中国农业科学

中国农业科学 2005,38(1):135-139 Scientia Agricultura Sinica

应用抑制差减杂交法分离粗枝大叶黄杨幼苗的

冷诱导表达基因

孙洪波，王国英，孙振元，古润泽，赵梁军

3

12341

（1中国农业大学观赏园艺与园林系，北京 100094；2中国农业大学农业生物技术国家重点实验室，北京 100094；

中国林业科学研究院花卉研究中心，北京 100091；4北京市园林科学研究所，北京 100102）

摘要：应用抑制差减杂交（suppression subtractive hybridization，SSH）方法，构建冷诱导表达的正向抑制差减cDNA文库，低温处理的幼苗为tester，常温处理为driver，通过cDNA宏阵列差异筛选cDNA文库，得到604个低温诱导或表达增强的候选克隆，对其中的84克隆进行DNA测序，去除冗余的cDNA，在GenBank中进行核酸和蛋白质同源性的比较和功能分析，共有36个单一序列，有 12 个cDNA未找到同源序列，可能为新基因，表明采用抑制差减杂交方法与cDNA宏阵列技术分离诱导表达的基因是可行的。

关键词：大叶黄杨；低温诱导；抑制差减杂交；cDNA宏阵列

Isolating Cold-Regulated Genes from Euonymus japonicus ‘Zhuzi’

Seedlings through Suppression Subtractive Hybridization

SUN Hong-bo1, WANG Guo-ying1, SUN Zhen-yuan2, GU Run-ze3, ZHAO Liang-jun1

（1Department of Ornamental Horticulture and Landscape Architecture ,China Agricultural University, Beijing 100094;

2

State Key Laboratory of Agrobiotechnology, China Agricultural University, Beijing 100094; 3Floriculture Research Center,

Chinese Academy of Forestry, Beijing 100091; 4Beijing Institute of Landscape and Gardening, Beijing 100102）

Abstract: Suppression subtractive hybridization (SSH) was utilized for the isolation of cDNA fragments for Euonymus

japonicus ‘Zhuzi’ differentially expressed genes, and forward suppression subtractive cDNA Library of cold-regulated gene was constructed. The seedlings of Euonymus japonicus ‘Zhuzi’ were treated with low temperature as tester and untreated seedlings as driver. Subtractive cDNA Library was differently screened through cDNA macroarray, six hundreds and four cDNA clones were identified as cold specifically induced or highly expressed. After sequencing of 84 cDNA clones and removing redundant cDNAs, 36 cold-regulated unique cDNA clones were obtained. The results showed that 12 cDNA clones are expected to be novel genes, because no sequence homology with any known sequences was found in GenBank databases. This indicated that it is possible to use SSH and cDNA macroarray in the isolation of cold-regulated genes.

Key words: Euonymus japonicus ‘Zhuzi’；Cold-induced gene; Suppression subtractive hybridization (SSH); cDNA

macroarray

在寒冷地区，大多数常绿性植物不耐低温而不能用于冷地园林，使冬季缺乏绿色。即使在暖地，也存在低温影响园林植物多样性的问题。

自然界中，多数植物能积极协调自身的生理活动以适应环境温度的变化，植物在特定的低温诱导下抗寒力得以表现的过程，被称为冷驯化或抗寒锻炼。1970年，Weiser首先提出冷驯化需要一系列基因的激活，

而这些基因在非驯化环境即正常环境下不表达的假说。这一假说首次在菠菜上得以证实[1]，结果表明，5℃低温处理菠菜叶一段时间，可诱导表达新转录的mRNA。此后，许多冷诱导基因相继从单子叶和双子叶植物中分离出来。

植物对低温的适应能力差异很大，通常传统育种方法难以使某种植物的抗冻性得到明显提高。迄今为

———————

收稿日期：2004-03-29

基金项目：北京市科委“抗旱、耐寒转基因地被植物的培育”资助项目（H[1**********]0）

作者简介：孙洪波（1972-）,女,山东泰安人,博士,主要从事抗寒园林植物育种研究。E-mail: [email protected]。赵梁军为通讯作者,

Tel:010-62893315; Fax:010-62893603; [email protected]

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止，仍不明确植物耐寒性差异的本质，也不能确切回答冷驯化所诱导的抗寒基因是否高度保守。因此，分离植物抗寒性的关键基因，有利于揭示植物适应低温的机理，可望通过基因工程方法来提高植物的耐寒性。这在农业上具有扩大作物经济栽培区域，降低设施栽培成本的作用；在环境建设上具有增加寒冷地区植物多样性，丰富园林景观的实用价值。因此，本研究以原产日本北海道，可耐-23.9℃低温的粗枝大叶黄杨(Euonymus japonicus ‘Zhuzi’)为试材，探讨粗枝大叶黄杨冷诱导相关基因片段的表达，为克隆抗寒基因并通过基因工程改良园林植物的抗寒性打下基础。

1 材料与方法

1.1 材料培养

剪取粗枝大叶黄杨当年生健壮枝条作插条，扦插于高12.5 cm，直径18 cm的营养钵中，培养介质为草炭∶珍珠岩=3:1,在20℃～25℃、光强750 µmol·m-2·s-1

、光周期16 h/8 h条件下培养3～4月，当扦插苗株高达25～30 cm时用于试验。 1.2 材料处理

将幼苗分为3组，每组8盆，每盆1株。第1组为对照，培养条件同1.1，第2、3组为低温处理，在2℃培养箱中分别处理6 h和24 h，光照采用荧光灯，光照强度为250 µmol·m-2·s-1。

处理完毕后及时剪取各组幼苗顶端1/3的叶片，用液氮迅速冷冻后，于-80℃冰箱中保存。

1.3 总RNA的提取和mRNA的纯化

总RNA的提取采用热酚法[2]；用QIAGEN的Oligotex mRNA Mini Kits（Cat. No 70022）从总RNA中分离mRNA。 1.4 抑制扣除杂交

应用Clontech的PCR-SelectTM cDNA Subtraction Kits获得差异条带。

1.5 构建差减文库（T/A克隆法）

取正向差减杂交cDNA片段的第2次PCR产物3 µl（25 µl的体系）,连接到Promega的pGEM－T EASy载体上，4℃过夜。第2天，取连接产物5 µl（10 µl的体系）转化到感受态DH5α上，在涂有IPTG/X-gal 的含AMP的LB平板上、37℃避光恒温培养12～16 h，出现大量、小白斑后放于4℃冰箱使菌落显色，从平板上

挑取白色克隆（重组子），点种于含amp(50

µg·mL-1）的LB液体培养基的96孔板中，37℃摇床培养过夜，建立抑制差减cDNA文库。 1.6 差异筛选差减文库

取构建抑制差减cDNA文库的重组子1 µl菌液进行PCR扩增（25 µl的体系），2.0%琼脂糖凝胶电泳检测。取PCR产物1 µl点4套重复的cDNA拷贝膜。

用生物素标记4个不同探针，即正向差减cDNA片段、正向未差减cDNA片段、反向差减cDNA片段和反向未差减cDNA片段的第2次PCR产物，再用4个探针分别与抑制差减cDNA文库的4套重复拷贝膜点杂交，杂交和洗膜均按照Amersham Pharmacia Biotech公司的direct nucleic acid labeling and detection systems RPN 3000的说明书进行。杂交结果分析和差异筛选克隆分类，依照Clontech公司的 PCR-Select Differential Screening Kit 说明书进行。 1.7 DNA测序

选取差异表达的重组克隆，由联合基因科技有限公司采用自动测序法测序，用BLAST软件在GenBank进行核酸和蛋白质同源性的比较和功能分析。

2 结果与分析

2.1 总RNA和mRNA的检测

用Pharmacia公司的紫外分光光度仪Ultrospec Ⅲ测定总RNA在260 nm和280 nm的吸光度值，OD260/OD280的比值为1.8～2.0，

表明总RNA纯度较高。用琼脂糖凝胶电泳法检测总RNA的完整性，28S条带的亮度约为18S条带的2倍，表明RNA的完整性良好，可用于后续试验。mRNA完整性和大小也通过琼脂糖凝胶电泳检测，呈现弥散条带，表明纯化效果良好，可用于cDNA合成。

2.2 抑制差减杂交的第2次PCR产物分析

抑制差减杂交后，取第2次PCR产物8 µl，用2.0%琼脂糖电泳分析差减杂交是否成功。从图1可知正、反向未差减的cDNA为0.2～2 kb的弥散条带（smear），且有数条清晰条带，而差减后的cDNA弥散条带为0.2～0.7 kb，表明差减杂交后tester和driver的一些共有cDNA片段已被扣除掉。

2.3 差减cDNA文库的构建及阳性克隆的筛选

应用T/A克隆法，共挑取约960个白色克隆，随机挑选构建差减文库的重组子进行PCR扩增(图2)，

扩增条带即为插入的cDNA片段。每泳道只有1条带，

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M. 100 bp DNA ladder plus; 1. 正向差减杂交后的第二次PCR产物；2. 正向未差减杂交后的第2次PCR产物；3. 反向差减杂交后的第2次PCR产物；4. 反向未差减杂交后的第2次PCR产物

M. 100 bp DNA ladder plus; 1. secondary subtractive product after forward subtraction；2. secondary un-subtractive product after forward subtraction； 3. secondary subtractive product after reverse subtraction；4. secondary un-subtractive product after reverse subtraction.

图1 抑制差减杂交后的第2次PCR产物分析 Fig. 1 Analysis of second PCR product after SSH

M.100 bp DNA ladder plus; 1～9.随机挑取的克隆 M. 100bp ladder marker；1-9. random picked clones

图2 差减cDNA文库外源插入片段的的检测

Fig.2 Identification of foreign inserted fragments of the

subtracted cDNA Library

且集中于0.2～0.7 kb,极个别片段大于1 kb，说明连接、转化效果较好。

采用随机引物法生物素标记4个探针(A为正向差减探针，B为反向差减探针，C为正向未差减探针，D为反向未差减探针)分别与4套cDNA拷贝膜杂交（图3），共有以下4种情形：（1）与正向差减和未差减的探针有杂交信号，但与反向差减和未差减的探

针不能杂交(如4套cDNA拷贝膜的B12)，共183个克隆。其中95%的克隆可能是差异表达的基因；（2）只与正向差减探针杂交，与其它探针均无杂交信号（如4套cDNA拷贝膜的G11），这是差异表达基因的强力候选者，是很典型的低丰度表达而在差减时得到大量富集的基因，共61个克隆；（3）与正向、反向的差减探针均杂交，但与正向差减探针的杂交信号强，信号强度高于5倍的才有可能是差异表达的基因（如4套cDNA拷贝膜的C12），共选取360个克隆；（4）与4个探针均有杂交信号，且强度没有明显区别，或

与4个探针均无杂交信号（如4套cDNA拷贝膜的B7），这些克隆是非差异表达的基因，共有356个克隆。差异筛选后，共得到604个低温诱导或表达增强的候选克隆，对其中的84个克隆进行了DNA测序。 2.4 差异克隆的cDNA测序分析

将DNA测序结果去除载体和不明确序列及冗余的cDNA后，共得到36个单一序列，应用BLAST软件在GenBank中进行核酸和蛋白质同源性的比较和功能分析。结果发现，24个克隆与其它物种已知基因部分区域的同源性为43%～98%，12个克隆在GenBank中没有查到对应的同源序列，可能是新基因或者由于序列位于变异丰富的3′末端而无法查到与其它物种基因的同源性。序列同源性分析结果表明，试验分离到的大部分克隆与冷诱导表达的基因有关。部分克隆及同源基因可能编码的蛋白质见表1。

3 讨论

按照Bevan等[3]的植物基因功能分类标准，将测序基因片段的BLAST比较结果分为以下6类：

（1）胁迫与防御相关基因 EJ40的同源序列为非特异性脂转移蛋白（ns-LTPs），真菌感染、干旱、NaCl和温度变化 [4]都可诱导其表达。EJ2的同源序列为MLP-like protein 34，EJ175为花粉过敏原蛋白（pollen allergen-like protein），二者同属于Bet v I 过敏原家族，这一家族的蛋白还可为病原体、机械伤害、ABA等诱导表达。这说明植物适应各种胁迫时可能存在共同的机制。

有报道细胞保护机制的激活可能伴随细胞的防御反应，这些机制可减少氧化胁迫的伤害。EJ87的同源序列编码谷氧还蛋白，其在氧化还原平衡中发挥重要作用[5]。

（2）细胞结构基因 低温对细胞膜体系的损伤是

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A.正向差减探针； B.反向差减探针；C.正向未差减探针；D.反向未差减探针

A.forward- subtracted cDNA probes; B. reverse- subtracted cDNA probes; C. forward- unsubtracted cDNA probes; D. reverse- unsubtracted cDNA probes

图3 差减cDNA文库的差异筛选

Fig. 3 Differential screening for the subtracted cDNA Library

表1 粗枝大叶黄杨低温诱导表达的基因及在GenBank中同源性的比较结果

Table 1 Cold-induced gene from Euonymus japonicus ‘Zhuzi’ and results of BLAST search in GenBank

基因 编号 Clone number EJ16

片段大小 Size of fragment (bp) 590

同源基因的物种 Category of DNA homology

同源基因片段编码的蛋白

Gene product of DNA homology

Oxygen-evolving enhancer protein 3 (OEE3) Nonspecific lipid transfer protein 1

同源基因在

GenBank的序列号 Accession number P12301

同源性 Identities (aa/aa)

84/173(48%)

E-value 6e-29

Spinacia oleracea Vitis berlandieri ×

EJ40 500

Vitis vinifera

EJ85 194 Manihot esculenta EJ87 428 EJ90 416 EJ111 539 EJ123 395 EJ128 340

EJ130 352 EJ131 387 EJ136 241 EJ140 327

EJ143 353 EJ152 293 EJ153 467 EJ155 455 EJ175 603

EJ178 479 EJ185 379 EJ192 425 Q850K8 64/114(56%) 2e-33 Q9TLH3 50/59(84%) 8e-25 Q945T3 78/103 (75%) 2e-41

Q8LB81 84/131(64%) 5e-48 Q8H065 117/119(98%)1e-63 Q9ZVA4 32/59(54%) 4e-16 Q9XQB1 66/74(89%) 7e-32 Q9LKY8 32/48(66%) 9e-13 Q40281 108/122(88%)1e-58 Q9ZIC0 17/21(80%) 0.006 Q9STM6 60/95(63%) 9e-32 Q84LP6 92/107(85%) 2e-46 AAP59429 63/90(70%) 1e-32 Q8VZB9 101/112(90%)2e-53 O48657 133/139(95%)8e-75 Q8L9L8 85/151(56%) 5e-47 Q8VX73 100/124(80%)3e-54 Q8L9I4 25/57(43%) 0.003 Q9LEJ0 114/11(95%) 9e-60

Ribulose 1,5-bisphosphate carboxylase, small subunit

(Rubisco-SSU)

Tilia platyphyllos Glutaredoxin

Arabidopsis thaliana Putative GDSL-motif lipase/acylhydrolase Oryza sativa Hypothetical protein

Arabidopsis thaliana F9K20.10 protein(Strong similarity to glycoprotein) Phaseolus aureus LHCII type III chlorophyll a/b binding protein Glycine max Proline-rich proteins（PRPs） Malus domestica Ribulose bisphosphate carboxylase/oxygen（RuBisCO）Vibrio fischeri Glyceraldehyde phosphate dehydrogenase Arabidopsis thaliana Lipase-like protein Zea mays NADP-malic enzyme（NADP－ME） Arabidopsis thaliana Putative alcohol dehydrogenase Arabidopsis thaliana 60S ribosomal protein L10a-1 Fagus crenata Chlorophyll a/b-binding protein Arabidopsis thaliana Pollen allergen-like protein Ricinus communis Cyclophilin Arabidopsis thaliana Hypothetical protein Hevea brasiliensis Enolase 1

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造成植物寒害的根本原因[6]。冬小麦2℃冷驯化7 d后，检测其分蘖节处发现植株抗寒性的提高与细胞壁植物凝集素（糖蛋白）活力的提高呈正相关 [7]；生物膜的一种结构蛋白为富含脯氨酸的蛋白（proline-rich proteins－PRPs）,可为盐胁迫和低温[8]等多种胁迫诱导表达，推测PRPs可能在细胞壁和细胞膜间形成牢固的联系以维持细胞的完整性。EJ123的同源序列编码的蛋白为F9K20.10 protein，属于植物凝集素家族；EJ130的同源序列编码的蛋白为PRPs。

（3）蛋白质合成基因 在逆境胁迫下，植物可以合成一些新蛋白来适应环境。EJ153的同源序列为60S核糖体蛋白L10a-1，可能在蛋白质合成中发挥作用

（4）蛋白质的修饰、加工和储藏基因 低温等多种胁迫因子均可诱导亲环蛋白的表达[9]，

EJ178的同源序列为亲环蛋白（亲环素），推测其可能在信号转导、促进逆境中新合成蛋白的折叠和加工中发挥作用[10]。

（5）初级代谢基因及能量代谢基因 在冷驯化过程中，细胞的碳代谢发生适应性的变化：植物经过冷驯化后，通常能保持一定的光合作用水平。Huner等（1982）指出核酮糖二磷酸羧化酶－加氧酶的低温适应性变化以低温稳定性、高效性为重要特征。EJ131、EJ85、EJ155和EJ16，其同源序列分别编码核酮糖二磷酸羧化酶-加氧酶、核酮糖二磷酸羧化酶的一个小亚基、叶绿素a/b结合蛋白和放氧提高蛋白3（oxygen-evolving enhancer protein 3）；糖酵解途径中的关键酶与植物的抗逆性有着密切的关系。EJ192和EJ136的同源序列分别为糖酵解途径的烯醇酶基因和甘油醛磷酸脱氢酶基因。

（6）功能未确定基因 本试验克隆到的EJ111、EJ185为功能未知基因，有12个克隆在GenBank中没有对应的序列，说明可能还有一些潜在的基因对提高植物的抗寒性有作用。

4 结论

本研究克隆到的冷诱导基因，其是否对抗寒性的提高起关键作用，尚无法确定。目前，笔者正在建立低温诱导表达基因的表达谱，同时构建载体进行转基因试验，验证其是否有助于抗寒性的提高。

本研究通过抑制差减杂交，选择性地扩增差异表达基因，克服了用其它差减杂交方法难以获得低丰度表达基因的问题；同时采取抑制差减杂交和cDNA宏

阵列差异筛选相结合的方法，极大地降低了假阳性的出现，表明采用抑制差减杂交方法与cDNA宏阵列技术分离诱导表达基因是可行的。

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(责任编辑 曲来娥)