅｃａＦ，ＳｉｌｖａＪＳａｍｕｅｌｓＲ，ｅｔａｌ．Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎａｎｄａｒｔｉａｌｃｈａｒａｃ　Ｆ　　　　　　　－ｐ

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［］５ａｒｉｎｔｈｎｕｋｒｏｗｈＰ，ＴｏｎｋｏｂｅｔｃｈＳ，ＫｏｎａｔａｎａｏｔｈｉｎＡ，ｅｔ　Ａｍ　　　ｇｐｇｐｙ

ａｌ．．Ｄ６４５Ｅｏｆａｃｉｄａｌｈａｉｓｔｈｅｍｏｓｔｃｏｍｍｏｎｍｕｌｕｃｏｓｉｄａｓｅ　　－　　　　　－ｐｐｇ］ｔａｔｉｏｎｉｎｔｈａｉａｔｉｅｎｔｓｗｉｔｈｉｎｆａｎｔｉｌｅｏｎｓｅｔｏｍｅｄｉｓｅａｓｅ［Ｊ．　　　　　－　　ｐｐｐ，：ＧｅｎｅｔｉｃＴｅｓｔｉｎａｎｄＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｍａｒｋｅｒｓ２０１０，１４（６）８３５　　　－ｇ　８３７．

［］，６ｕａｎＪＨ，ＹａｎＣ　Ｗ，ＳｕＩＪｅｔａｌ．ＨｅａｔｉｔｉｓＢｖｉｒｕｓｓｕｒｆａｃｅ　Ｈ　　　　　　　　ｇｐ　

ｉｎｔｅｒａｃｔｓｗｉｔｈａｃｉｄａｌｈａａｎｄａｌｔｅｒｓｌｕｃｏｓｉｄａｓｅｌｃｏａｎｔｉｅｎ　　　　－　　　－ｐｇｇｙｇ］，：ｅｎｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ［Ｊ．ＨｅａｔｏｌｏＲｅｓｅａｒｃｈ２０１０，４０（６）６３３　－ｇｐｇｙ　

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［］２１ｕａｎＪＷ，ＹａｎＪＫ，ＤｕａｎＹ　Ｑ，ｅｔａｌ．Ｂａｃｔｅｒｉａｌｄｉｖｅｒｓｉｔｉｅｓｏｎ　Ｈ　　　　　　ｇｇ　　

ｕｎａｅｄａｎｄａｉｎｆｌｕｅｃｕｒｅｄｔｏｂａｃｃｏｌｅａｖｅｓｅｓｔｉｍａｔｅｄｂ１６Ｓ　　－　　　　ｇｇｇｙ　　］ｓｅｕｅｎｃｅａｎａｌｓｉｓ［Ｊ．ＡｌｌｉｅｄＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏａｎｄＢｉｏｒＲＮＡ　　　　－ｑｙｐｐｇｙ　，（）：ｔｅｃｈｎｏｌｏ２０１０，８８２５５３５６２．－ｇｙ

［］２２ｈａｏＭ　Ｑ，ＷａｎＢＸ，ＬｉＦＸ，ｅｔａｌ．Ａｎａｌｓｉｓｏｆｂａｃｔｅｒｉａｌｃｏｍ－　Ｚ　　　　　　　　ｇｙ　

ｍｕｎｉｔｉｅｓｏｎａｉｎｆｌｕｅｃｕｒｅｄｔｏｂａｃｃｏｌｅａｖｅｓｂ１６ＳｒＤＮＡ　　－　　　ｇｇｙ　　

］ＰＣＲ－ＤＧＧＥｔｅｃｈｎｏｌｏＪ．ＡｌｌｉｅｄＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏａｎｄＢｉｏ　　　－ｇｙ［ｐｐｇｙ　，（）：ｔｅｃｈｎｏｌｏ２００７，７３６１４３５１４４０．－ｇｙ

［］２３ｉｃｈｅｌｅＤＧ，ＭａｒｉａｎｎａＰ，ＤａｎｉｅｌｅＳ，ｅｔａｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉａｌｃｏｍｍｕ　Ｍ　　　　　　－

ｎｉｔｓｔｒｕｃｔｕｒｅａｎｄｄｎａｍｉｃｓｏｆｄａｒｋｆｉｒｅｃｕｒｅｄｔｏｂａｃｃｏｆｅｒｍｅｎ　　　　　－　　－ｙｙ　］，ｔａｔｉｏｎ［Ｊ．ＡｌｌｉｅｄａｎｄＥｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌＭｉｃｒｏｉｏｌｏ２００７，７３　　　ｐｐｇｇｙ（）：３８２５８３７．－