阴道上皮细胞的抗念珠菌作用及雌激素对此的影响
现代妇产科进展2004年11月第13卷第6期 Prog Obstet G ynecol ,N ov. 2004,V ol. 13,N o. 6
・论著・
阴道上皮细胞的抗念珠菌作用及雌激素对此的影响
牛战琴, 石一复, 吕时铭, 叶 红
(浙江大学医学院附属妇产科医院, 杭州 310006)
【摘要】 目的:研究阴道上皮细胞对白色念珠菌生长的抑制作用及雌激素对此作用
的影响。方法:用酶消化法分别分离雌激素处理组、动情间期组和去势组小鼠阴道上皮细胞作为效应细胞, 白色念珠菌芽生孢子作为靶细胞, 将效靶细胞共同孵育9h , 测定白色念珠菌生长抑制率, 观察其生长密度及透射电镜下超微结构的改变。结果:白色念珠菌与阴道上皮细胞共同孵育后, 生长受到抑制, 生长密度降低, 超微结构表现为与阴道上皮细胞靠近的念珠菌细胞壁崩解, 细胞膜连续性破坏, 甚至细胞器肿胀溶解。雌激素处理组与去势组和动情间期组比较, 阴道上皮细胞对念珠菌的生长抑制率降低(P
【关键词】 上皮细胞, 阴道; 念珠菌, 白色; 生长抑制; 雌激素; 小鼠中图分类号:R339.2 文献标识码:A 文章编号:1004-7379(2004) 06-0416-03Anti 2Candida activity mediated by vaginal epithelial cells from mice and the effect of estrogen on it. Niu Zhanqin , Shi Yif u , L üShiming , et al. Women ′s Hospital , School o f Medicine , Zhejiang Uni 2
ver sity , Hangzhou 310006
【Abstract 】 Objective :T o investigate the growth inhibition to Candida albicans mediated by vaginal epithelial cells and determine if estrogen affected the activity. Methods :C57BL/6J mice vaginae from estrogen treatment group , diestrus group and ovariectomized group were excised respec 2tively. The vaginae were diss ociated into single cell suspension by dispase and collagenase Ⅰ. Im 2munohistochemical analyse of the separated cells dem onstrated that over 80%were vaginal epithelial cells. The epithelial enriched cells were used as effector cells. Stationary 2phase blastoconidia of C. albicans strains were used as target cells. A fter 9h coincubation of effector (E ) with target (T ) at various ratios , C. albicans growth density was observed by upside 2down microscopy. The incorpo 2
H rated 32glucose was measured by liquid scintillation and the percent growth inhibition of C. albi 2
cans was calculated. The ultra 2structural changes were observed by transmission electron mi 2
croscopy. R esults :A fter 9h coincubation of effector cells with target cells , growth density of C. al 2
bicans was visibly reduced and it ′s growth activity was inhibited. C om pared to ovariectomized group
and diestrus group , epithelial cells from estrogen 2treated mice had less ability to inhibit the growth of C. albicans (P
【K ey w ords 】 E pithelial cell ,vaginal ; Candida albicans ; G rowth inhibition ; Estrogen ;Mice 外阴阴道念珠菌病(vulv ovaginal candidiasis , VVC ) 的发病率及复发率很高,5%的妇女发生复发416
性外阴阴道念珠菌病, 而患者无明显的易感因素, 研究VVC 的发病机理及其易感因素, 可为从微生态学
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方面进行防治, 降低发病率和复发率提供理论依据。阴道局部的天然和获得性细胞免疫在真菌感染中可能起着重要的作用1。现我们试图对阴道局部的天然免疫机制之一, 即阴道上皮细胞的天然抗念珠菌作用及雌激素对此作用的影响进行探讨。
1 材料与方法
1. 1 动物 18~20g C 57BL/6J 雌性清洁级小鼠, 购自本校动
物实验中心并于此中心有封闭系统的设施环境中饲养。氯胺酮麻醉下为小鼠行去势手术, 随机将术后小鼠分为去势组
9只, 每只皮下注射精炼茶油0. 05ml ; 雌激素处理组9只, 每
只皮下注射苯甲酸雌二醇0. 1mg/0. 5ml , 隔日1次, 共4次, 注射完成后第2天进行实验。在同环境同体重范围的小鼠中经阴道脱落细胞学检查捡出动情间期小鼠9只作为动情间期组。
1. 2 试剂 广谱单克隆角蛋白抗体购自武汉博士德公
司, 3H 2葡萄糖购自中国同位素上海分公司系Asherman 公司产。苯甲酸雌二醇和精炼茶油系上海通用药业股份有限公司产。
1. 3 阴道上皮细胞的制备 分别将3组小鼠脱臼处死, 酒
精消毒, 分离阴道, 用1000U/ml 青链霉素P BS 漂洗3遍, 去除宫颈, 剪碎,20ml 混合消化液(0. 6U/ml Dispase :2mg/ml Ⅰ型胶原酶=1:1) 37℃摇床消化2. 5h , 过滤, 离心, 去上清,P BS 洗涤2次, 加低糖DME M 培养液(10%胎牛血清,100U/ml 青链霉素) 制成细胞悬液, 细胞计数板计数, 调整细胞密度, 分别为4×105/ml ,2×105/ml ,1×104/ml 。
1. 4 细胞活力的检测和细胞纯度的鉴定1. 4. 1 苔盼蓝排斥试验检测细胞活力。
1. 4. 2 细胞纯度的鉴定 将阴道细胞悬液涂布于载玻片,
冷丙酮固定20min , 用广谱单克隆角蛋白抗体进行链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶连结法(SP 法) 免疫组织化学方法染色, 阳性为阴道上皮细胞, 胞浆呈黄棕色, 衬染的核呈蓝色, 阴性细胞胞浆无色, 核呈蓝色。在5个视野观察100个细胞, 计算上皮细胞比例。设立阳性对照组(阴道组织石蜡切片) 、空白及阴性对照组(成纤维细胞) 。
1. 5 白色念珠菌细胞的制备 用白色念珠菌标准株AT CC 90028, 由本院检验科保存, 转种于37℃沙氏葡萄糖琼脂培养
基,2d 后再转种1次。选取其中生长良好的单一菌落, P BS 洗涤两次, 低糖DME M 培养液重悬, 调整细胞浓度为1×104/
ml 备用。
1. 6 白色念珠菌生长抑制率的测定 对Djeu 检测念珠
菌3H 2葡萄糖摄入法2稍作改进, 以阴道上皮细胞为效应细胞, 白色念珠菌为靶细胞, 分别按效靶比40:1,20:1,1:1, 一式3份向96孔板加入100μl 阴道上皮细胞、100μl 白色念珠菌、1μCi 3H 2葡萄糖, 对照孔为单独孵育的效靶细胞,37℃,6%
C O 2孵育9h 后, 倒置显微镜下观察不同效靶比混合培养孔
和白色念珠菌单独培养孔中白色念珠菌的生长密度。然后每孔加入100μl 6%次氯酸钠, 作用5min , 用多头细胞样品收集器(绍兴卫星医疗设备制造有限公司) 将细胞收集至玻璃
纤维滤纸上, 自然干燥后, 加闪烁液, 在LS 6500多功能液闪
计数仪(美国Beckman 公司) 上测定每分钟脉冲数(cpm ) , 计算3孔每分钟液闪计数值的均值。
白色念珠菌生长抑制百分率={1-(共培养细胞cpm -阴道上皮细胞cpm ) /白色念珠菌cpm }×100
1. 7 电镜观察白色念珠菌的超微结构 取8只动情间期小
鼠制备阴道上皮细胞, 培养液为高糖DME M , 按效靶比20:1将阴道上皮细胞和白色念珠菌共同接种于培养瓶中, 同时将单独的白色念珠菌接种于另一培养瓶中,37℃6%CO 2孵育
9h , 倒置显微镜观察后, 将细胞悬液移入离心管,2000r/min ,
离心10min , 去上清, 用2. 5%戊二醛固定沉淀的细胞团, 然后用锇酸后固定、滴膜、脱水、切片、染色, 置透射电镜下观察。
1. 8 统计学处理 白色念珠菌生长抑制率测定实验重复3
次, 计算3次生长抑制率的平均值, 用SPSS 统计分析软件进行单因素方差分析, P
2 结 果
2. 1 细胞活力的检测和细胞纯度的鉴定 小鼠阴
道细胞活力可达90%~95%。阴道上皮细胞占制备阴道细胞的80%~85%。2. 2 白色念珠菌生长状况的检测2. 2. 1 倒置显微镜下观察 白色念珠菌芽生孢子经DME M 培养液孵育9h 后, 细胞明显由酵母相向菌丝相转化, 开始发芽、呈球拍状, 很快假菌丝密集交错、生长旺盛。阴道上皮细胞和白色念珠菌共孵育9h 后, 随着效靶比的升高, 念珠菌生长密度减低, 且几乎每个念珠菌细胞都与阴道上皮细胞靠近粘附。2. 2. 2 白色念珠菌生长抑制率的测定 以念珠菌摄取葡萄糖的能力表示其生长活力, 实验证实, 阴道上皮细胞具有天然的抑制念珠菌生长的作用, 动情间期组和去势组间的抑制率无差异, 雌激素处理组抑制率较前两组明显降低(P
。
图1 雌激素对小鼠阴道上皮细胞抗念珠菌作用的影响
动情间期组和去势组间抑制率无差异(P >0. 05) , 雌激素处理组抑制率较前两组明显降低(P
2. 2. 3 电镜观察 白色念珠菌单独孵育9h 后, 电
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镜下观察其结构完整, 有厚细胞壁及完整细胞膜, 内
部结构密实均匀, 可见出芽。白色念珠菌与阴道上皮细胞共孵育9h 后, 与阴道上皮细胞靠近的念珠菌细胞壁崩解, 细胞膜连续性破坏, 细胞器肿胀, 结构模糊不清, 甚至坏死溶解。3 讨 论
对于局部粘膜念珠菌病, 局部的细胞免疫机制
较系统的细胞免疫和体液免疫机制发挥着更重要的保护作用1。这包括天然的和获得性的细胞免疫, 哪种机制发挥着更重要的防御功能尚无定论。我们对小鼠阴道上皮细胞对白色念珠菌的作用进行了体外研究, 结论与Steele 3的报道相符, 即阴道上皮细胞具有天然的抑制白色念珠菌生长的作用。进一步用电镜观察, 见阴道上皮细胞对念珠菌的抑制作用不仅表现在念珠菌摄糖能力下降, 而且超微结构发生变化, 如细胞壁崩解, 细胞膜连续性破坏, 甚至细胞浆内结构模糊, 这种变化可能是不可逆的, 倒置显微镜下见上皮细胞易与念珠菌靠近粘附, 而超微结构发生改变的念珠菌往往是与上皮细胞接触的细胞, 提示上皮细胞可能是通过与念珠菌细胞粘附发挥抗念珠菌作用的, 具体机制有待进一步研究。
雌激素可以增加VVC 的易感性, 对门诊就诊妇女的检查表明, 虽然口服避孕药组与对照组VVC 的患病率无差别, 但随着避孕药中雌激素含量的增加阴道念珠菌的检出率也增加4。此外, 雌激素促进念珠菌芽管生成, 增加念珠菌的毒力5, 对获得性细胞免疫有抑制作用6。本研究表明, 动情间期组和去势组阴道上皮细胞对念珠菌的抑制作用无统计学差异, 但雌激素处理组上皮细胞抗念珠菌作用却明显下调, 即雌激素抑制上皮细胞抗念珠菌的作用, 所以雌激素增加VVC 的易感性可能是通过多种途径实现的。
念珠菌是条件致病菌, 与阴道保护菌群及机体各种正常保护机制处于相对平衡的状态, 任何一种因素改变都有可能导致念珠菌感染。阴道上皮细胞和念珠菌之间可能有某种相互作用的机制, 可能正是阴道上皮细胞对念珠菌具有天然的抑制作用, 使念珠菌维持在非致病状态的酵母相而与机体共生, 当这种抑制作用降低使念珠菌由酵母相向菌丝相转换, 加上其它的内源和(或) 外源的易感因素, 引起内源性念珠菌感染。研究此抑制机制及雌激素的影响机制, 可为从微生态方面开发新的防治方法提供思路, 加强上皮细胞的天然抗念珠菌作用, 阻断携带者发展为有症状阴道炎的途径。418
阴道上皮细胞抑制念珠菌生长的机制尚不清
楚。人口腔和阴道上皮细胞在白色念珠菌刺激下可产生细胞因子和化学因子, 这可能会影响局部免疫反应7。上皮细胞还可产生不同的抗微生物肽如防御素、钙卫蛋白、富组蛋白等, 阴道上皮细胞是否通过上述机制抑制了白色念珠菌生长有待进一步研究。S zlnoky 8研究了人皮肤角化上皮细胞对白色念珠菌的作用并探讨其机理, 发现角化上皮细胞表面具有甘露糖受体, 认为可能此受体与念珠菌表面的甘露糖配体结合, 细胞发生粘附是发挥抗念珠菌作用的前提, 本实验发现与阴道上皮细胞相互靠近的白色念珠菌超微结构变化明显, 这与S zlnoky 的发现有相近之处, 今后可从上皮细胞和念珠菌细胞表面分子相互作用的方向进一步探讨其机制。
参 考 文 献
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(收稿日期 2004205208)
第一作者简介:牛战琴(1965-) , 女, 浙江大学医学院妇产科医院, 副主任医师, 在读博士生。主要研究方向:普通妇科。